人ES细胞培养条件无法保持小鼠外胚层状态

摘要

小鼠胚胎干细胞(mESCs)和小鼠外胚层干细胞(mEpiSCs)分别来源于胚胎植入前3.5天(E3.5天)和胚胎植入后5.5 ~ 7.5天胚胎的内细胞团(ICM)，是一种多能干细胞(PSCs)。根据它们所处的环境，PSCs可以存在于所谓的naïve (ESCs)或primed (EpiSCs)状态。暴露于EpiSC或人ESC (hESC)培养条件可使mesc向EpiSC样状态转变。在这里，我们发现，当将mesc暴露于hESC或EpiSC培养条件下时，未分化的外胚层状态并没有持续稳定下来。相反，长时间暴露在EpiSC条件下促进了向原始条纹(PS-)样状态的过渡，通过一个无偏置的外胚样中间体。我们发现，brachyury阳性ps样状态可能是由内源性WNT信号促进的，这突出了小鼠表胚样干细胞和人类胚胎干细胞之间可能的物种差异。

1.介绍

多能性是指发育中的胚胎中胚胎细胞内在的、不受限制的、灵活的发育潜力，能产生三个胚胎胚层，最终形成一个成年有机体中的所有细胞。这是可以捕捉到的在体外通过从不同的发育阶段获得多能干细胞(PSCs)。PSCs来源于着床前小鼠胚胎(E3.75-E4.5)的外胚层，称为胚胎干细胞(ESCs) [1- - - - - -3.］．通过使用维持自我更新的白血病抑制因子(LIF)， mesc可以达到所谓的ground/naïve多能性状态[4，5]，配合ERK抑制[2]及GSK3 [6]同时抑制分化(LIF/2i培养基)[7］．从移植后胚胎(E5.5-E7.5)中获得的PSCs被称为外胚层干细胞(EpiSCs)，处于多能性的启动状态[1，8］．小鼠epcs和人ESCs (hESCs)常规培养在激活素A和FGF2 (AA/F2)中。当mesc暴露于hESC/EpiSC条件(AA/F2)时，它们转变为类似EpiSC的启动态[1，8- - - - - -11.］．

在原肠形成过程中，发育中的小鼠胚胎中的多能外胚层细胞经历上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并通过原始条纹(primitive streak, PS)迁移，形成中胚层细胞，中胚层和内胚层的共同前体[12.］．不通过PS迁移的表集细胞形成神经外胚层。在这种重新排列过程中起着几个信令途径起到关键的角色，例如TGFβ/苯丙酸诺龙/节点,WNT /β-catenin和FGF/ERK/MAPK信号通路[13.- - - - - -15.］．各种转录因子之间的协作相互作用，例如T型转录因子（TBX）T和eomes，具有中胚层和内胚层的关键标志物引发这种分化过程[16.- - - - - -18.］．

目前，正在发现一系列多能国家[19.，20.]，尽管epcs共享许多属性[21.]保护他们的多能性，它们具有独特的功能和分子特性，使它们分开[22.，23.］．这种差异可能反映了外表细胞基于其在发育胚胎中的时空位置及其环境进行的转化，限制了它们对某些谱系的发育潜力。在目前已知的外在培养条件下，EPISC可以发生在异质亚稳态状态中，具有可变分化势的情况[24.，25.］．

标准的hESC培养条件已适应于支持mEpiSCs(激活素A和FGF2 (AA/F2)) [1，8- - - - - -11.]，同样可以将处于基态/naïve多能态的mesc转化为启动的类epc状态。本研究旨在了解在标准hESC/EpiSC条件下，多能性从naïve状态向启动状态的转变。在这项研究中，我们发现，虽然这种条件使mesc成熟到不同的启动epc样状态，但这些状态不能持续，但细胞进一步成熟到PS/中胚层样状态，突出了小鼠和人类表观母细胞样干细胞可能的物种差异。这也突出了对保存小鼠epcs独特多能性状态的额外因素的需求，而与此相反的是，hESCs可以提高我们将它们高比例地分化成任何所需细胞类型的能力。

2.材料和方法

２.１.小鼠ESC行

实验使用来自C57BL/6N背景的小鼠胚胎干细胞(mESCs)进行，并有Brachyury (T)和Sox2的荧光报告[26.］．含有小鼠基因组部分的小鼠细菌人工染色体（BAC），其包含特定基因的轨迹（BACS RP24-530D23（T）和RP23-249015（SOX2）的C57BL / 6小鼠基因组周围的C57BL / 6小鼠基因组相应的基因座），通过Red / Et重组（Genebridges）[27.］．很快，T或Sox2的起始密码子(ATG)被mCherry或Venus编码序列取代，接着是兔b-珠蛋白聚腺苷酸化信号和一个由Pgk启动子驱动的frt位点侧链湿霉素选择盒。5 mg的改良BAC用限制性内切酶PI-SceI (NEB)线性化并电孔 ESCs。在含潮霉素(150 mg/ml)的ES细胞培养基中选择克隆，扩增，PCR检测BAC整合。详情请参阅[26.］．

2.2。细胞培养和分化

按照标准条件培养ESCs和epcs [24.］．为了进行naïve转化，无需喂食的mesc被播种在纤连蛋白- (3- 5ng /ml) (Merck-Millipore;Calbiochem)在含LIF的N2B27介质中的涂膜，PD0325901 (1μ.M) (Axon Medchem, Axon 1408)和CHIR99021 (GSK3β抑制剂）（3 μ.M) (Axon Medchem, Axon 1386) (2i medium) [7］．第二天，用2i培养液灌洗细胞。观察到小的球形菌落后，将培养基改为添加激活素A (20 ng/ml)和FGF2 (10 ng/ml)的N2B27培养基(AA/F2)。AA/F2处理持续6 d，每天用新鲜AA/F2培养液替换培养液。

２.３.全转录组数据分析

用80 ng总RNA进行RNA测序。经量化及质素评估后(详情载于[24.)， RNA-seq文库由总RNA制备，使用ScriptSeq Complete Kit (Human/Mouse/Rat) -Low Input (SCL24H) (Illumina)，根据制造商说明。最终，测序文库在Illumina HiSeq 2000上按照标准协议进行了2350个周期(配对端)的测序。使用TopHat (version 2.0.11)将RNA-seq测序reads映射到小鼠基因组(mm10) [28.］．然后使用Cuffdiff来计算所有样本中基因的标准化FPKM(每千碱基/百万映射读的片段)值[29.］．将所有样本中FPKM值小于1的基因剔除，过滤后的结果用于进一步分析(R统计程序)(http://www.r-project.org.）.RNA-seq数据已存入ArrayExpress数据库(E-MTAB-3784)。

２.４.实时聚合酶链反应分析

使用RNeasy Micro and Mini Kits (Qiagen)分离总RNA，然后使用NanoDrop (Life Technologies)(未分类细胞)或Qubit荧光仪(Invitrogen)(已分类细胞)进行定量。未分选的细胞在细胞培养孔中直接用RLT缓冲液裂解，用PBS冲洗一次。脱氧核糖核酸酶I的额外步骤(罗氏，巴塞尔，瑞士，https://www.roche-applied-science.com.)进行了处理，以避免基因组DNA污染。RNA用分光光度计从NanoDrop Technologies(未分类细胞)或Qubit (Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，http://www.invitrogen.com) (FACS-sorted细胞)。采用M-MLV逆转录酶(Promega)和Oligo-dT引物(Invitrogen)进行逆转录(表S3）.定量逆转录酶PCR (qRT-PCR)使用GoTaq qPCR Master Mix (Promega)，在StepOnePlus Real-Time PCR系统(Life Technologies, Rockville, MD，https://www.lifetech.com）.数据分析使用ΔΔCt法，加上管家基因，Pmm2和Gapdh和/或ACTB.正常化。

2．5．荧光激活细胞分选

用磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻冲洗细胞，用冰冷胰蛋白酶分离细胞。在冷敲除DMEM-F12中和中，细胞快速(30秒)高速旋转(10,000 rpm)，在冷敲除DMEM-F12中重悬并立即放置在冰上。这些细胞随后在FACS Aria II上进行了分类(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ，https://www.bd.com.）直接进入含有的RLT缓冲区β- 使用rneasy micro kit（Qiagen，Hilden，德国，http://www1.qiagen.com）并进一步加工。

2.6。免疫印迹和免疫细胞化学

遵循这些分析的标准程序（[24.]）用合适的抗体（表S4）.在免疫印迹和免疫细胞化学之前，先用PBS冲洗细胞。

免疫印迹时，加入裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(PhosStop, phosphatase inhibitor cocktail Easypack, Roche))后，将细胞剥去并进一步裂解，置于冰上，以保持蛋白的磷酸化状态。使用基于java的图像分析软件包ImageJ对Western blot数据进行量化。H3和Actb为对照。

免疫细胞化学方面，单层培养细胞用PBS洗涤，用4%多聚甲醛固定。渗透后进行一、二抗体染色。使用共聚焦显微镜(LSM510 Meta, Zeiss)进行可视化，并使用AxionVision (Zeiss)软件进行进一步分析。

3.结果

３.１.人类ESC/EpiSC培养条件导致Naïve ESC具有明显的EpiSC样状态

LIF / 2I（LIF，PD0325901（MEK抑制剂）和CHIR99021（GSK3β抑制剂））在定义的条件下，可以将MESCS保持在其天真的多能性状态[4，5，7]和AA/F2(激活素A和FGF2)可将其转化为类似启动物的状态[1，8，10.］．进行了3天的时间过程分析，以了解多能性状态的转变(图)1(一)）.在LIF/2i培养液中，观察到naïve ESCs的圆形、圆顶状菌落特征。AA/F2暴露后，mesc逐渐失去圆顶形态，呈扁平菌落生长。Rex1的表达式是基态的标志之一[30.］．在10月份/ SOx2 / Nanog中，Holipotency的获取和维护需要定义为核心多能因子的Oct4和Sox2。31]，而Nanog仅用于多能性的获取[32，33］．AA / F2处理导致表达的减少Rex1和Nanog从第一天开始年代Ox2从第2天开始仍保留表达10.［31，34，35]直到3天，显示治疗过程中细胞的发育进展（图2(一个)，2 (b)，2 (e),2（f），S1、表S1）.虽然纳米表达仅限于鼻塞表达，但在内部细胞质量（ICM）的所有细胞中，Oct4和Sox2在森拉和胚泡中普遍地表达，直至Hopobrast偏析[36］．整个转录组数据显示，下调幼稚特异性基因，并在治疗过程中诱导引物基因（图2(一个)和2 (b)、表S1）.然而，PCA和分层聚类表明AA / F2-2D和AA / F2-3D细胞不仅彼此不同，而且来自Naïveescs和episcs（图1 (b)- - - - - -1（d），S1、表S1）.这是一个多能态光谱被发现的时代[19.，20.]，并且MEPISS可以衍生自E7.5至E7.5胚胎，其在几种分子特征中相似[21.]，某些基因的表达状态也可能不同[22.］．我们的结果表明，由Naïveeasc的暴露于AA / F2的突出的Episc样状态彼此不同，并且来自本研究中使用的EPISC。这里使用的EPISC来自早期的后期后期E5.5小鼠胚胎[9］．

3.2。人类ESC / EPISC培养条件将ESC进一步达到原始条纹（PS样）状态

多能源基因的变化三天恰逢诱导T，加工,Fgf8，这些基因在PS中表达(图2(一个)- - - - - -2 (e)、表S1）.在蛋白质水平，T的诱导低，这可能归因于转录和翻译之间可能的延迟。此时（AA / F2-3D），无明显诱导任何谱系特异性标记物，中胚层（FOXF1，GATA6，OSR1，TBX6和MSGN1），内胚层（SOX17），神经分区（PAX6和SOX1），或原始内胚层（SOX7）已经发生（图2 (c)、表S1）.来源于晚期胚胎(E7.5)的EpiSCs降低了神经诱导电位并表达T和OCT4 [22.］．因此，AA/F2处理3天使ESCs从naïve多能性成熟到更成熟的启动epc样状态。

使用AA / F2定期维护EPISC [1］．为了了解这种情况是否会维持epc样细胞的转化，AA/F2处理持续6天。这导致了核心多能性因子的下调，10.，SOX2.,Nanog（图2 (b)，2 (d),2 (e)、表S1）和PS基因的显着诱导，Fgf8和T（图2 (c)- - - - - -2 (e)）.虽然EPISC培养条件将Naïve培养条件达到底漆状状态，但这种条件的连续暴露六天将这些细胞转化为PS样或介质胚芽形状的状态。

3.3。上皮 - 间充质转换发生在成熟到PS样状态期间

上皮-间充质转化(EMT)和多能外胚层细胞通过PS的迁移促进了中胚层和内胚层祖细胞的形成[12.］．EMT和PS诱导需要短距离(T) [37，38]，并由FGF和WNT信号之间的协同串扰刺激[24.，39］．β-Catenin通过促进Smad2 / 3活性来调节PS诱导[39，40］．通过6天的AA/F2暴露，T、Eomes和Fgf8高度诱导(图2 (c)- - - - - -2 (e))，当SMAD2被磷酸化时β-catenin磷酸化抑制（图3(一个)，S2A.)，反映TGF的活性状态β/激活素/节点和典型的WNT信号通路。这与上皮标记物E-cadherin (CDH1)的适度下调相一致(图)3 (b)和3 (c)，S2D.）.我们还发现AA/F2-6D细胞中AKT和总ERK的诱导率更高(图)S2B-S2C）.外胚层的上皮细胞表达CDH1，而CDH1在PS形成过程中受到抑制，进而诱导EMT [41］．总的来说，EpiSC持续6天促进了EMT，这是PS形成过程中发生的一个关键过程。

3．4．持续暴露于hESC/EpiSC条件将PSCs引向后中胚层和内胚层谱系

在早期发育中，心脏中胚层和内胚层起源于前胚层，而体细胞和胚外中胚层起源于后胚层[42，43］．AA/F2处理6 d后，内胚层(Sox17和Sox17)表达上调Gata6)和后中胚层标记物(Tbx6和Msgn1)(图4（a）和4（b），S3）反映在混合细胞群体上。在外表中，虽然高敏素/节点信号传导支持内胚层分化[18.，44), WNT /β-catenin支持后PS基因[45］．这些途径都是AA / F2-6D细胞中的活性（图3(一个)），在这个阶段，T很高表示（数字2 (c)- - - - - -2 (e))，有相当数量的细胞表达T(图4（c））.然而，神经元(Sox2，Pax6,SOX1.），侧面胚芽（FoxF1.）和中间体胚芽（osr1.)(图4（a）)基因在当时没有明显的表达。EpiSCs内源性WNT信号诱导多能性丧失，t阳性细胞比例增加，分化倾向最终内胚层[46］．分析分类T-阳性细胞显示它们表达外胚层(Fgf5），后胚层（Fgf8，T，Msgn1,TBX6.）和内胚层（Foxa2和Sox17)标记(图4 (d)）.多能性标记,Nanog和SOX2.表达下调。相反，大多数处于epc样状态的AA/F2-3D细胞表达SOX2.没有T-阳性细胞在其中。这强调了EpiSCs早期传代的重要性，这可能能够避免它们进一步向PS/中胚层样状态成熟，以建立稳定的细胞系。这些观察总结出，连续的AA/F2处理导致naïve PSCs进入启动epc样状态，接着是PS-或中胚层样状态，支持内胚层和后中胚层谱系(图)4 (e)）.

4。讨论

在胚胎发育过程中，外胚层细胞发生了一些系统的多能性变化，其中一部分可以被模仿在体外．使用LIF可以与ERK和GSK3的抑制剂一起带到鼠标ESC达到地/天真的多能性状态。7]（2i培养基）。标准HESC培养条件适于支持MPISCS（Activin A和FGF2（AA / F2）），并且相同的可以将MESCS转换为PromoCity的地面/天真状态，以追加初步的Episc样状态[1，8- - - - - -11.］．目前的研究表明，MESCS在AA / F2的地下状态下暴露于AA / F2的不同之处过渡它们，通过明显的映射形状的EPISC状态转变它们，并且这种情况的长时间暴露使它们导致含有活性WNT和Activin的PS样状态/ Nodal信号和表达T，eomes，后胚层和内胚层标记物（图4 (e)）.他们没有表达神经元标记。

T和Eomes一起促进后胚层和内胚层标记的上调[18.，47]由FGF诱导，WNT /β连环蛋白、苯丙酸诺龙/节点/ TGFβ信号传导，对多能性和神经标志物有负面影响[9，18.］．此外，HESC培养条件下的EPISC中的内源性WNT信号传导，导致多能性和WNT抑制的丧失，可以防止这种情况，反映了小鼠和​​人类培养条件的特异性特异性差异[46，48- - - - - -50］．虽然HESC / EPISC条件（AA / F2）成熟到映射状态，但我们表明这些态不能持续，但与较高的WNT信号传导有效的PS / MesendoDerm的状态进一步成熟的细胞相比，细胞进一步成熟。中间体EPISC样状态（AA / F2-2D和AA / F2-3D）。这突出了诸如WNT抑制剂等额外因素的要求，以保存鼠标EPISC的灌注多能态，与人体ESC的要求相反[46，48- - - - - -50］．

虽然AA / F2处理的细胞通过2和3天的诱导显示底漆的特征，但它们彼此不同，并且还来自从早期后后期阶段（E5.5）衍生的EPISC [9］．除了多能性基因外，为期3天AA / F2-成熟的Episc样细胞（10.，SOX2.，和纳米），也表达了T，加工,GSC。这些特征类似于EpiSCs的特征，EpiSCs来自于表达T [22.］．EpiSCs可以从不同胚胎阶段(E5.5-E7.5)的小鼠移植后胚胎中获得，尽管它们在几个启动状态特征上相似[21.]，也彼此不同[22.］．来自最近的研究的新兴理论是，在外部细胞中的多能或祖细胞中，可能存在具有特异性分子鉴定的各种分子状态。具有不同分化能力的这种异质群体群体群体可取决于赋予其多能或多能物质的略微不同的外本培养条件[51]，其中大部分信息仍未定义。例如，AA/F2的不同持续时间导致ESCs进入不同的多能状态，产生不同比例的体前中胚层细胞[24.］．多能性的naïve和primed状态是目前人类和小鼠体内唯一定义明确的可互换和可维持在定义状态下的状态在体外状况。这在体外用于维持ESCs的条件可以在很大程度上影响培养中的基因表达状态和细胞群[52，53］．不同的epcs群体，不同于ESCs，是可互换的在体外，如Brachyury或Oct4正或负，可以共存，借此10.+ ve细胞仍然可以保留嵌合体形成能力[54，55]，这表明他们是全能的。虽然已经尝试捕捉全能性在体外［56，57]，维持这种状态的确切条件仍是未知的[58］．在目前已知的外在培养条件下，可能是，EPISC可以在异质亚稳态中发生，具有可变分化潜力[24.，25.]，甚至到Insterembryonic谱系，如脱蛋白[1，8，59- - - - - -62.];［63.- - - - - -66.］．仅仅通过对信号通路的操纵，就可以很容易地保存或转换不同的状态。发现3i:(PD184353, PD173074/SU5402，和CHIR99021)和后来的2i (CHIR99021)抑制GSK3β奥斯汀史密斯及其同事（ying等人）抑制MEK1 / 2）媒体（ying等人，2008）增加了非智能小鼠和大鼠菌株的ESC衍生效率，例如CBA，NOD和DBA，从低或不存在于50-70％［67.- - - - - -73.］．因此，探索在培养中维持特定的全能性或多能性状态的可能性，不仅可以进一步提高ESC衍生菌株的效率和嵌合形成能力，而且有助于胎盘和早期胚胎发育的研究。对维持一种特殊的全能性或多能性状态所需的特定因素进行更多的研究，可以提高我们将它们以更高比例更有效地分化为任何所需细胞类型的能力，以及我们对哺乳动物胚胎发育的理解。这一研究和进一步的研究对于理解胚胎发生早期模式的分子机制至关重要，此外，还将确保获得关于全能性、多能性、并分化为科学目的的祖细胞，以及再生医学，从而相关的干细胞为基础的治疗。

数据可用性

在合理的要求下，可以从通讯作者处获得支持本研究结果的数据。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

地检，a.m.和sms。对调查和验证有贡献。地检，a.m.， s.s.， R.B，和sms。参与形式分析。SM.S。F.K.(生成了记者细胞株)对资源做出了贡献。D.A.S. SM.S。写了初稿。a.m.， F.K, R.B，和sm。撰写审核和编辑。 SM.S. contributed to the conceptualization, methodology, supervision, project administration, and funding acquisition. Devika AS and Anna Montebaur contributed equally to this work.

致谢

我们感谢Bernhard教授。G. Herrmann为他的批判性评论和支持。我们感谢Boris Greber博士他的批判性评论和Episc的慷慨礼物。SM.S。认识到德国Max Planck Society，德国，科学和技术部（DST），印度（ECR / 2017/001216），生物技术（DBT），印度（BT / PR29717 / PFN / 20/1361/2018），印度医学研究委员会（ICMR），印度（2019-3008 / SCR / Adhoc-BMS），和喀拉拉邦科学，技术和环境（KSCSTE），印度。

补充材料

图S1:人类ESC/EpiSC培养条件导致naïve ESC具有不同的EpiSC样状态。(a)所示样本的层次聚类。分级聚类结果表明，AA/ f2处理的细胞与epcs(早期胚胎E5.5小鼠胚胎)和ESCs都不同。图S2:上皮-间充质转化发生在成熟到ps样状态的过程中。(a) Western blot分析(图中Western blot图像的量化3(一个))的指示蛋白的指示样品。图中为AA/F2-6D中所示蛋白相对于AA/F2-3D中的表达量。激活素/节点(pSMAD2)和WNT(活性β-连环蛋白(-catenin)信号在AA/F2处理6天时高度活跃，而在3天时则相反。(罪犯)。Western blot分析AA/F2处理细胞的指示蛋白。Actb作为对照。6d后AKT和ERK总表达增加。CDH1的表达略有下降。Actb和H3(图3 (b))作为控制项。图S3:持续暴露在hESC/EpiSC条件下，将PSCs吸引到后中胚层。分析AA/F2处理细胞的指示基因在指示时间内的变化。后中胚层标记物Msgn1在治疗第6天诱导，在早期状态下其表达可忽略不计。表S1: AA/F2处理3天，多能性基因下调，原始条带基因表达。多能性和谱系特异性基因的FPKM (log2)值(图)1 (b)和2(一个)）.表S2：Pearson在样品之间的相关系数（图1（d））。表S3：引物列表及其序列（5 -3. ）用于存在。表S4:用于免疫印迹和免疫细胞化学的一、二抗列表。（补充材料）

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