NSD2在胚胎干细胞中抑制内源性逆转录病毒Merv1

摘要

促进染色质转录(FACT)复合物是组蛋白H2A/H2B伴侣，它抑制内源性逆转录病毒(ERVs)和erv嵌合转录本的转录。它与转录起始位点和基因体区域结合。在这里，我们研究了FACT复合物的下游靶点，以确定MERVL的潜在调控因子，这是一个关键的2细胞标记基因。H3K36me2与FACT成分Ssrp1呈正相关。在H3K36me2沉积酶中，Nsd2是下调后的损失吗Ssrp1．此外，我们证明Nsd2抑制ERVs的表达而不影响多能性基因的表达。MERVL和2细胞基因的表达部分被挽救Nsd2超表达。H3K36me2对mervl嵌合基因的富集降低Ssrp1．我们的研究发现Nsd2是MERVL的一个抑制因子，而FACT通过调控的表达部分抑制MERVL的表达Nsd2及其下游的H3K36me2。

1.介绍

内源性逆转录病毒是哺乳动物基因组的重要组成部分[1］．它们通常被宿主细胞沉默以维持基因组的稳定。然而，研究也表明ERVs在发育和小鼠胚胎干细胞(ESCs)中发挥作用[2- - - - - -7］．例如，MERVL标记了ESC群体中的2细胞(2C)胚胎和少数2C样细胞[8，9］．MERVL可以被各种表观遗传调控因子沉默，如组蛋白H3变异、H3K9甲基转移酶和组蛋白伴侣[10- - - - - -15］．最近，我们发现H2A/H2B组蛋白伴侣FACT(促进染色质转录)复合物参与了ESCs中MERVL和MERVL衍生的隐转录本的抑制[16］．FACT部分通过Usp7去除MERVL和MERVL融合基因上的H2Bub [16］．然而，影响Usp7MERVL诱导的损耗比FACT复合体本身的损耗要弱[16］．这表明FACT复合物有其他方式抑制MERVL及其嵌合转录本的表达。因此，在本研究中，我们旨在识别FACT复合体下游抑制MERVL表达的间接途径。

我们和其他人之前发现，Ssrp1结合在转录起始位点周围和基因体区域富集[16，17］．基因体区域可由H3K36ME3和H3K36ME2标记[18，19］．一个重要的H3K36甲基转移酶家族是Nsd家族。在这里，我们研究了Nsd家族成员在FACT复合体下游抑制ERV表达的作用。

2.方法

2．1．细胞培养

E14 mouse embryonic stem cells (ESCs) were cultured on plates coated with sterile 0.1-0.2% gelatin (G1890, Sigma) in medium containing Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Hyclone), 15% fetal bovine serum (Hyclone), 10 ng/ml leukaemia inhibitory factor (LIF) (Z03077, GenScript), 1% penicillin/streptomycin (P1400, Solarbio), 2 mM L-glutamine (Gibco), 0.1 mM nonessential amino acids (Gibco), and 0.1 mMβ- mercaptoethanol（sigma）。escs每两天传代以进行维护。

2．2.ChIP-seq数据分析

对于Chip-SEQ数据分析，首先使用Cutadapt进行加工以修剪适配器序列和低质量读取，并随后使用Bowtie2映射到鼠标MM10基因组组件。SSRP1，H3K4ME3，H3K36ME2和H3K36ME3之间的相关系数通过来自脱溶胶的Plotcorrelation测定。芯片-SEQ信号浓缩文件由BAMCompare从脱杆获得，芯片信号线图也由氘代产生。从Gencode.vm21注释文件推断出基因结构信息。

2．3.逆转录和qPCR

用RNAiso Reagent (B9109, Takara)在DEPC水中(B501005, Sangon Biotech)分离细胞总RNA，然后用RNase-free试管(401001,NEST Biotechnology)处理dna酶I。逆转录1μg纯化的RNA，使用转录子第一链cDNA合成试剂盒(4897030001，罗氏)，如前所述[20.］．采用SYBR Green qPCR Master Mix (H97410, Yeasen)和qPCR检测系统(CFX384 Real-Time system, Bio-Rad)按照标准方案进行qPCR分析。引物由Sangon Biotech合成，见表1．

2．4．shRNA-Mediated基因损耗

shrnas瞄准Nsd2是由一个在线工具(http://sirna.wi.mit.edu/)[21］．shrna的靶向序列为shRNA1的CCTGGTGCTCATGATACTAAA和shRNA2的GAGCTGACTTTCAACTATAA。由GENEWIZ公司合成并克隆到pSuper-puro中。1μg质粒用Polyjet (SignaGen)转染小鼠ESCs。在嘌呤霉素选择下进一步培养3天(1μg/ml)，提取RNA。

2．5．染色质免疫沉淀(ChIP)偶联qPCR

如前所述进行ChIP-qPCR [16］．简单地说，将ESCs收获并与1%甲醛交联，添加甘氨酸后细胞固定终止。首先对细胞进行裂解，收集染色质提取物并超声提取可溶染色质片段。染色质样品用特异性抗体孵育，在蛋白G磁珠(GenScript，美国)上免疫沉淀。然后将免疫沉淀的DNA进行洗脱，去链，并通过qPCR进行分析。用于免疫沉淀的抗体为抗h3k36me2 (ab9049, Abcam)。

2．6．过表达Nsd2的ESC细胞系的建立

鼠标Nsd2将编码区克隆到耐潮霉素的pCAG-3HA载体中，用试剂盒(1211-01,Biomiga)进行纯化。Ssrp1^{- / -}用1μg质粒表达Nsd2通过Polyjet试剂(SL100688, SignaGen)遵循制造商推荐的协议。连续选取800例ESCsμg / ml氢霉素b 14天。在选择性细胞培养后，收集ESC以进行下游实验。

3.结果

3．1.事实:复合物结合与H3K36甲基化相关

此前，我们发现FACT复合物与启动子和基因体区域均有相互作用，这些区域以H3K36me2/3标记。有趣的是，H3K36me2和H3K36me3的基因组分布与Ssrp1呈正相关(图)1(一)），与H3K4ME3的SSRP1的相关强度较低（图1(一))．值得注意的是，H3K36me3在基因体上的富集从转录起始位点(TSS)到转录结束位点(TES)不断增加，而H3K36me2优先与TSS区域相关，从TSS到TES逐渐衰减(图)1 (b))．与H3K36me3相比，H3K36me2的分布曲线更接近FACT复合物(图)1(一)和1 (b))．因此，我们进一步检测了Nsd家族基因(Nsd1，Nsd2,Nsd3)，这是已知的介导H3K36甲基化。Nsd1在ESCs中表达最高，而Nsd2和Nsd3较低（图1 (c))．的表达Nsd1和Nsd3在没有FACT复合体的ESCs中保持不变或轻微上调(图)1 (d))．然而,Nsd2表达下调Ssrp1^{- / -}ESCs(图1 (d)),这意味着Nsd2作为FACT复合体潜在的下游靶基因。

３．２．Nsd2抑制ESCs中的MERVL

与Ssrp1结合谱图与H3K36me2的相似性一致，Nsd2的主要染色质调节活性是介导组蛋白H3在赖氨酸36 (H3K36me2)的二甲基化[19］．因此,我们耗尽Nsd2在有两个独立shrna的ESCs中检测Nsd2是否可以调节ERVs的表达(图)2(一个))．耗尽Nsd2未影响ESCs的细胞形态(图2 (b))．多能性基因的表达(十月，Sox2，Nanog）两人没有受到干扰Nsd2同时使用shrna(图2 (c))．抑制Nsd2通过两个独立的shrna，未干扰内胚层分化标记的表达(Foxa2和Sox17)、中胚层(Gata4和Nkx2.5),外胚层(MSX1.和Pax6)和滋养外胚层(Foxd3和Gata3)，同时(数字2 (d)- - - - - -2 (g))，表明ESCs未分化Nsd2．有趣的是，MERVL的表达被激活至~2倍Nsd2损耗(图2 (h))，但其他逆转录转座子(LINE1或SINE B1)的激活或下调较少，证实了Nsd2作用于FACT复合体下游抑制ERV的表达。这些结果表明，Nsd2抑制了MERVL的表达，但不影响ESC的多能性。

3．3．Nsd2过表达挽救MERVL的表达Ssrp1^{- / -}ESCs

由于Nsd2抑制MERVL的表达Nsd2中表达下调Ssrp1^{- / -}ESCs，我们接下来问是否恢复Nsd2表达Ssrp1^{- / -}Escs可以拯救Mervl的表达。因此，我们建立了一个Ssrp1^{- / -}ESC与Nsd2过表达。qPCR结果表明Nsd2成功的过度表达Ssrp1^{- / -}ESCs(图3(一个))．此外,过度的Nsd2能部分降低MERVL在Ssrp1^{- / -}ESCs(图3 (b))．此外，2-细胞标记基因(Zscan4和成绩最优的学生)部分恢复(图3 (c))．这些结果表明Nsd2是Ssrp1在抑制ERVs和2细胞基因中重要的下游靶基因。

3．4．nsd2介导的H3K36me2在mervl融合基因上减少Ssrp1^{- / -}ESCs

我们通过ChIP-qPCR进一步研究了在无FACT的ESCs中，Nsd2的靶基因H3K36me2是否在mervl -融合基因上受到影响。我们的ChIP-qPCR结果显示H3K36me2在mervl融合基因上富集Zfp809(图4(一)）但不是在控制区域（图4 (b))．然而，在没有mervl融合基因的ESC中，这种富集降低了Ssrp1表达式(数据4(一)和4 (b))．综上所示，H3K36me2在mervl融合基因上的富集减少可能解释了之后mervl融合基因的激活Nsd2downregulation在Ssrp1^{- / -}ESCs。

4.讨论

综上所述，我们发现Nsd2是MERVL和MERVL融合2C基因的抑制因子，并下调Nsd2作为激活MERVL的二级调控途径Ssrp1．只有很有趣地看到Nsd2(图1 (d)),但不Nsd1也不Nsd3考虑到所有三个Nsd基因都参与H3K36的甲基化，FACT的功能被破坏而下调。Nsd2是一个重要的H3K36me2甲基转移酶[19，22］．的损失Nsd2模仿H3.3k36m突变，但不是Nsd1或Setd2模拟H3.3K36M对脂肪形成的影响[23，提示Nsd2在Nsd成员中具有独特的基因表达调控作用。H3K6me2与基因表达的激活和抑制相关[24］．最近有报道称Nsd1/ nsd2介导的基因间H3K36me2招募Dnmt3a进行DNA甲基化[25，26］．在酵母细胞中，H3K36me1/2/3也显示出抑制隐转录[27］．此外，H3K36me2可以募集Rpd3s组蛋白去乙酰化酶抑制虚假转录[28］．这与我们发现mervl融合基因缺失后H3K36me2下降的结果一致Ssrp1(数据4(一)和4 (b)），暗示H3K36ME2的潜在镇压作用。

Nsd2不仅参与基因转录调控。它还参与调控基因组稳定性和非组蛋白的甲基化。nsd2介导的H3K36me2促进非同源端粒连接，从而增强端粒功能障碍引起的基因组不稳定性[29］．人类nsd2介导的PTEN甲基化调节细胞对DNA损伤的反应[30.］．最近发现，MERVL激活因子Zscan4耗竭可诱导DNA损伤[3.，31］．ATR和CHK1对复制胁迫的反应被激活Zscan4和MERVL20.，提示DNA损伤诱导的复制应激与Zscan4相互调节。未来研究Nsd2是否参与DNA损伤修复及其与Zscan4的关系将是一个有趣的课题。

5.结论

总之，我们发现Nsd2，作为FACT的下游基因，抑制MERVL，而不影响ESC多能性。的减少Nsd2在Ssrp1^{- / -}Escs伴随着在过度表达的同时伴随着Mervl融合基因的H3K36ME2Nsd2部分地救出了Mervl的表达。这些调查结果将NSD2建立为ESC中的MERVL重要阻遏物，并且在丢失事实功能期间。

数据可用性

我们分析的已发表的ChIP-seq数据是针对Ssrp1的GSE141791 [16]，GSE117155对于H3K36ME2 [32， GSE110321适用于H3K36me3 [33和GSE90893 for H3K4me3 [34］．

的利益冲突

我们声明本研究不存在利益冲突。

作者的贡献

X.L.构思并设计了这项研究。t.g.、f.c.和W.Z.做了大部分实验。x.z做生物信息学分析。t.g.、x.h.和X.L.撰写了手稿。

致谢

国家重点研发计划项目(no . 2018YFA0107000);国家自然科学基金项目(no . 32070858, no . 31671352, no . 31871488);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(no . 63151113, no . 63161150)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性

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