TAB2促进宫颈鳞状细胞癌细胞的干细胞性和生物学功能

摘要

肿瘤干细胞是通过与癌细胞相互作用促进宫颈癌进展的关键群体。已有研究初步揭示，宫颈癌干细胞有助于肿瘤复发和化疗耐药。然而，调控细胞功能的具体机制仍然是未知的。在这里，我们分析了公共数据库和我们的全球转录组数据，从而识别癌症相关的信号通路和分子。根据我们的研究结果，TAB2的上调与宫颈癌的干细胞样特性相关。对正常和宫颈癌组织进行TAB2免疫组化染色。细胞功能实验表明，抑制TAB2可以降低宫颈癌细胞的干性，重要的是可以防止宫颈癌的进展。综上所述，以TAB2为靶点的治疗方案可能通过梗阻性干性维持来克服宫颈癌肿瘤复发和化疗耐药性。

1.介绍

宫颈癌(CC)是发展中国家女性癌症死亡的主要原因之一，2018年全球每年新增病例56万例，死亡30万例[1］.虽然早期CC患者通常预后良好，但它可以恶化的复发或转移的疾病。对于晚期CC，顺铂治疗为主的化疗是首选，尽管其疗效不令人满意，应答率低[2］.最近，晚期CC的联合治疗被证明可以获得更好的总生存(OS)和缓解率[3.，4］.

最近的研究进展突出了肿瘤中存在的一组具有高度可塑性和自我更新能力的细胞，这组细胞被称为癌症干细胞(CSCs)。CSCs的特点是能够在对周围微环境刺激的反应中分化成肿瘤细胞群[5］.它们与正常干细胞具有相同的特性，如自我更新、迁移、分化和避免凋亡。新的研究证实了CSCs在肿瘤发生和进展中的重要作用，它能够决定肿瘤进展率、转移、肿瘤化疗耐药和疾病预后。因此，CSCs与预后不良相关。到目前为止，已经在许多类型的癌症中检测到CSCs [6，7]，包括但不限于子宫颈[8］.值得注意的是，一些研究发现，一些干细胞相关基因与肿瘤发生密切相关。以往的研究发现，SOX2和BMI1在CC的癌变过程中具有重要作用[9］.先前的研究表明CSCs分子的靶向治疗在癌症中很重要[10］.因此，在CC中寻找调控宫颈癌干细胞干细胞性的分子具有重要意义。

在本研究中，我们通过RNA测序检测了Siha来源的癌干细胞样细胞(Siha球)和Siha细胞系的表达模式。发现转化生长因子β-激活激酶1结合蛋白2 (TAB2)在siha来源的癌干样细胞中显著上调。TCGA数据库中，TAB2水平与CC的操作系统相关。在Siha和MS751细胞系中，抑制TAB2可显著抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。进一步的研究证实，TAB2通过调节CSCs促进CC的发生和发展。总之，本研究揭示了TAB2在CC中未明确的作用，为这种恶性肿瘤提供了预后标志物和候选药物。

2.方法

２.１.细胞培养和患者样本

人CC细胞系Siha、HeLa和正常人宫颈H8细胞系购自中国科学院型培养库。细胞在含有10%胎牛血清(FBS, Gibco, 10270-106)和1%青霉素链霉素(Gibco, 15140122)的Dulbecco 's Modified Eagle 's培养基(DMEM, Gibco, 11885-076)中培养，37℃，5% CO₂．MS751细胞株在添加10%胎牛血清和1%非必需氨基酸(Gibco, 11140-050)的MEM (Gibco, 11095080)中培养。

所有组织均取自中山大学附属第一医院行手术的CC患者。肿瘤标本在4%福尔马林室温下固定过夜，石蜡包埋。所有患者在研究前均获得知情的书面同意。

２.２.细胞转染

构建TAB2 sirna，测序结果如下:hs-TAB2-si-1: GGUGCAUGUUACAGAAUAAdTdT (sense)和UUAUUCUGUAACAUGCACCdTdT(反义);hs-TAB2-si-2: CAGCAUUAGUGAUGGACAAdTdT(义)和UUGUCCAUCACUAAUGCUGdTdT(反义)。

2．3.RT-qPCR

按照TRIzol试剂(Invitrogen, 15596026)的说明书提取细胞总RNA。然后,1μ采用PrimeScript RT主混合试剂盒(TaKaRa, RR036A)的标准程序逆转录为cDNA。之后，使用TB Green™Premix Ex Taq II试剂盒(TaKaRa, RR820B)进行实时PCR，并在Bio-Rad CXF96实时系统(Bio-Rad，美国)上操作。选取GAPDH作为内参考，计算相对水平。引物对列表如下:TAB2(正向):5 -GGACCTGCCCTGGAAAAGAA-3 ，TAB2(反向):5 -TAGCTGTTCTTGGTTGGCCC-3 ；GAPDH(前锋):5 -TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3 ，GAPDH(反向):5 -ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3 ．

２.４.西方墨点法

用冰冷的RIPA裂解液获得CC细胞蛋白，使用Pierce™BCA protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23227)检测细胞裂解液中的蛋白浓度。然后将蛋白溶解在负载缓冲液中，高温变性10分钟。经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，蛋白转移到PVDF膜(Millipore，德国)。在一抗(anti-TAB2, Proteintech, 14410-1-AP-50)过夜孵育前，膜被阻断1小时μl;anti-BMI1、Abcam ab14389-25μg;anti-SOX2、Abcam ab97959 - 100μg;4℃、抗gapdh、Abcam、ab70699)，另于室温下二抗孵育1 h。用增强化学发光(ECL)试剂检测蛋白-抗体复合物。

2．5．集落形成实验

Siha或MS751细胞接种于6孔板( 细胞/)。14 d后，用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，用0.1%结晶紫染色，捕获细胞菌落。每组重复三次。

2.6。细胞增殖实验

采用CCK-8法(Dojindo, CCK8-500)检测细胞增殖。按照标准程序，细胞悬浮液中含有 细胞(100μl) 96孔板每孔播种，37℃培养。在指定的时间点，10μ每孔加入反应剂l, 37℃孵育1小时，450nm波长(Infinite 200 PRO)检测吸光度。

2.7。细胞迁移试验

Transwell法检测细胞迁移能力。细胞在Transwell插入物(默克Millibo, MCHT06H48)中接种 ．含20%胎牛血清的DMEM应用于放置Transwell插入物的24孔板中。在37°C和5% CO孵育后₂处理24 h后，用4%多聚甲醛在4°C下固定30分钟。PBS冲洗后，用结晶紫染色，室温孵育45分钟。然后，用棉签去除插入物上方的细胞，用PBS彻底冲洗。计算每个样本中随机选择的3个视图的平均细胞数。

2.8。Annexin V凋亡与细胞周期进展的流式细胞分析

采用Annexin V凋亡检测试剂盒(Dojindo, AD10)检测细胞凋亡率。简单地说，将CC细胞接种到6孔板( ）细胞凋亡分析，37℃完全培养基培养2天。然后收集细胞，经非edta胰蛋白酶处理后，用试剂盒染色。用于测定细胞周期进展的CC细胞被移植到6孔板( ）在37°C培养过夜。细胞在非edta胰蛋白酶消化后，用75%乙醇固定过夜，第二天用试剂盒(MultiScience, 70-CCS012)染色15分钟。两项实验均在流式细胞仪上进行，使用BD FACSDiva软件6.0 (BD Biosciences, New York, NY, USA)进行三份。

2.9。醛脱氢酶活性的流式细胞分析

使用ALDEFLUOR荧光试剂盒(STEM Cell Technology, 01700)测定乙醛脱氢酶活性。简单地说，每个样品都有一个试管和一个对照试管。在试管中收集细胞后，在细胞悬液中加入活化的氟化试剂。然后，一半的悬架和5μl二乙基氨基苯甲醛(DEAB)加入对照管37℃孵育半小时。去除上清，沉淀重悬于测定缓冲液中，采用流式细胞术分析醛脱氢酶活性。

2.10。免疫组织化学染色(包含IHC)

CC切片在二甲苯中脱蜡，然后在梯度浓度的乙醇中复水。PBS冲洗后，置于0.01 mol/l柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中孵育，在高温下进行抗原回收。在3% H后阻断内源性过氧化物酶₂O₂CC切片用抗tab2 (1: 200, Proteintech, 14410-1-AP-50)在室温下孵育10分钟μl)和抗sox2 (1: 200, Abcam, ab97959-100μg)在4°C过夜。然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔-山羊在室温下孵育1 h。TAB2和SOX2的阳性表达量分别为3,3 -二氨基联苯胺(DAB)染色液。

免疫组化染色强度( ）得分为0(阴性)，1(弱)，2(中等)，或3(强)。阳性染色细胞百分比( ）评分为0(阴性)、1(≤10%)、2(11%-50%)、3(51%-75%)、4(>75%)。包含IHC得分 ，在这阳性细胞的百分比和为免疫组化染色强度。

2.11。RNA序列

Siha细胞和Siha球被送去进行RNA测序。简而言之，将每个样本的总RNA收集在1ml TRIzol中，用于进一步分析。然后用Nano-300检测总RNA的质量和纯度。根据Illumina协议，从RNA样本中构建cDNA文库，在Illumina HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA)平台上进行Illumina配对端(PE)测序。配对端reads (2100 bp)由Noggin生物信息学有限公司(北京，中国)生产。

2.12。球体形成化验

按照前一种方法[11，干细胞培养基中含有 细胞/ml置于6孔超低板中，37℃，5% CO孵育1-2周₂．干细胞培养基应每两天更换一次。球形成后，用0.25%胰酶- edta消化成单个球，在显微镜下捕捉计数。经过6代形成球形后，我们获得了一组更具有茎干性的细胞，命名为四哈球形。大于75的球形胞团μ直径m的认为是CSCs自我更新形成的球体。

2.13。统计分析

未配对的学生 -采用检验确定统计学意义。数据表示为 ．采用GraphPad Prism 8.0对所有结果进行数学分析。

3.结果

３．１．Siha球体显示升高的CSC-Like属性

先前的研究表明，CSCs可以在肿瘤细胞中选择性富集[12，13］.肿瘤球形成实验被认为是检测细胞自我更新特性的理想方法。无血清培养的CC细胞最适合肿瘤球的生长。我们比较了第六代球与原始细胞系的成球效率，证明了具有更高成球效率的CSCs在CC细胞中富集(图)1(一)和1 (b)）.在随后的Western blotting检测中发现了一致的结果，即在Siha球体中检测到的BMI1和SOX2蛋白水平高于Siha细胞(图)1 (c)）.

３.２．TAB2与癌细胞干性相关

为了研究CSCs调控CC进展的分子机制，我们通过RNA测序确定其在Siha球和Siha细胞中的下游机制。差异表达基因(DEGs)被分为上调、不显著(非sig.)和下调集合，用火山散点图描述(图)2(一个)）.KEGG富集分析表明，下调基因在一系列茎性调控途径、肿瘤发生和发育相关途径中选择性富集;其中，PI3K-AKT信号通路富集最多(图)2 (b)）.此外，一些具有代表性的致癌特征，如肿瘤坏死因子(TNF)的信号转导和转化生长因子-β，在Siha球中统计丰富，提示CSCs可能调节CC的肿瘤发生、增殖、转移和化疗耐药(图)2 (c)）.在高表达基因集中筛选出TAB2作为下游分子，因为它参与了这两个途径。Human Protein Atlas数据显示，与正常组织相比，CC组织中TAB2蛋白表达上调(图)2 (d)）.随后，我们在TCGA数据库中发现，TAB2与CC患者的总生存率呈显著负相关(图)2 (e)）.利用StarBase数据库分析306份宫颈鳞癌样本中TAB2与经典干性分子(BMI1和SOX2)的共表达情况。我们发现，在宫颈鳞癌标本中，TAB2的表达水平与BMI1的表达水平显著正相关，这也与之前的数据一致(图)2 (f)）.

３．３．CC患者中TAB2和SOX2过表达

为了进一步验证TAB2在CC中调控CSCs特性的机制，我们通过IHC染色检测了在CC患者体内TAB2和stemness标记分子的阳性表达。由于BMI1和SOX2是CCSCs的主要标记物，我们研究了它们在CC切片中的表达模式。与正常组织相比，CC切片中TAB2、BMI1、SOX2阳性表达均显著增高(图)3(一个)）.为了进一步明确TAB2在体外的作用，我们选择了4株CC细胞株和1株正常细胞株，通过Western blotting和RT-qPCR检测TAB2的表达水平(图)3 (b)和3 (c)）.接下来，选择Siha和MS751细胞系进行进一步的功能研究。

3．4．TAB2的敲除抑制了CC的cscs样性质

基于上述结果，我们接下来研究了TAB2对CC细胞中cscs样性质的潜在影响。首先，我们在蛋白水平上验证了TAB2 siRNA的转染效果(图)4(一)和4 (b)）.检测TAB2干预的CC细胞干细胞相关蛋白水平。结果表明，在Siha和MS751细胞中，抑制TAB2显著下调BMI1和SOX2。在Siha和MS751细胞中，降低TAB2的表达显著降低了成球效率(图)4 (c)- - - - - -4 (e)）.此外，在CC细胞中测定了由TAB2介导的CSCs可靠标记醛脱氢酶(ALDH)活性[14，15］.与阴性对照相比，转染si-TAB2的CC细胞中ALDH活性显著降低(图)4 (f)和4 (g)）.因此，我们认为TAB2在维持CC细胞自我更新方面具有重要意义。

3．5．抑制TAB2在体外CC细胞的恶性表型

癌细胞通常表现为不受控制的增殖、避免生长抑制、抵抗凋亡、活跃的侵袭和转移[16］.为了进一步揭示TAB2在CC细胞中的功能作用，我们通过克隆形成实验和CCK-8实验检测了TAB2敲低对CC细胞增殖的影响。结果表明，在Siha和MS751细胞中，敲低TAB2显著抑制了克隆形成和细胞增殖的能力(图)5(一个)- - - - - -5 (c),5 (e)）.通过流式细胞仪检测Siha和MS751细胞的细胞周期分布，结果显示，抑制TAB2降低了S期分布的细胞比例，与细胞生长受到抑制的情况一致(图)5 (d)和5 (f)）.此外，Transwell实验表明，抑制TAB2降低了CC细胞的迁移能力(图)5 (g)和5 (h)）.随后，在CC细胞中发现TAB2敲低可加速细胞凋亡(图)5(我)和5 (j)）.综上所述，这些结果表明，TAB2在CC细胞的增殖、凋亡和迁移中发挥了关键作用。

4.讨论

已有研究证明，lncrna、mirna、mrna调控不同类型CSCs的干性[16- - - - - -18］.干细胞相关途径能够改变癌细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药性等生物学功能。目前，干细胞在CC中的作用机制尚不清楚，但已经发现了许多与干细胞通路相关的分子。在我们的研究中，高表达CSC标记物的Siha球被发现促进了CC的快速进展，显示了CC患者的预后潜力。因此，CC干细胞有望成为临床应用的治疗靶点。

在这里，我们详细记录了TAB2在CC干细胞中的调控机制。TAB2已被证明在NF-的激活中起关键作用κ通过与多聚泛素链结合的B途径[19］.重要的是,激活NF -κ肿瘤发生过程中的B信号通路已被充分证明[20.]，它维持CSC类茎的属性[21］.一致地，我们的RNA-seq结果显示Siha球中上调的基因与肿瘤干相关通路显著相关。由于TAB2在调节肿瘤干细胞方面非常重要，我们分析了它在CC中的预后潜力。TCGA数据库数据显示，TAB2与CC患者的总生存率呈负相关。值得注意的是，我们发现TAB2与cscs相关分子BMI1和SOX2的mRNA水平显著正相关。既往研究表明，BMI1和SOX2与多种肿瘤的恶性转化和侵袭性有关[22，23］.BMI1通过上调SOX2参与CC的癌变[24］.更具体地说，我们发现，在mRNA和蛋白水平上，TAB2的敲除显著下调了BMI1和SOX2，这与TAB2敲除后CC细胞中CSC属性的降低相一致在体外．同时，我们发现，在CC细胞中，TAB2是介导高增殖率和低凋亡率的必要条件。综上所述，这些结果支持TAB2通过调控CSC干性途径促进CC发病。因此，我们的研究对CC中的TAB2有了更深刻的认识。

综上所述，我们的研究结果揭示了TAB2在CC中调控CSC通路的作用。TAB2通过激活茎干相关通路促进CC的进展。虽然TAB2的致癌机制还需要进一步的研究，但我们目前的研究为开发更好的人类癌症治疗策略奠定了基础。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

国家自然科学基金项目(No. 81874102, No. 82072874);黄嘉明项目(No. 81902627);刘天宇项目(No. 81802599);广州市科技计划项目(No. 202002020043);中山大学5010临床研究基金项目(No. 2017006 -姚树忠)，广东省自然科学基金项目(No. 2017A030313509, No. 2021A1515011776 -王伟，No. 2018A0303130190 -黄嘉明)，中山大学附属第一医院本科教学改革研究课题(编号:31911130-200437);

参考文献

1. F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre，和A. Jemal，“2018年全球癌症统计:GLOBOCAN估计全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率”，CA:临床医生的癌症杂志第68卷第2期6，第394-424页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. C. S. Da, R. C. Bonadio, F. Gabrielli等，“顺铂和吉西他滨的新辅助化疗配合放化疗与放化疗治疗局部晚期宫颈癌:一项随机II期试验，”临床肿瘤学杂志， vol. 37, pp. 3124-3131, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. H. C. Chung, W. Ros, J. P. Delord等，“pembrolizumab在既往治疗的晚期宫颈癌中的有效性和安全性:来自II期KEYNOTE-158研究的结果，”临床肿瘤学杂志，第37卷，第2期17, pp. 1470-1478, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. K. S. Tewari, M. W. Sill, H. R. Long等，“贝伐单抗在晚期宫颈癌中的生存率提高，”新英格兰医学杂志，第370卷，第2期8, pp. 734-743, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. D. Nassar和C. Blanpain，《癌症干细胞:基本概念和治疗意义》，病理年刊，第11卷，第5期。1，第47-76页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. M. Luo, S. G. Clouthier, Y. Deol等，“乳腺癌干细胞:目前的进展和临床意义”，分子生物学方法， vol. 1293, pp. 1-49, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. J. E. Visvader和G. J. Lindeman，《实体肿瘤中的癌症干细胞:积累证据和未解决的问题》，自然评论。癌症，第8卷，第2期10，第755-768页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. “GDF15通过受体ErbB2磷酸化AKT1和Erk1/2，促进宫颈癌细胞增殖，”实验与临床癌症研究杂志，第37卷，第2期1，第80页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. S. Kaufhold, H. Garban，和B. Bonavida，“阴阳1与癌症干细胞转录因子(SOX2, OCT4, BMI1)和临床意义相关，”实验与临床癌症研究杂志第35期1，第84页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. 陈晓霞，谢仁华，顾平等，“长链非编码RNALBCS通过SOX2的表观遗传沉默抑制膀胱癌干细胞的自我更新和化疗耐药性，”临床癌症研究，第25卷，第2期4, pp. 1389-1403, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. D. Chen, M. Wu, Y. Li等，“靶向BMI1(+)肿瘤干细胞克服化疗耐药性并抑制鳞状细胞癌转移，”细胞干细胞，第20卷，第2期。5,页621 - 634。e6, 2017年。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. 人类皮肤基底细胞癌肿瘤干细胞的鉴定皮肤干细胞，第435-450页，Humana出版社，纽约，纽约，2018。视图:谷歌学者
13. C. Raggi, M. Correnti, A. Sica等，“胆管癌干样亚群通过培养相关巨噬细胞形成肿瘤起始生态位，”肝脏病学杂志第66期1, pp. 102-115, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. “细胞柔软性调节肿瘤细胞的致瘤性和干性，”在EMBO杂志，第40卷，第5期。2, p. 106123, 2021。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. M. E. Toledo-Guzman, M. I. Hernandez, a . a . Gomez-Gallegos和E. Ortiz-Sánchez，“ALDH作为实体肿瘤的干细胞标记”，当前干细胞研究与治疗第14卷第2期5, pp. 375-388, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. E. M. McCabe和T. P. Rasmussen，“lncRNA参与癌症干细胞功能和上皮-间充质转化”癌症生物学研讨会，学术出版社，2020。视图:谷歌学者
17. A. Q. Khan, E. I. Ahmed, N. R. Elareer, K. Junejo, M. Steinhoff，和S. Uddin，“mirna调节的癌症干细胞在人类恶性肿瘤发病机制中的作用”，细胞，第8卷，第2期第8页，第840页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. Lin Z. Lin, Liang W.， and Q. Zhang，“mRNA修饰协调癌症干细胞命运的决定”，分子癌症第19卷第2期1，第38页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. A. Kanayama, R. B. Seth, L. Sun等，“TAB2和TAB3通过与多聚泛素链结合激活NF-kappaB通路，”分子细胞，第15卷，第5期。4，页535-548,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. J. U. Marquardt, L. Gomez-Quiroz, C. L. Arreguin等人，“姜黄素有效地抑制致癌的NF-κB信号传导和抑制肝癌的干性特征肝脏病学杂志，第63卷，第2期3, pp. 661-669, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. C. Kaltschmidt, C. Banz-Jansen, T. Benhidjeb等人，“NF-kappaB在器官特异性癌症和癌症干细胞中的作用”，癌症，第11卷，第5期。5，第655页，2019年。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. G. V. Glinsky，“Stemness”基因组学定律管理人类癌症的临床行为:对疾病管理决策的影响”，临床肿瘤学杂志第26卷第2期17，页2846 - 2853,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. T. Schaefer和C. Lengerke，“茎干、重编程和癌症中的SOX2蛋白生物化学:PI3K/AKT/SOX2轴及其以外”，致癌基因第39卷第3期2, pp. 278-292, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. R. Xu, L. Chen，和W. T. Yang，“异常升高的Bmi1通过增强Sox2基因的转录调控促进宫颈癌的致瘤性和肿瘤球的形成，”肿瘤的报道，第42卷，第2期2，第688-696页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2021周益佳等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。