SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/6550388 6550388 研究文章 TAB2具备干细胞促进宫颈鳞状细胞癌的细胞和生物功能 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1003 - 088 x 周 出 1 廖 远东 1 张 : 1 刘 Junxiu 1 王 魏 1 黄 嘉明 1 杜 Qiqiao 1 刘 天宇 1 邹 Qiaojian 1 黄 华 1 刘 锅 2 Ooi认为 Shiyin 1 程ydF4y2Ba 运行 1 夏 孟 1 江 红叶 1 徐 Manman 1 锅 宇文 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5145 - 5705 姚 Shuzhong 1 李 Jiong 1 妇产科学系 第一附属医院 中山大学 广州 510080年广东 中国 sysu.edu.cn 2 妇产科学系 西北地区妇女和儿童医院 西安 陕西 中国 2021年 1 7 2021年 2021年 7 4 2021年 12 5 2021年 11 6 2021年 1 7 2021年 2021年 版权©2021个周et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

癌症干细胞是一个关键的人口参与促进宫颈癌的进展通过与肿瘤细胞相互作用。现有的研究初步表明,宫颈癌干细胞导致肿瘤复发和化疗抵抗。但是,具体在调节细胞功能的机制在很大程度上仍未知。在这里,我们分析了公布的数据从公共数据库和我们的全球转录组数据,从而确定癌症相关的信号通路和分子。根据我们的调查结果,调节TAB2是宫颈癌的干细胞的特性相关。TAB2在正常和宫颈癌组织的免疫组织化学染色。细胞功能实验表明,击倒TAB2减少宫颈癌细胞的具备干细胞,重要的是,预防宫颈癌的进展。总的来说,治疗方案针对TAB2可能提供一个选择克服肿瘤复发和药物抗性的宫颈癌具备干细胞通过阻碍维护。

 广东省自然科学基金 2018年a0303130190 2021年a1515011776 2017年a030313509 中山大学 31911130 - 200437 2017006 广州科技计划重点项目 202002020043 中国国家自然科学基金 81802599 81902627 82072874 81874102 1。介绍

宫颈癌(CC)是女性癌症死亡率的主要原因之一,在发展中国家,年发病率2018年全世界560000新病例和300000例死亡( 1]。尽管患者早期CC通常预后良好,它可以被复发或转移性疾病恶化。先进的CC、顺铂治疗化疗是首选,尽管其疗效是令人不满意的反应率较低 2]。最近,联合治疗先进CC演示了实现更好的总生存期(OS)和反应率( 3, 4]。

最近进步了一组肿瘤细胞的存在是高度塑料和自我更新,这被称为癌症干细胞(二者)。二者能够分化成特点是对刺激做出反应肿瘤细胞的数量从周围的微环境 5]。他们共享相同的正常干细胞特性,如自我更新、迁移、分化,避免细胞凋亡。新兴研究已经证实二者在肿瘤形成和发展的至关重要的作用,它能够确定肿瘤恶化率、转移、肿瘤化疗抵抗,和疾病的预后。因此,二者与不良预后有关。到目前为止,发现二者在许多类型的癌症 6, 7),包括但不限于颈( 8]。值得注意的是,一些研究已经发现,一些干细胞相关基因与肿瘤发生密切相关。先前的研究显示SOX2的关键功能和BMI1 CC的致癌作用 9]。之前的研究表明,分子靶向治疗在癌症(二者是很重要的 10]。因此,它具有重要意义寻找分子调节宫颈癌的具备干细胞干细胞在CC。

在这项研究中,我们调查了表达式模式Siha-derived癌症干细胞样细胞(Siha球体)和Siha细胞系的RNA序列。这是发现转化生长因子 β活化激酶1结合蛋白2 (TAB2)显著调节Siha-derived癌症干细胞样细胞。TAB2水平与操作系统有关的CC TCGA数据库。击倒的TAB2 Siha和MS751细胞株显著抑制体外增殖和诱导细胞凋亡。进一步的研究证实,TAB2 CC通过调节二者促进肿瘤发生和发展。综上所述,本研究显示一个未定义的角色在CC TAB2,提供这一恶性肿瘤预后标记和药物候选。

 2。方法 2.1。细胞培养和患者样本

人类CC细胞系Siha海拉和正常人颈H8细胞系买来类型文化中国科学院的集合。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM Gibco 11885 - 076)以10%胎牛血清(的边后卫,Gibco 10270 - 106)和1% penicillin-streptomycin (Gibco, 15140122)在37°C公司为5%2。MS751细胞株培养在MEM (Gibco, 11095080)补充10%的边后卫和1%不必要的氨基酸(Gibco, 11140 - 050)。

所有的组织都来自CC在第一附属医院接受手术的患者,中山大学。一夜之间,肿瘤样本被固定在4%福尔马林在室温和嵌入石蜡。通知书面同意之前就从所有患者获得了这项研究。

 2.2。细胞转染

TAB2 siRNAs构造及其序列是列出如下:hs-TAB2-si-1: GGUGCAUGUUACAGAAUAAdTdT(意义)和UUAUUCUGUAACAUGCACCdTdT(反义);hs-TAB2-si-2: CAGCAUUAGUGAUGGACAAdTdT(意义)和UUGUCCAUCACUAAUGCUGdTdT(反义)。

 2.3。RT-qPCR

根据指示细胞总RNA提取试剂盒中的试剂(表达载体,15596026)。然后,1 μg RNA是利用反向转录cDNA PrimeScript RT大师的标准程序组合工具包(豆类,RR036A)。之后,结核病绿色™预混料交货Taq II工具包(豆类,RR820B)是用于实时PCR和运营Bio-Rad CXF96实时系统(美国Bio-Rad)。GAPDH被选为内部参考计算的相对水平。引物对上市如下:TAB2(前锋):5 ′ -GGACCTGCCCTGGAAAAGAA-3 ′ ,TAB2(反向):5 ′ -TAGCTGTTCTTGGTTGGCCC-3 ′ ;GAPDH(前锋):5 ′ -TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3 ′ GAPDH(反向):5 ′ -ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3 ′ 。

 2.4。西方墨点法

细胞蛋白质的CC与冰冷的•瑞帕裂解得到的解决方案,和皮尔斯™BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学,23227)是用于检测蛋白质浓度在细胞溶解产物。然后,蛋白质溶解在加载缓冲区和高温变性10分钟。10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,蛋白质转移到PVDF膜(微孔,德国)。膜被1 h隔夜孵化之前主要抗体(anti-TAB2 Proteintech 14410 - 1 - ap - 50 μl;anti-BMI1、Abcam ab14389-25 μg;anti-SOX2、Abcam ab97959 - 100 μg;,Abcam anti-GAPDH ab70699)在4°C,其次是在室温下二次抗体孵育1 h在另一天。protein-antibody复杂与增强化学发光检测试剂(ECL)。

 2.5。集落形成实验

Siha或MS751细胞被播种在6-well板( 2 × 10 3 细胞/)。14天后,细胞与4%多聚甲醛固定30分钟和结晶紫沾0.1%,紧随其后的是捕获细胞的殖民地。每组重复了一式三份。

 2.6。细胞增殖实验

CCK-8化验(Dojindo cck8 - 500)进行测量细胞增殖。根据标准程序,包含细胞悬液 2 × 10 3 细胞(100 μl)被播种到每一个96孔板和培养在37°C。在表示时间点,10 μl反应剂添加到每个好和孵化37°C 1小时,其次是检测450纳米波长的吸光度(无限200 PRO)。

 2.7。细胞迁移试验

细胞迁移能力通过Transwell试验检测。细胞被播种在Transwell插入(默克Millibo MCHT06H48) 1 × 10 4 / 毫升 。DMEM含有20%的边后卫应用在一个Transwell 24-well板插入。孵化后37°C公司为5%224 h,样品在4°C和4%多聚甲醛固定30分钟。与PBS洗涤后,细胞迁移和结晶紫染色和在室温下孵化了45分钟。然后,细胞上的插入删除用棉签,用PBS彻底冲洗。细胞的平均数量在3随机选择视图/样本计算。

 2.8。流仪分析膜联蛋白V细胞凋亡和细胞周期进程

细胞凋亡率由膜联蛋白V凋亡检测设备(Dojindo AD10)。简而言之,CC细胞被播种到6-well板( 1 × 10 5 / 毫升 / 好吧 )细胞凋亡分析和在完全培养基培养37°C了两天。然后,细胞被收集和染色与治疗后装备non-EDTA胰蛋白酶。CC细胞用于确定细胞周期进展被移植到6-well板( 5 × 10 5 毫升 / 好吧 在37°C)和培养过夜。一夜之间,消化后non-EDTA胰蛋白酶,细胞被固定为75%乙醇和沾的工具包(70 - ccs012 MultiScience) 15分钟第二天。两个实验操作与BD FACSDiva流式细胞分析仪软件6.0 (BD生物科学,纽约,纽约,美国)一式三份。

 2.9。流仪分析醛脱氢酶的活动

乙醛脱氢酶活性决定使用ALDEFLUOR荧光工具包(干细胞技术,01700)。总之,试管和一个控制管标签为每个样本。在收集细胞在试管中,激活细胞悬液中添加氟化试剂。然后,悬挂和5的一半 μl (diethylaminobenzaldehyde (DEAB)中加入了控制管和孵化半个小时37°C。上层清液被免职,沉淀剂是决心resuspended缓冲区使用流式细胞术分析醛脱氢酶的活动。

 2.10。免疫组织化学染色(包含IHC)

CC部分在二甲苯脱蜡,然后水化与梯度乙醇浓度。PBS冲洗后,部分在0.01 mol / l孵化柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)和抗原检索进行高温。阻断内源性氧化物酶3%后H2O2在室温下10分钟,CC部分与anti-TAB2孵化(Proteintech 1: 200年,14410 - 1 - ap - 50 μl)和anti-SOX2(1: 200年,Abcam ab97959 - 100 μ一夜之间g)在4°C。然后,他们孵化与辣根过氧化物酶(合)标记rabbit-goat室温1 h。积极的表达TAB2和SOX2由3,3 ′ -diaminobenzidine (DAB)染色方案。

包含IHC染色强度( 我 )得分为0(负面),1(弱),2(中)或3(强)的成绩。积极的百分比染色细胞( P )得分为0(负面),1(≤10%),2(11% - -50%),3(51% - -75%),或4(> 75%)的成绩。包含IHC得分 问 = P × 我 ,在这 P 是积极细胞的百分比吗 我 是包含IHC染色强度。

 2.11。RNA序列

Siha细胞RNA序列和Siha球体。简而言之,总RNA中每个样本收集1毫升的试剂盒进行进一步分析。然后,总RNA的质量和纯度检测到nano - 300。根据Illumina公司协议,cDNA图书馆是由RNA样本执行Illumina公司paired-end (PE)测序2000年Illumina公司HiSeq (Illumina公司,圣地亚哥,CA)平台。Paired-end读取(2100个基点)生产的大脑生物信息学有限公司有限公司(中国,北京)。

 2.12。球体形成化验

后,之前的方法( 11),干细胞中包含 3 × 10 3 细胞/毫升放入6-well超低板和孵化为1 - 2周37°C公司为5%2。干细胞媒体媒介应该每两天更换一次。后形成的球体,他们被消化成单个球体与0.25% trypsin-EDTA和捕获在显微镜下计数。六代球体形成后,我们得到了一组细胞更具备干细胞,名叫Siha球体。球形细胞集群大于75 μ米直径被认为是球体形成二者的自我更新。

 2.13。统计分析

未配对的学生 t 以及用于确定统计学意义。数据被表示为 的意思是 ± 标准 偏差 。数学分析的结果是由GraphPad Prism 8.0。

 3所示。结果 3.1。Siha球面显示高架CSC-Like属性

之前的研究表明,二者可以选择性地富集在肿瘤细胞( 12, 13]。肿瘤领域形成实验被认为是理想的方法来检测细胞自我更新的特点。CC细胞在无血清培养基上播种适合肿瘤领域的增长。我们比较的sphere-forming效率第六代球体与原细胞系和证明二者sphere-forming更高效率在CC细胞(数据丰富 1(一)和 1 (b))。一致的结果在随后的免疫印迹试验发现的蛋白质含量更高BMI1和SOX2在Siha发现球体比Siha细胞(图 1 (c))。

具备干细胞细胞的能力维护Siha范围显著高于父母的细胞。(a)球面形成能力显著增强在Siha领域组相比Siha组。(b)的富集肿瘤干细胞在Siha领域显著增强的球体形成效率组相比Siha组。(c)进行免疫印迹检测蛋白质含量SOX2和BMI1 Siha细胞和Siha球体。

 3.2。TAB2癌细胞具备干细胞有关

探讨二者的分子机制在调节CC的进展,RNA序列确定下游执行机制Siha球体和Siha细胞。差异表达基因(度)被分成upregulation集差别不显著(non-sig),对这些火山散点图(图的描述 2(一个))。KEGG富集分析表明,表达下调基因具备干细胞选择性地富集在一系列的监管途径,肿瘤发生、发展途径;其中,PI3K-AKT信号通路被发现是最丰富(图 2 (b))。此外,一些代表性的致癌特性,如肿瘤坏死因子(TNF)信号转导和转化生长因子- βSiha统计上丰富的球体,这表明二者可能调节肿瘤发生,扩散、转移,化疗抵抗的CC(图 2 (c))。TAB2筛选出来的下游分子高表达基因集,因为它是参与途径。人类的蛋白质图谱数据显示TAB2调节在CC组织与正常组织相比(图 2 (d))。随后,发现TAB2显著负相关与CC患者的总体生存在癌症基因组图谱(TCGA)数据库(图 2 (e))。母星数据库被用来分析TAB2和古典的coexpression具备干细胞分子(BMI1和SOX2) 306年宫颈鳞状细胞癌样本。发现TAB2的表达水平与BMI1呈极显著的正相关关系,在宫颈鳞状细胞癌样本,与以前的数据(图也是一致的 2 (f))。

下一代测序和信息学手段分析。(一)度被火山散点图显示。(b) KEGG浓缩度的分析。(c) GSEA显示相关通路由TAB2监管。(d)人类的蛋白质图谱数据集呈现TAB2在正常的表达和宫颈癌组织。(e) kaplan meier分析宫颈癌患者的总生存期( n = 292年 )。患者分为高低组根据截止TCGA的TAB2数据库。(f) Coexpression TAB2和SOX2基于数据的分析从母星。(g) Coexpression分析TAB2和BMI1之间根据来自母星的数据。

 3.3。TAB2和SOX2在CC的病人

进一步验证TAB2的调控机制在CC调节二者的特点,积极表达TAB2和具备干细胞标记分子CC患者体内被包含IHC染色检查。因为BMI1和SOX2 CCSCs的主要标志,我们调查了他们的表达模式在CC的部分。积极的表达TAB2、BMI1 SOX2在CC的部分都明显高于与正常组织相比(图 3(一个))。为进一步澄清TAB2体外的功能,我们选择4 CC细胞系和1正常细胞系的表达水平来确定TAB2通过免疫印迹和RT-qPCR试验(数字 3 (b)和 3 (c))。接下来,Siha和MS751细胞系被选为进一步功能研究。

TAB2在宫颈癌的表达。(a)包含IHC染色显示积极的表情TAB2和SOX2在宫颈癌相当高。(b)的mRNA表达TAB2在宫颈癌细胞系被qPCR实验测试。(c)的蛋白质水平TAB2不同宫颈癌细胞系。

 3.4。可拆卸的CC TAB2抑制CSC-Like属性

基于上述结果,我们下一个调查的潜在影响TAB2 CSC-like属性在CC细胞。首先,我们验证的转染疗效TAB2核蛋白质水平(数字 4(一)和 4 (b))。stemness-related蛋白的蛋白质含量在CC细胞干预TAB2被检测到。结果表明,击倒的TAB2 Siha MS751细胞显著下调BMI1 SOX2。击倒的TAB2 Siha MS751细胞显著下调sphere-forming效率(数字 4 (c)- - - - - - 4 (e))。此外,乙醛脱氢酶(ALDH)活动,二者的可靠标记,由TAB2 CC细胞测定( 14, 15]。ALDH活动显著降低在CC细胞转染si-TAB2比消极的控件(数字 4 (f)和 4 (g))。因此,我们认为TAB2 CC维持自我更新的细胞具有重要意义。

TAB2击倒抑制宫颈癌细胞的具备干细胞。(a)蛋白质含量SOX2和BMI1被击倒后免疫印迹检测TAB2 Siha细胞。(b)蛋白质含量SOX2和BMI1被击倒后免疫印迹检测TAB2 MS751细胞。(c) TAB2击倒抑制球面形成Siha和MS751细胞的效率。(d) TAB2击倒在Siha细胞球体形成的抑制能力。(e) TAB2击倒在MS751细胞球体形成的抑制能力。(f) ALDEFLUOR工具被用来评估ALDH的比例br与TAB2 Siha细胞干预。具备干细胞(g)的能力维护MS751细胞被ALDEFLUOR评估工具。

 3.5。击倒的TAB2体外抑制<斜体> < /斜体> CC细胞的恶性表型

癌细胞通常表现为不受控制的扩散,避免生长抑制、抗细胞凋亡,活跃的入侵和转移( 16]。进一步揭示TAB2 CC细胞的功能作用,我们研究了CC细胞增殖变化通过克隆形成试验和CCK-8测定TAB2击倒。结果表明,击倒的TAB2 Siha MS751细胞显著抑制克隆形成和细胞增殖的能力(数据 5(一个)- - - - - - 5 (c), 5 (e))。Siha和MS751细胞的细胞周期分布通过流式细胞术,检测结果显示,击倒的TAB2减少了在S期细胞的比例分布,这与抑制细胞生长(数据是相一致的 5 (d)和 5 (f))。此外,Transwell试验表明,击倒TAB2 CC细胞(数据的迁移能力降低 5 (g)和 5 (h))。随后,细胞凋亡被确认在CC加速细胞TAB2击倒(数字 5(我)和 5 (j))。总之,这些结果表明TAB2施加一个关键的角色在增殖,凋亡,CC细胞的迁移。

TAB2击倒抑制CC细胞的生物功能。(a)殖民地数量与siTAB2-1 Siha细胞转染,siTAB2-2或siNC集落形成试验探测到。(b)殖民地数量与siTAB2-1 MS751细胞转染,siTAB2-2或siNC集落形成试验探测到。(c)细胞的可行性与siTAB2-1 Siha细胞转染,siTAB2-2或siNC CCK-8分析探测到。(d)细胞周期分布与siTAB2-1 Siha细胞转染,siTAB2-2或siNC细胞周期检测到的设备。(e)细胞的可行性与siTAB2-1 MS751细胞转染,siTAB2-2或siNC CCK-8分析探测到。(f)细胞周期分布与siTAB2-1 MS751细胞转染,siTAB2-2或siNC细胞周期检测到的设备。(g)迁移与siTAB2-1 Siha细胞转染,siTAB2-2或siNC Transwell分析探测到。(h)迁移与siTAB2-1 MS751细胞转染,siTAB2-2或siNC Transwell分析探测到。(i)与siTAB2-1 Siha转染细胞的凋亡率,siTAB2-2或siNC流式细胞仪探测到。 (j) The apoptotic rate of MS751 cells transfected with siTAB2-1, siTAB2-2, or siNC detected by flow cytometry.

 4所示。讨论

现有的研究已经证明,lncRNAs, microrna mrna调节二者的各类具备干细胞( 16- - - - - - 18]。Stemness-related途径能够改变生物功能的癌细胞增殖、迁移、入侵和耐药性。目前,二者在CC的机制基本上仍未知尽管许多分子与干细胞相关通路在CC已确定。在我们的研究中,Siha球体与高度表达CSC标记被发现促进CC的迅速发展,显示在CC病人预后的潜力。因此,CC干细胞可能是有前途的治疗目标是应用于临床实践。

这里,我们详细记录在CC TAB2干细胞的调节机制。TAB2已被证明在激活扮演关键角色的NF - κB通路通过绑定polyubiquitin链( 19]。重要的是,激活NF - κB信号通路在肿瘤发生[已有详细记载 20.),维护CSC茎状的属性( 21]。一致,我们GSEA RNA-seq结果表明,调节基因在Siha领域显著相关肿瘤stemness-related通路。因为TAB2重视调节癌症干细胞,我们分析了CC的预后潜力。数据从数据库,TCGA表明TAB2消极与CC患者的总生存期有关。值得注意的是,我们发现TAB2 BMI1的mRNA水平呈极显著的正相关关系,和SOX2 CSC-related分子。先前的研究显示,BMI1和SOX2涉及增加肿瘤的恶性转化和攻击性( 22, 23]。BMI1参与CC的致癌作用通过上调SOX2 [ 24]。更具体地说,我们表明,击倒TAB2显著下调BMI1 SOX2在信使rna和蛋白质水平,这是符合减少CSC属性在CC细胞TAB2击倒 在体外。与此同时,我们发现TAB2中介所必需的高增殖率和CC细胞凋亡率低。综上所述,这些研究结果支持这一事实TAB2促进了CC的发病机理通过调节CSC具备干细胞途径。因此,我们的研究提供了一个更深刻的理解TAB2 CC。

总之,我们的研究结果揭示TAB2的作用在调节CSC在CC途径。TAB2促进CC通过激活stemness-related通路的发展。虽然需要进一步的研究来发现TAB2的致癌机制,我们当前的研究奠定了基础在人类癌症发展更好的治疗策略。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81874102和81874102号Shuzhong么,嘉明黄81902627,和81802599刘天宇),科技项目广州Shuzhong姚(202002020043),5010年中山大学临床研究基金会项目Shuzhong姚(2017006),广东省自然科学基金(2017号a030313509王伟(音译)和2021 a1515011776, 2018 a0303130190到嘉明黄),中山大学第一附属医院本科教学改革研究项目(没有王伟(音译),31911130 - 200437年)。

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