Pluripotency-State-Dependent Dax1在胚胎干细胞自我更新的作用

文摘

Dax1(也称为Nr0b1)被认为是转录因子网络的一个重要组成部分在小鼠胚胎干细胞(ESCs)。然而,分子机制的作用和Dax1不同多能性状态的维护是知之甚少。在这里,我们构建了一个稳定Dax1基因敲除(KO)细胞系使用CRISPR / Cas9系统分析Dax1的确切功能。我们报道了2 i / LIF-ESCs Dax1表达明显低于生活/ serum-ESCs。Dax1KO ES细胞系可以成立于2 i /生活和他们的多能性是证实。相比之下,Dax1-null ESCs不能持续一段生活/血清由于严重的分化和细胞凋亡。在生活/血清,核心模块和Myc模块的活动明显减少,而PRC2模块Dax1KO后被激活。大多数proapoptotic基因的表达和lineage-commitment基因都大大增加,而抗凋亡基因的表达下调表达,许多观察多能性基因。我们研究的多功能依赖作用Dax1提供线索理解的分子调控机制在早期胚胎发育的不同阶段。

1。介绍

Dax1 (Dosage-sensitive性reversal-adrenal发育不全先天性x染色体上的基因1)已建议生殖开发中扮演着重要角色,性别决定,类固醇生成和肿瘤发生。最近,Dax1被确定为一个核心成员的多能性基因调控网络(1,2]。过度的Dax1支持鼠标的ESCs LIF-independent自我更新(3),而击倒Dax1核/成分或Dax1基因敲除使用Cre-lox系统诱导分化的ESCs [2- - - - - -7]。Dax1可以抑制胚胎外的内胚层分化通过绑定Gata6并抑制其转录启动子,可以抑制滋养外胚层分化与Oct4(独立或合作3]。建议Dax1、Nanog在平行于维持一个最佳的多能性状态(3]。此外,两个独立的报告确认多能性诱导[Dax1是必要的3,8]。然而,所有调查有关的角色Dax1在ESCs培养多能性的维护进行了血清和生活(补充表1)。

各种培养条件允许捕获不同的多能性状态的老鼠的ESCs体外。ESCs生长在血清和生活被称为“传统”的ESCs,其中包括的所有阶段的ESCs从天真到形成和/或待发状态。因此,ESCs的传统表现出异质性和亚稳度9]。最近的研究表明,ESCs也可以保持在无血清N2B27中补充了两种小分子抑制剂(我),GSK3抑制剂CHIR99021, MEK抑制剂PD0325901。2我/ LIF-ESCs似乎均匀,有不同的基因表达谱和表观基因组ESCs的传统,这是假定代表多能性的基态(10]。自不同的多能性状态为特征和由不同的转录网络,每个转录因子可能优先维持一个独特的多能性状态(11,12]。然而,只有少数转录因子(如Klf2和Myc)相比,他们的功能特征在不同的多能性状态。它仍然是难以捉摸的Dax1是否有类似的功能在基态的ESCs ESCs的传统。和Dax1撤军的影响pluripotency-associated转录因子网络不是很透彻了。

在这里,我们建立了一个稳定Dax1-knockout (KO)细胞株的影响和分析Dax1KO多能性的细胞表型和基因调控网络生活/血清和2 i /生活的条件下,分别。我们的研究结果显示,Dax1的作用依赖于多能性状态。

2。结果

2.1。表达模式的分析,在鼠标的ESCs Dax1

公开可用RNA-seq化验的第一天的胚胎发育表明Dax1表达式见顶的ICM E4.0(图S1)。一致,Dax1表示在未分化的ESCs的高水平,但不是在(EpiSCs)和外胚层干细胞分化的ESCs [13]。在这里,我们调查的表达是否Dax1 ESCs的各种培养条件的影响。免疫印迹显示ESCs的Dax1蛋白水平在2 i /生活明显低于生活/血清(图1(一))。的转录水平Dax1被存在进一步验证。ESCs生活/血清条件表示最高Dax1信使rna,而ESCs 2 i /生活表达水平降低(图6.4倍1 (b))。Dax1蛋白质和mRNA水平被察觉或表示在非常低浓度的样品EpiSCs和拟胚体(EB)。这些结果表明Dax1的表达是受不同阶段的多能性,和Dax1的减少在基态多能性调控在转录水平。

2.2。建立Dax1KO ES细胞系2我/生活条件下

这是证明Dax1基因敲除的外显子的替代抗生素选择标记盒式未能生成未分化的ESCs生活/血清[4]。然而,更低的表达水平Dax1 2 i /生活条件强烈建议不重要的角色在基态的ESCs Dax1(图1)。确认这种可能性,并进一步分析的功能角色Dax1、CRISPR / Cas9编辑系统是用于生产Dax1基因敲除(KO)两个条件的ES细胞系(数字2(一个)和2 (b))。目标后,ESCs镀在低密度,和Dax1个别殖民地被西方墨点法分析(图验证2 (c))。2我/生活条件,4 Dax1KO细胞殖民地被确定(Dax1KO-7, -10, -13, -23)从26个殖民地(图2 (d)),其中Dax1KO-7用于后续功能实验。在生活/血清,然而,我们没有获得Dax1KO细胞集落虽然Dax1的表达是减少一些殖民地(图2 (d))。这个结果证实Dax1 ESCs生存生活/血清是必要的。

排除可能的脱靶效应Dax1KO,救援细胞系生成通过引入Dax1 Dax1KO-null细胞(图表达载体2 (e))。我们确定了细胞集落,名叫Dax1KO / R, Dax1表达水平接近的控制(图2 (c))。

2.3。ESCs Dax1至关重要的自我更新传统的但我是可有可无的2 / LIF-ESCs

比较的功能能力Dax1多能性在不同的州,基本特征是在Dax1KO-ESCs 2 i /生活和生活/血清条件下。2 i /生活,集落形成试验表明,形状和数量的殖民地Dax1KO细胞一样控制细胞,但规模小一点(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。长期传播试验表明Dax1KO细胞可以不断通过在四个星期虽然增长速度略有下降(图3 (d))。一致,fluorescence-activated细胞分类分析(流式细胞仪)表明,Dax1KO细胞的凋亡率只是略有增加(图3 (e))。

相比之下,Dax1KO细胞呈现分化表型大量细胞死亡时从2 i /生活的生活/血清转移条件(图3(一个))。形成的殖民地Dax1KO细胞的比例更小,AP-positive殖民地(未分化的殖民地)显著降低(数字3 (b)和3 (c))。Dax1KO细胞不能通过不断在生活/血清培养基(图3 (d))。Dax1KO细胞的凋亡比例,甚至第一段从2 i /生活,是明显超过25%(图3 (e))。先前的研究表明,Dax1击倒引起显著积累尤文氏瘤细胞的细胞周期G1期(14]。然而,我们的研究结果表明,在G1期细胞的比例并没有改变(图3 (f)),这是与另一个先前的数据(包括7]。

正如预期的那样,这样的杀伤力Dax1KO完全获救的reexpression Dax1 (Dax1KO / R),这表明gene-specific Dax1(数据的影响3(一个)- - - - - -3 (f))。综上所述,我们的结果表明,Dax1可有可无的基态的ESCs的自我更新,但Dax1KO细胞极易分化和细胞凋亡在传统文化条件。

2.4。Dax1KO引起更激烈的全球转录变化在传统比基态的ESCs的ESCs

确定机制的不同表型Dax1KO不同多能性状态,我们比较了全球Dax1KO细胞的转录概况2 i /生活和生活/血清下RNA-seq分析。散点图显示Dax1KO细胞的差异表达基因(度)比野生型的ESCs(图4(一)补充表3)。两个条件之间的重叠度在Dax1KO细胞是维恩图解(图所示4 (b),图S4a)。度是由生成的功能分类浓缩映射网络的基因本体论(去)(图4 (c)补充表4)。

2 i /生活,总共有3638度被发现在Dax1KO细胞相比,控制(> 1.2折, ),1657 1981个基因和基因表达下调,分别。去分析证明度在173年显著富集基因集包括“发展过程”、“细胞增殖”、“信号通路”,“代谢过程”,“细胞组件组织或生源论”,“本地化和运动”(> 1.2折, )。然后,我们使用更严格的筛选标准的褶皱变化> 2和罗斯福值< 0.05来识别不同表达基因。度在2我的总数/生活是1131,596 535个基因和基因表达下调,分别。基因集富集度只有34属于“发展过程”,“细胞组件组织或生源论”和“定位和运动”(红点在图4 (c))。这可能表明大多数度与自我更新造成Dax1KO 2 i /生活不发生剧烈变化(< 2折)。

生活/血清,度远远高于2 i /生活。有5124度(> 1.2折, ),其中2818基因调节,2306个基因表达下调和1977度(> 2折, ),其中1212基因调节和765个基因表达下调,分别。去分析了度在422年和113年明显丰富基因集(分别为> 1.2倍或2折),更比2 i /生活。符合更严重Dax1KO细胞分化表型,度明显丰富的开发过程,包括“神经元分化”、“胚胎发展”、“心血管系统开发”,“器官发展”、“多细胞有机体的发展”,和“乳腺小叶发展”(> 2折, )。只有267重叠度Dax1KO细胞在两种培养条件下,其中136共享调节基因和78共享表达下调基因(> 2折, )。

2.5。Dax1KO影响转录网络(模块)在不同的多能性状态

全基因组转录分析表明,多能性监管网络可以分为三个相对独立的模块:模块为核心的多能性因素(核心模块),Polycomb复杂因素(中华人民共和国模块),Myc-related因素(Myc模块)(15在传统的ESCs。而转录组比较显示,核心模块可能是在我的ESCs同样重要,2我的ESCs的影响低Myc基因表达水平和PRC2的功能可能在2我的ESCs[冗余16,17]。

Dax1KO的影响在这三个模块进行了分析生活/血清和2 i /生活条件。Dax1KO之后,活动的核心模块是降低两种培养条件下(图5(一个))。和表达下调基因与ChIP-target Dax1KO细胞高度相关的基因的核心模块成员(图5 (b))。Dax1表达导致的损失下降Myc模块活动和表达下调的基因与ChIP-target Dax1KO细胞相关基因的Myc模块成员生活/血清条件下(数字5(一个)和5 (b))。中华人民共和国活动模块增加但生活/血清条件下减少2 i /生活(图5(一个))。不断的调节和表达下调基因Dax1KO细胞与PRC2 ChIP-target基因的生活/血清和2 i /生活,分别(图5 (b))。在一起,建议的影响在这些ESC Dax1KO模块依赖于多能性状态。

2.6。验证Dax1KO后Self-Renewal-Related基因的表达

Dax1KO pluripotency-associated转录因子网络的影响促使我们进一步分析单个基因的表达改变诱导Dax1KO。2 i /生活,proapoptotic基因的表达略有增加,而抗凋亡基因的表达,多数pluripotency-related基因,内胚层标记没有显著变化。和不一致的更改在其他血统基因观察(图的承诺6(一))。在生活/血清,大多数proapoptotic基因的表达是大大增加,而抗凋亡基因和许多多能性基因表达下调。大多数家族承诺以外胚层标记基因调节Dax1KO后(图6(一))。然后我们验证关键基因的表达存在,结果是符合我们RNA-seq数据(图6 (b))。

3所示。讨论

减少表达Dax1报道引起传统ESCs分化,表明Dax1在自我更新的重要作用5,6]。虽然这些研究是基于的表型观察Dax1的瞬变抑制。在这项研究中,我们建立了一个稳定Dax1KO细胞系使用CRISPR / Cas9系统,发现Dax1基因敲除的ESCs分化和死亡引起的。因此,我们的结果证实了之前的研究和扩展,连续的表达Dax1需要维护的ESCs的多能性的生活/血清。

Dax1似乎是传统的ESCs的核心多能性电路的关键(1,2,18),但损失的影响函数的Dax1 pluripotency-associated转录因子网络没有很好地分析。传统的ESCs的转录调控网络可以细分为不同的单位基于物理绑定的蛋白质和DNA。核心模块主要包括基因与发育和transcription-associated过程,和Myc模块包含目标主要是参与细胞代谢,细胞周期和蛋白质合成途径。中华人民共和国模块的主要作用是trimethylate H3K27并导致目标基因沉默(15,19,20.]。Dax1被视为pluripotency-associated因素,属于核心模块。这里,我们报道,Dax1KO不仅造成显著减少的活动的核心模块,但也减少了活动Myc模块和激活发育基因的表达被PRC2沉默。这个建议功能之间的联系三个相对独立的模块,和Dax1可能发挥重要作用。先前的研究显示,原癌基因的转录上调可以Polycomb PRC2复杂(21),还有一个转录监管核心模块成员母和原癌基因之间的关系(19]。需要进一步研究揭示Dax1的分子功能在不同的转录调控网络的模块。

目前认为,多能性不是一个单一的实体,而是由一系列的不同细胞状态(9]。ESCs Dax1表达高水平的差异而不是EpiSCs,建议Dax1的表达是受不同的多能性阶段。然而,目前尚不清楚的表达Dax1 2 i / LIF-ESCs不同于ESCs的传统。我们报道,表达式2 i / LIF-ESCs Dax1水平显著降低,并调节发生在转录水平。Dax1表达已被证明是调节生活/ Stat3通路以及Oct4 [22],Nanog, Nr5a2 [23]。然而,这些积极的监管机构Dax1没有显著减少2 i /生活,所以他们不能用来解释Dax1两种培养条件下的微分表达式。2我/生活文化条件下,Gsk3 (Wnt效应的负面调节器β连环蛋白)和MAPK选择性地抑制。早期的研究表明,Dax1表达Wnt信号控制的性腺(24),但生物(GSK-3)的药理抑制剂治疗没有显著调节Dax1表达ESCs培养的生活。MAPK / ERK通路可以通过磷酸化调节蛋白表达水平,导致原癌基因蛋白的稳定性和Klf2蛋白质的降解,分别。但无论MAPK / ERK调节Dax1尚未报道的表达。总的来说,转录抑制的分子基础的Dax1基态的ESCs目前不是很清楚。

积累的证据表明,ESCs的2我/生活代表着天真的外胚层细胞内细胞团(ICM)甚至更早的阶段,虽然传统的ESCs可能反映后期。2我/生活和生活/血清ESCs随处可互换的,它们提供了一个独特的和可访问的体外模型,探索监管的pre - postimplantation早期胚胎发育的阶段。近年来,它已成为明显的转录组,表观基因组,methylome 2我/生活和生活/血清ESCs是明显不同的。然而,单个基因的特性在不同多能性状态的研究还很有限。我们报道的殖民地Dax1KO细胞系可以通过至少30次2 i /生活(数据未显示),没有形态变化与控制细胞相比,这是完全不同的,在生活/血清。这表明这两个Dax1多能性状态有不同的要求,和Dax1自我更新2 i / LIF-ESCs可有可无的。

提供更多的洞察Dax1函数,我们发现Dax1KO ESCs是否可以适应生活/血清补充2我抑制剂,PD0325901 (PD)和/或CHIR99021 (CH)。Dax1KO ESCs很少形成紧凑的殖民地生活/血清,而形成不规则的扁平的殖民地生活/血清(LS) + PD。在LS + CH,紧凑的殖民地的数量明显高于生活/血清,但仍有一些差异化的殖民地。只有在LS + 2我Dax1KO ESCs可能形成紧凑的殖民地与正常控制(图类似S2a)。细胞计数结果表明,PD和CH可以促进Dax1KO ESCs的扩散,和CH的扩散效应更明显(图开通)。上述结果表明,Dax1可能不会直接调解ERK和Wnt通路的影响。

根据前面的ChIPseq结果(1,25),目标基因的转录调控下Dax1推导。这些假定的目标基因表现出更少的活动相比,2我/生活/压抑生活/血清Dax1KO后(图S3)。分析表明,267重叠度(> 2折, )2 i /生活和生活/ Dax1KO的血清(图4 (b),图S4a)在基因集富集包括“开发过程”和“细胞增殖”(图S4b)。只有一些重叠度假定的目标Dax1基因(图自己)。这表明,除了转录调控,Dax1通过其他方式也会影响基因的表达。

ESCs的核心模块是确定在传统,但全基因组ChIP-Seq本地化研究这些蛋白质在2 i / LIF-ESCs尚未执行。Dax1KO引起显著减少的活动核心模块2 i / LIF-ESCs以及在传统的ESCs,但它不是伴随着自我更新受损的表型在2 i /生活。建议ESCs的核心模块识别常规不重要或模块的构成是不同的在2 i /生活。

总之,本研究的结果表明,产生的细胞表型和分子表型Dax1KO生活/血清和2 i / ESCs生活讲究的是明显不同的。这可能反映了传统的不同的细胞命运决定机制的ESCs和基态的ESCs。Dax1是一种癌基因,但其表达模式在癌症的发展过程中已经显示出差异在不同类型的癌症。我们的研究不仅对理解的分子调控机制提供了线索在早期胚胎发育的不同阶段,也有利于更好地理解Dax1在不同肿瘤的作用。

4所示。材料和方法

4.1。细胞培养

鼠标的ESCs gelatin-coated板上培养0.2%表示介质。生活/文化:血清DMEM补充15%的边后卫,2毫米GlutaMAX, MEM不必要的氨基酸1%,0.1毫米β巯基乙醇(所有从英杰公司)和10 ng / ml的生活(微孔)。2我/生活文化:N2B27中补充了1μM PD0325901 3μM CHIR99021 (Selleck)和10 ng / ml的生活26]。293英尺的细胞在DMEM补充维持10%的边后卫,2毫米GlutaMAX, 1% MEM不必要的氨基酸。

4.2。质粒构建

为CRISPR Cas9-induced Dax1基因敲除(KO),单导RNA针对Dax1设计在翻译起始密码子。以下指导序列(5 - - - - - -acaggagcctcaggccatggcgggtgaggaccacc-3 )克隆在pLentiCas9-Zeocin向量。完整的开放阅读框架Dax1使用引物扩增从小鼠ESC cDNA菌进行基因(转发:GAATTCGGATCCACCATGGCGGGTGAGGACCACC,相反:GGATCCGAATTCTCACAGCTTTGCACAGAGCA)。放大ORF随后克隆到pGEM-T容易(Promega)验证和序列,然后,subcloned pPGK.2AP。

4.3。慢病毒生产

慢病毒载体,pSPAX2 pMD2G cotransfected到293英尺由磷酸钙转染细胞如前所述[3]。总之,12.5μ总混有50 g质粒μl CaCl₂(2.5毫米)和稀释TE缓冲0.5毫升的最后一卷。混合添加一滴一滴地0.5毫升2×HeBS和混合。一分钟后,解决方案是混合并加入一滴一滴地到媒体。8 - 10小时后,介质的改变,病毒收集后续后48 - 72 h栽培。

4.4。代Dax1KO-ESCs

ESCs使胰蛋白酶化和Dax1KO慢病毒感染悬挂的上层清液以及聚凝胺(4μg / ml,σ)。两天后,这些细胞在山肩 细胞每6-well板块和培养15μg / ml zeocin(表达载体)7天。由此产生的殖民地被捡起,扩大,免疫印迹和识别。

4.5。质粒转染

ESCs与质粒转染使用Lipofectamine2000(英杰公司)根据制造商的指示。两天后,细胞培养的1μg / ml嘌呤霉素(英杰公司)获得稳定的转染。

4.6。体外和体内的ESCs的分化

EB的边后卫在培养皿中没有执行形成生活根据先前描述的协议²。

4.7。细胞增殖和集落形成试验

细胞增殖和集落形成实验中使用先前描述的协议²。扩散试验,细胞被镀gelatin-coated 12-well盘子。5天之后,确定可行的细胞。集落形成试验,细胞被镀gelatin-coated 24-well盘子。6天后,美联社积极殖民地测量。殖民地在三个类别:未分化、混合(部分有区别),和分化。

4.8。实时聚合酶链反应分析

总RNA分离试剂盒试剂(表达载体,猫:15596026)如前所述。合成第一链cDNA从1μ克总RNA oligo-dT底漆使用Transcriptor第一链cDNA合成装备(罗氏),用水稀释10倍。实时PCR反应是由于“快速上手”项目的执行至关重要的DNA绿色主(罗氏)使用LightCycler 96系统(罗氏)。qPCR引物补充表2中列出。

4.9。蛋白质提取和免疫印迹

蛋白分离和免疫印迹进行anti-Dax1(活动主题,# 39983)根据先前描述的协议²。

4.10。流式细胞仪分析

凋亡测定,细胞染色膜联蛋白V-APC (BD生物科学)和碘化propidium 10分钟4°C。细胞周期分析,细胞被固定为70%乙醇在一夜之间在-20°C,然后,接受核糖核酸酶和propidium碘(Beyotime) 20分钟37°C。分析了细胞与Novocyte(汽车)。

4.11。RNA-Seq和数据分析

总RNA提取使用试剂盒试剂根据制造商的手册。每两个RNA样本显示细胞系被Genminix Informatic加工有限公司(中国上海)mRNA测序Illumina公司Hiseq平台上(Illumina公司)6 gbps。(度)基因差异表达分析使用DESeq2 (v1.14.1) R统计编程软件包(爱et al ., 2014)。阈值设置为度值< 0.05和绝对的褶皱变化> 1.2或2。表3列出了度补充。基因本体论浓缩度分析都使用了Enrichr网站(补充表4)27]。

4.12。统计分析

统计分析了使用社会科学统计软件包。学生的 - - - - - -测试是用于分析统计差异。数据在数据被表示为 , 被认为是显著的。每个实验进行至少三次。

数据可用性

RNA-seq数据支持这项研究的结果已经存入下的基因表达综合(GEO)加入数字GSE168423。源数据的数据4- - - - - -6提供了如表3和表4补充补充。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

建嵘他和玉达程co-first作者。

确认

这项工作是支持部分由中国国家自然科学基金(31571442,31571442,81702294,81572830,81572885)。

补充材料

图S1: Dax1表达式模式在早期胚胎发育。图S2: Dax1KO ESCs培养在生活/血清补充了MEK抑制剂PD0325901 GSK3和/或抑制剂CHIR99021。图S3: Dax1目标基因的微分表达式2 i /生活和生活/血清。图S4:分析引起的重叠度Dax1KO 2 i /生活和生活/血清。表S1:之前报道Dax1的ESCs丧失分析。表S2:引物进行rt - pcr分析。表S3:度RNA-seq分析(PDF格式)。表S4:去注释富集分析(PDF格式)。(补充材料)

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