SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/5522723 5522723 研究文章 Pluripotency-State-Dependent Dax1在胚胎干细胞自我更新的作用 他 建 1 2 程 璧 2 阮 杨ydF4y2Ba 2 王 秦文君 2 田 砚平 2 王 嘉奇 2 王 Fengsheng 2 张 程ydF4y2Ba 2 徐 Yixiao 2 3 刘 Lianlian 2 余 孟 2 王 Jiangjun 2 赵 Binyu 2 张 悦 2 3 杨 易 4 刘 高科 2 吴 魏 5 他 平 6 熊 ( 4 https://orcid.org/0000 - 0002 - 6602 - 8247 黄 他 1 https://orcid.org/0000 - 0003 - 3344 - 759 x 张 Junlei 2 江ydF4y2Ba 鲁伊 2 Zimmerlin 卢多维奇 1 美国麻醉学 第二附属医院 重庆医科大学 重庆400010 中国 cqmu.edu.cn 2 干细胞与发育生物学的实验室 组织学与胚胎学 军队医科大学 重庆400038 中国 tmmu.edu.cn 3 西南医院/西南眼科医院 第一军医大学附属医院 重庆400038 中国 4 基础医学实验中心 基本医疗科学学院 军队医科大学 重庆400038 中国 tmmu.edu.cn 5 胸外科部门 西南医院 第一军医大学附属医院 重庆400038 中国 xnyy.cn 6 心脏外科部门 西南医院 第一军医大学附属医院 重庆400038 中国 xnyy.cn 2021年 10 7 2021年 2021年 9 3 2021年 18 5 2021年 14 6 2021年 10 7 2021年 2021年 版权©2021年建他et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Dax1(也称为Nr0b1)被认为是转录因子网络的一个重要组成部分在小鼠胚胎干细胞(ESCs)。然而,分子机制的作用和Dax1不同多能性状态的维护是知之甚少。在这里,我们构建了一个稳定Dax1基因敲除(KO)细胞系使用CRISPR / Cas9系统分析Dax1的确切功能。我们报道了2 i / LIF-ESCs Dax1表达明显低于生活/ serum-ESCs。Dax1KO ES细胞系可以成立于2 i /生活和他们的多能性是证实。相比之下,Dax1-null ESCs不能持续一段生活/血清由于严重的分化和细胞凋亡。在生活/血清,核心模块和Myc模块的活动明显减少,而PRC2模块Dax1KO后被激活。大多数proapoptotic基因的表达和lineage-commitment基因都大大增加,而抗凋亡基因的表达下调表达,许多观察多能性基因。我们研究的多功能依赖作用Dax1提供线索理解的分子调控机制在早期胚胎发育的不同阶段。

 中国国家自然科学基金 81572885 81572830 81702294 31601108 31571442 1。介绍

Dax1 (Dosage-sensitive性reversal-adrenal发育不全先天性x染色体上的基因1)已建议生殖开发中扮演着重要角色,性别决定,类固醇生成和肿瘤发生。最近,Dax1被确定为一个核心成员的多能性基因调控网络( 1, 2]。过度的Dax1支持鼠标的ESCs LIF-independent自我更新( 3),而击倒Dax1核/成分或Dax1基因敲除使用Cre-lox系统诱导分化的ESCs [ 2- - - - - - 7]。Dax1可以抑制胚胎外的内胚层分化通过绑定Gata6并抑制其转录启动子,可以抑制滋养外胚层分化与Oct4(独立或合作 3]。建议Dax1、Nanog在平行于维持一个最佳的多能性状态( 3]。此外,两个独立的报告确认多能性诱导[Dax1是必要的 3, 8]。然而,所有调查有关的角色Dax1在ESCs培养多能性的维护进行了血清和生活(补充表1)。

各种培养条件允许捕获不同的多能性状态的老鼠的ESCs体外。ESCs生长在血清和生活被称为“传统”的ESCs,其中包括的所有阶段的ESCs从天真到形成和/或待发状态。因此,ESCs的传统表现出异质性和亚稳度 9]。最近的研究表明,ESCs也可以保持在无血清N2B27中补充了两种小分子抑制剂(我),GSK3抑制剂CHIR99021, MEK抑制剂PD0325901。2我/ LIF-ESCs似乎均匀,有不同的基因表达谱和表观基因组ESCs的传统,这是假定代表多能性的基态( 10]。自不同的多能性状态为特征和由不同的转录网络,每个转录因子可能优先维持一个独特的多能性状态( 11, 12]。然而,只有少数转录因子(如Klf2和Myc)相比,他们的功能特征在不同的多能性状态。它仍然是难以捉摸的Dax1是否有类似的功能在基态的ESCs ESCs的传统。和Dax1撤军的影响pluripotency-associated转录因子网络不是很透彻了。

在这里,我们建立了一个稳定Dax1-knockout (KO)细胞株的影响和分析Dax1KO多能性的细胞表型和基因调控网络生活/血清和2 i /生活的条件下,分别。我们的研究结果显示,Dax1的作用依赖于多能性状态。

 2。结果 2.1。表达模式的分析,在鼠标的ESCs Dax1

公开可用RNA-seq化验的第一天的胚胎发育表明Dax1表达式见顶的ICM E4.0(图 S1)。一致,Dax1表示在未分化的ESCs的高水平,但不是在(EpiSCs)和外胚层干细胞分化的ESCs [ 13]。在这里,我们调查的表达是否Dax1 ESCs的各种培养条件的影响。免疫印迹显示ESCs的Dax1蛋白水平在2 i /生活明显低于生活/血清(图 1(一))。的转录水平Dax1被存在进一步验证。ESCs生活/血清条件表示最高Dax1信使rna,而ESCs 2 i /生活表达水平降低(图6.4倍 1 (b))。Dax1蛋白质和mRNA水平被察觉或表示在非常低浓度的样品EpiSCs和拟胚体(EB)。这些结果表明Dax1的表达是受不同阶段的多能性,和Dax1的减少在基态多能性调控在转录水平。

Dax1的表达水平2 i / LIF-ESCs远低于生活/ serum-ESCs。(a)免疫印迹分析显示Dax1在ESCs的表达在不同的培养条件。(b)定量实时PCR分析显示Dax1的转录水平在不同的培养条件。数据的平均值 生物 一式三份 ± 标准 错误 的 的 的意思是 扫描电镜 。

 2.2。建立Dax1KO ES细胞系2我/生活条件下

这是证明Dax1基因敲除的外显子的替代抗生素选择标记盒式未能生成未分化的ESCs生活/血清[ 4]。然而,更低的表达水平Dax1 2 i /生活条件强烈建议不重要的角色在基态的ESCs Dax1(图 1)。确认这种可能性,并进一步分析的功能角色Dax1、CRISPR / Cas9编辑系统是用于生产Dax1基因敲除(KO)两个条件的ES细胞系(数字 2(一个)和 2 (b))。目标后,ESCs镀在低密度,和Dax1个别殖民地被西方墨点法分析(图验证 2 (c))。2我/生活条件,4 Dax1KO细胞殖民地被确定(Dax1KO-7, -10, -13, -23)从26个殖民地(图 2 (d)),其中Dax1KO-7用于后续功能实验。在生活/血清,然而,我们没有获得Dax1KO细胞集落虽然Dax1的表达是减少一些殖民地(图 2 (d))。这个结果证实Dax1 ESCs生存生活/血清是必要的。

Dax1KO-ESCs 2我文化的建立。(一)示意图Cas9 / sgRNA目标站点的鼠标Dax1基因位点。sgRNA-targeting序列强调,PAM序列是用红色标注的。(b)的慢病毒为基础的双重U6-sgRNA表达式盒式结构示意图EFS-zeocin的磁带。(c) Dax1和肌动蛋白的表达受到免疫印迹检测。(d) Dax1 cDNA克隆到表达载体携带一个CAG启动子和转录单位内IRES与嘌呤霉素抗性基因。(e) Dax1-null殖民地生活/血清和2我条件下筛选。

排除可能的脱靶效应Dax1KO,救援细胞系生成通过引入Dax1 Dax1KO-null细胞(图表达载体 2 (e))。我们确定了细胞集落,名叫Dax1KO / R, Dax1表达水平接近的控制(图 2 (c))。

 2.3。ESCs Dax1至关重要的自我更新传统的但我是可有可无的2 / LIF-ESCs

比较的功能能力Dax1多能性在不同的州,基本特征是在Dax1KO-ESCs 2 i /生活和生活/血清条件下。2 i /生活,集落形成试验表明,形状和数量的殖民地Dax1KO细胞一样控制细胞,但规模小一点(数字 3(一个)- - - - - - 3 (c))。长期传播试验表明Dax1KO细胞可以不断通过在四个星期虽然增长速度略有下降(图 3 (d))。一致,fluorescence-activated细胞分类分析(流式细胞仪)表明,Dax1KO细胞的凋亡率只是略有增加(图 3 (e))。

属性的Dax1KO-ESCs 2 i /生活和生活/血清文化。(一)形态的殖民地由指定的细胞系。细胞生长在2 i /生活或生活/血清5天。酒吧,100 μm。(b) AP染色的殖民地由指定的细胞系。细胞生长在2 i /生活或生活/血清5天。酒吧,100 μm。(c)比例的殖民地类型形成的细胞。Diff。:分化;Undiff。:未分化。(d)总细胞培养显示的行数多个段落。(e)细胞周期分析显示细胞系的流式细胞仪与propidium碘(PI)染色和比例在每个细胞周期的细胞被显示在图。(f)的细胞凋亡率Dax1KO-ESCs在指定的条件下培养。分析了指数增长的细胞凋亡使用Annexin-V propidium碘。数据(c)——(f)表示为 的意思是 ± 年代 。 d 。 ; n = 3 。

相比之下,Dax1KO细胞呈现分化表型大量细胞死亡时从2 i /生活的生活/血清转移条件(图 3(一个))。形成的殖民地Dax1KO细胞的比例更小,AP-positive殖民地(未分化的殖民地)显著降低(数字 3 (b)和 3 (c))。Dax1KO细胞不能通过不断在生活/血清培养基(图 3 (d))。Dax1KO细胞的凋亡比例,甚至第一段从2 i /生活,是明显超过25%(图 3 (e))。先前的研究表明,Dax1击倒引起显著积累尤文氏瘤细胞的细胞周期G1期( 14]。然而,我们的研究结果表明,在G1期细胞的比例并没有改变(图 3 (f)),这是与另一个先前的数据(包括 7]。

正如预期的那样,这样的杀伤力Dax1KO完全获救的reexpression Dax1 (Dax1KO / R),这表明gene-specific Dax1(数据的影响 3(一个)- - - - - - 3 (f))。综上所述,我们的结果表明,Dax1可有可无的基态的ESCs的自我更新,但Dax1KO细胞极易分化和细胞凋亡在传统文化条件。

 2.4。Dax1KO引起更激烈的全球转录变化在传统比基态的ESCs的ESCs

确定机制的不同表型Dax1KO不同多能性状态,我们比较了全球Dax1KO细胞的转录概况2 i /生活和生活/血清下RNA-seq分析。散点图显示Dax1KO细胞的差异表达基因(度)比野生型的ESCs(图 4(一)补充表3)。两个条件之间的重叠度在Dax1KO细胞是维恩图解(图所示 4 (b),图 S4a)。度是由生成的功能分类浓缩映射网络的基因本体论(去)(图 4 (c)补充表4)。

全球Dax1KO细胞的转录概况2 i /生活和生活/血清文化。差异表达基因(a)散点图显示(度)Dax1 KO比野生型的ESCs培养2 i /生活(左)和生活/(右)血清培养基。灰色的点是不变的基因。彩色点明显,/ Dax1 KO细胞中表达下调的基因与DESeq2 p (adj)≤0.05,褶皱的绝对值变化≥1.2,点的颜色对应于褶皱变化的绝对值(红色高和蓝色是低)。(b)维恩图代表重叠度总(左),调节基因(中),或表达下调基因(右)在Dax1 KO细胞之间2 i /生活和生活/血清培养基。红色的字母显示的数量与绝对的褶皱变化度≥2,和黑色/白色字母显示的数量与绝对的褶皱变化度≥1.2。(c)浓缩映射网络的条件对应于与绝对的褶皱变化度≥1.2(蓝色)或与绝对的褶皱变化度≥2(红色)Dax1 KO和野生型制培养2 i /生活(左)和生活/(右)血清培养基。基因本体论分析了g:分析器和可视化的cytoscape插件:浓缩地图。节点代表条款;边缘连接节点的共同基因。

2 i /生活,总共有3638度被发现在Dax1KO细胞相比,控制(> 1.2折, P < 0.05 ),其中1657 1981个基因和基因表达下调,分别。去分析证明度在173年显著富集基因集包括“发展过程”、“细胞增殖”、“信号通路”,“代谢过程”,“细胞组件组织或生源论”,“本地化和运动”(> 1.2折, P < 0.05 )。然后,我们使用更严格的筛选标准的褶皱变化> 2和罗斯福 P 值< 0.05来识别不同表达基因。度在2我的总数/生活是1131,596 535个基因和基因表达下调,分别。基因集富集度只有34属于“发展过程”,“细胞组件组织或生源论”和“定位和运动”(红点在图 4 (c))。这可能表明大多数度与自我更新造成Dax1KO 2 i /生活不发生剧烈变化(< 2折)。

生活/血清,度远远高于2 i /生活。有5124度(> 1.2折, P < 0.05 ),其中2818基因调节,2306个基因表达下调,1977度(> 2折, P < 0.05 ),其中1212个基因调节,765个基因表达下调,分别。去分析了度在422年和113年明显丰富基因集(分别为> 1.2倍或2折),更比2 i /生活。符合更严重Dax1KO细胞分化表型,度明显丰富的开发过程,包括“神经元分化”、“胚胎发展”、“心血管系统开发”,“器官发展”、“多细胞有机体的发展”,和“乳腺小叶发展”(> 2折, P < 0.05 )。只有267重叠度Dax1KO细胞在两种培养条件下,其中136共享调节基因和78共享表达下调基因(> 2折, P < 0.05 )。

 2.5。Dax1KO影响转录网络(模块)在不同的多能性状态

全基因组转录分析表明,多能性监管网络可以分为三个相对独立的模块:模块为核心的多能性因素(核心模块),Polycomb复杂因素(中华人民共和国模块),Myc-related因素(Myc模块)( 15在传统的ESCs。而转录组比较显示,核心模块可能是在我的ESCs同样重要,2我的ESCs的影响低Myc基因表达水平和PRC2的功能可能在2我的ESCs[冗余 16, 17]。

Dax1KO的影响在这三个模块进行了分析生活/血清和2 i /生活条件。Dax1KO之后,活动的核心模块是降低两种培养条件下(图 5(一个))。和表达下调基因与ChIP-target Dax1KO细胞高度相关的基因的核心模块成员(图 5 (b))。Dax1表达导致的损失下降Myc模块活动和表达下调的基因与ChIP-target Dax1KO细胞相关基因的Myc模块成员生活/血清条件下(数字 5(一个)和 5 (b))。中华人民共和国活动模块增加但生活/血清条件下减少2 i /生活(图 5(一个))。不断的调节和表达下调基因Dax1KO细胞与PRC2 ChIP-target基因的生活/血清和2 i /生活,分别(图 5 (b))。在一起,建议的影响在这些ESC Dax1KO模块依赖于多能性状态。

Dax1KO对信号通路的影响和转录网络(模块)在不同的多能性状态。(a)小提琴情节代表核心的变化,MYC和中华人民共和国模块中基因表达与野生型相比,Dax1 KO制培养2 i /生活和生活/血清中。(b)的热图显示几何 P 值计算基因设置重叠分析基因集之间从ChIP-seq度(Dax1 KO比野生型制培养2 i /生活和生活/血清)。红细胞对应调节度;蓝色细胞对应表达下调度。颜色强度正比于log10 ( P 值)。

 2.6。验证Dax1KO后Self-Renewal-Related基因的表达

Dax1KO pluripotency-associated转录因子网络的影响促使我们进一步分析单个基因的表达改变诱导Dax1KO。2 i /生活,proapoptotic基因的表达略有增加,而抗凋亡基因的表达,多数pluripotency-related基因,内胚层标记没有显著变化。和不一致的更改在其他血统基因观察(图的承诺 6(一))。在生活/血清,大多数proapoptotic基因的表达是大大增加,而抗凋亡基因和许多多能性基因表达下调。大多数家族承诺以外胚层标记基因调节Dax1KO后(图 6(一))。然后我们验证关键基因的表达存在,结果是符合我们RNA-seq数据(图 6 (b))。

Dax1KO后self-renewal-related基因的表达在不同的多能性状态。apoptosis-related基因(a)的热图,pluripotency-associated基因,基因家族承诺在Dax1KO 2 i /生活和生活/血清。(b)中存在的分析表明基因。数据规范化Gapdh和显示相对于ESCs WT(为1.0)。数据被表示为 的意思是 ± SD ; n = 3 。 ∗ P ≤ 0.05 ; ∗ ∗ P ≤ 0.01 。所有 P 使用学生的计算值 t 以及。

 3所示。讨论

减少表达Dax1报道引起传统ESCs分化,表明Dax1在自我更新的重要作用 5, 6]。虽然这些研究是基于的表型观察Dax1的瞬变抑制。在这项研究中,我们建立了一个稳定Dax1KO细胞系使用CRISPR / Cas9系统,发现Dax1基因敲除的ESCs分化和死亡引起的。因此,我们的结果证实了之前的研究和扩展,连续的表达Dax1需要维护的ESCs的多能性的生活/血清。

Dax1似乎是传统的ESCs的核心多能性电路的关键( 1, 2, 18),但损失的影响函数的Dax1 pluripotency-associated转录因子网络没有很好地分析。传统的ESCs的转录调控网络可以细分为不同的单位基于物理绑定的蛋白质和DNA。核心模块主要包括基因与发育和transcription-associated过程,和Myc模块包含目标主要是参与细胞代谢,细胞周期和蛋白质合成途径。中华人民共和国模块的主要作用是trimethylate H3K27并导致目标基因沉默( 15, 19, 20.]。Dax1被视为pluripotency-associated因素,属于核心模块。这里,我们报道,Dax1KO不仅造成显著减少的活动的核心模块,但也减少了活动Myc模块和激活发育基因的表达被PRC2沉默。这个建议功能之间的联系三个相对独立的模块,和Dax1可能发挥重要作用。先前的研究显示,原癌基因的转录上调可以Polycomb PRC2复杂( 21),还有一个转录监管核心模块成员母和原癌基因之间的关系( 19]。需要进一步研究揭示Dax1的分子功能在不同的转录调控网络的模块。

目前认为,多能性不是一个单一的实体,而是由一系列的不同细胞状态( 9]。ESCs Dax1表达高水平的差异而不是EpiSCs,建议Dax1的表达是受不同的多能性阶段。然而,目前尚不清楚的表达Dax1 2 i / LIF-ESCs不同于ESCs的传统。我们报道,表达式2 i / LIF-ESCs Dax1水平显著降低,并调节发生在转录水平。Dax1表达已被证明是调节生活/ Stat3通路以及Oct4 [ 22],Nanog, Nr5a2 [ 23]。然而,这些积极的监管机构Dax1没有显著减少2 i /生活,所以他们不能用来解释Dax1两种培养条件下的微分表达式。2我/生活文化条件下,Gsk3 (Wnt效应的负面调节器 β连环蛋白)和MAPK选择性地抑制。早期的研究表明,Dax1表达Wnt信号控制的性腺( 24),但生物(GSK-3)的药理抑制剂治疗没有显著调节Dax1表达ESCs培养的生活。MAPK / ERK通路可以通过磷酸化调节蛋白表达水平,导致原癌基因蛋白的稳定性和Klf2蛋白质的降解,分别。但无论MAPK / ERK调节Dax1尚未报道的表达。总的来说,转录抑制的分子基础的Dax1基态的ESCs目前不是很清楚。

积累的证据表明,ESCs的2我/生活代表着天真的外胚层细胞内细胞团(ICM)甚至更早的阶段,虽然传统的ESCs可能反映后期。2我/生活和生活/血清ESCs随处可互换的,它们提供了一个独特的和可访问的体外模型,探索监管的pre - postimplantation早期胚胎发育的阶段。近年来,它已成为明显的转录组,表观基因组,methylome 2我/生活和生活/血清ESCs是明显不同的。然而,单个基因的特性在不同多能性状态的研究还很有限。我们报道的殖民地Dax1KO细胞系可以通过至少30次2 i /生活(数据未显示),没有形态变化与控制细胞相比,这是完全不同的,在生活/血清。这表明这两个Dax1多能性状态有不同的要求,和Dax1自我更新2 i / LIF-ESCs可有可无的。

提供更多的洞察Dax1函数,我们发现Dax1KO ESCs是否可以适应生活/血清补充2我抑制剂,PD0325901 (PD)和/或CHIR99021 (CH)。Dax1KO ESCs很少形成紧凑的殖民地生活/血清,而形成不规则的扁平的殖民地生活/血清(LS) + PD。在LS + CH,紧凑的殖民地的数量明显高于生活/血清,但仍有一些差异化的殖民地。只有在LS + 2我Dax1KO ESCs可能形成紧凑的殖民地与正常控制(图类似 S2a)。细胞计数结果表明,PD和CH可以促进Dax1KO ESCs的扩散,和CH的扩散效应更明显(图 开通)。上述结果表明,Dax1可能不会直接调解ERK和Wnt通路的影响。

根据前面的ChIPseq结果( 1, 25),目标基因的转录调控下Dax1推导。这些假定的目标基因表现出更少的活动相比,2我/生活/压抑生活/血清Dax1KO后(图 S3)。分析表明,267重叠度(> 2折, P < 0.05 )的Dax1KO 2 i /生活和生活/血清(图 4 (b),图 S4a)在基因集富集包括“开发过程”和“细胞增殖”(图 S4b)。只有一些重叠度假定的目标Dax1基因(图 自己)。这表明,除了转录调控,Dax1通过其他方式也会影响基因的表达。

ESCs的核心模块是确定在传统,但全基因组ChIP-Seq本地化研究这些蛋白质在2 i / LIF-ESCs尚未执行。Dax1KO引起显著减少的活动核心模块2 i / LIF-ESCs以及在传统的ESCs,但它不是伴随着自我更新受损的表型在2 i /生活。建议ESCs的核心模块识别常规不重要或模块的构成是不同的在2 i /生活。

总之,本研究的结果表明,产生的细胞表型和分子表型Dax1KO生活/血清和2 i / ESCs生活讲究的是明显不同的。这可能反映了传统的不同的细胞命运决定机制的ESCs和基态的ESCs。Dax1是一种癌基因,但其表达模式在癌症的发展过程中已经显示出差异在不同类型的癌症。我们的研究不仅对理解的分子调控机制提供了线索在早期胚胎发育的不同阶段,也有利于更好地理解Dax1在不同肿瘤的作用。

 4所示。材料和方法 4.1。细胞培养

鼠标的ESCs gelatin-coated板上培养0.2%表示介质。生活/文化:血清DMEM补充15%的边后卫,2毫米GlutaMAX, MEM不必要的氨基酸1%,0.1毫米 β巯基乙醇(所有从英杰公司)和10 ng / ml的生活(微孔)。2我/生活文化:N2B27中补充了1 μM PD0325901 3 μM CHIR99021 (Selleck)和10 ng / ml的生活 26]。293英尺的细胞在DMEM补充维持10%的边后卫,2毫米GlutaMAX, 1% MEM不必要的氨基酸。

 4.2。质粒构建

为CRISPR Cas9-induced Dax1基因敲除(KO),单导RNA针对Dax1设计在翻译起始密码子。以下指导序列(5 ′ -acaggagcctcaggccatggcgggtgaggaccacc-3 ′ )是克隆pLentiCas9-Zeocin向量。完整的开放阅读框架Dax1使用引物扩增从小鼠ESC cDNA菌进行基因(转发:GAATTCGGATCCACCATGGCGGGTGAGGACCACC,相反:GGATCCGAATTCTCACAGCTTTGCACAGAGCA)。放大ORF随后克隆到pGEM-T容易(Promega)验证和序列,然后,subcloned pPGK.2AP。

 4.3。慢病毒生产

慢病毒载体,pSPAX2 pMD2G cotransfected到293英尺由磷酸钙转染细胞如前所述[ 3]。总之,12.5 μ总混有50 g质粒 μl CaCl<年代ub>2(2.5毫米)和稀释TE缓冲0.5毫升的最后一卷。混合添加一滴一滴地0.5毫升2×HeBS和混合。一分钟后,解决方案是混合并加入一滴一滴地到媒体。8 - 10小时后,介质的改变,病毒收集后续后48 - 72 h栽培。

 4.4。代Dax1KO-ESCs

ESCs使胰蛋白酶化和Dax1KO慢病毒感染悬挂的上层清液以及聚凝胺(4 μg / ml,σ)。两天后,这些细胞在山肩 1 × 10 3 细胞每6-well板块和培养15 μg / ml zeocin(表达载体)7天。由此产生的殖民地被捡起,扩大,免疫印迹和识别。

 4.5。质粒转染

ESCs与质粒转染使用Lipofectamine2000(英杰公司)根据制造商的指示。两天后,细胞培养的1 μg / ml嘌呤霉素(英杰公司)获得稳定的转染。

 4.6。体外和体内的ESCs的分化

EB的边后卫在培养皿中没有执行形成生活根据先前描述的协议<年代up>2。

 4.7。细胞增殖和集落形成试验

细胞增殖和集落形成实验中使用先前描述的协议<年代up>2。扩散试验,细胞被镀gelatin-coated 12-well盘子。5天之后,确定可行的细胞。集落形成试验,细胞被镀gelatin-coated 24-well盘子。6天后,美联社积极殖民地测量。殖民地在三个类别:未分化、混合(部分有区别),和分化。

 4.8。实时聚合酶链反应分析

总RNA分离试剂盒试剂(表达载体,猫:15596026)如前所述。合成第一链cDNA从1 μ克总RNA oligo-dT底漆使用Transcriptor第一链cDNA合成装备(罗氏),用水稀释10倍。实时PCR反应是由于“快速上手”项目的执行至关重要的DNA绿色主(罗氏)使用LightCycler 96系统(罗氏)。qPCR引物补充表2中列出。

 4.9。蛋白质提取和免疫印迹

蛋白分离和免疫印迹进行anti-Dax1(活动主题,# 39983)根据先前描述的协议<年代up>2。

 4.10。流式细胞仪分析

凋亡测定,细胞染色膜联蛋白V-APC (BD生物科学)和碘化propidium 10分钟4°C。细胞周期分析,细胞被固定为70%乙醇在一夜之间在-20°C,然后,接受核糖核酸酶和propidium碘(Beyotime) 20分钟37°C。分析了细胞与Novocyte(汽车)。

 4.11。RNA-Seq和数据分析

总RNA提取使用试剂盒试剂根据制造商的手册。每两个RNA样本显示细胞系被Genminix Informatic加工有限公司(中国上海)mRNA测序Illumina公司Hiseq平台上(Illumina公司)6 gbps。(度)基因差异表达分析使用DESeq2 (v1.14.1) R统计编程软件包(爱et al ., 2014)。阈值设置为度 P 值< 0.05和绝对的褶皱变化> 1.2或2。表3列出了度补充。基因本体论浓缩度分析都使用了Enrichr网站(补充表4) 27]。

 4.12。统计分析

统计分析了使用社会科学统计软件包。学生的 t 以及用于分析统计差异。数据在数据被表示为 的意思是 ± 年代 。 d 。 , P ≤ 0.05 被认为是显著的。每个实验进行至少三次。

 数据可用性

RNA-seq数据支持这项研究的结果已经存入下的基因表达综合(GEO)加入数字GSE168423。源数据的数据 4- - - - - - 6提供了如表3和表4补充补充。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

建嵘他和玉达程co-first作者。

 确认

这项工作是支持部分由中国国家自然科学基金(31571442,31571442,81702294,81572830,81572885)。

 补充材料

图S1: Dax1表达式模式在早期胚胎发育。图S2: Dax1KO ESCs培养在生活/血清补充了MEK抑制剂PD0325901 GSK3和/或抑制剂CHIR99021。图S3: Dax1目标基因的微分表达式2 i /生活和生活/血清。图S4:分析引起的重叠度Dax1KO 2 i /生活和生活/血清。表S1:之前报道Dax1的ESCs丧失分析。表S2:引物进行rt - pcr分析。表S3:度RNA-seq分析(PDF格式)。表S4:去注释富集分析(PDF格式)。

 金 J。 楚 J。 沈 X。 王 J。 奥尔金 s . H。 一个扩展的转录网络胚胎干细胞的多能性 细胞 2008年 132年 6 1049年 1061年 10.1016 / j.cell.2008.02.039 2 - s2.0 - 40749104852 18358816 王 J。 饶 年代。 楚 J。 沈 X。 Levasseur d . N。 图尼森 t·W。 奥尔金 s . H。 蛋白质相互作用网络的多能性胚胎干细胞 自然 2006年 444年 7117年 364年 368年 10.1038 / nature05284 2 - s2.0 - 33751092246 17093407 张 J。 刘 G。 阮 Y。 王 J。 赵 K。 王ydF4y2Ba Y。 刘 B。 郑 H。 彭 T。 吴 W。 他 P。 胡 f . Q。 江ydF4y2Ba R。 Dax1和Nanog在平行于稳定小鼠胚胎干细胞和诱导多能性 自然通讯 2014年 5 1 10.1038 / ncomms6042 2 - s2.0 - 84923253141 余 r . N。 伊藤 M。 桑德斯 t . L。 露营者 美国一个。 詹姆逊 j·L。 Ahch在性腺发育和配子形成中的作用 自然遗传学 1998年 20. 4 353年 357年 10.1038/3822 2 - s2.0 - 0031796372 9843206 Niakan K·K。 戴维斯 e . C。 Clipsham r . C。 江 M。 德 d·B。 Sulik K·K。 麦凯布 e·R。 小说的角色孤儿核受体Dax1在胚胎发生,不同于类固醇生成 分子遗传学和新陈代谢 2006年 88年 3 261年 271年 10.1016 / j.ymgme.2005.12.010 2 - s2.0 - 33745483831 16466956 Khalfallah O。 卷轴 M。 Barbry P。 Bardoni B。 Lalli E。 Dax-1击倒在小鼠胚胎干细胞诱导多能性和multilineage分化 干细胞 2009年 27 7 1529年 1537年 10.1002 / stem.78 2 - s2.0 - 68049130971 19530134 藤井裕久 年代。 Nishikawa-Torikai 年代。 Futatsugi Y。 这个 Y。 Yamane M。 Ohtsuka 年代。 羽 H。 Nr0b1是一个消极的监管机构 Zscan4c在小鼠胚胎干细胞 科学报告 2015年 5 1 10.1038 / srep09146 2 - s2.0 - 84941563804 Lujan E。 Zunder e·R。 Ng y . H。 Goronzy i . N。 诺兰 g . P。 Wernig M。 早期重组监管机构被未来的隔离和大规模血细胞计数 自然 2015年 521年 7552年 352年 356年 10.1038 / nature14274 2 - s2.0 - 84930224978 25830878 史密斯 一个。 造型的多能性:执行阶段发展的连续体 发展 2017年 144年 3 365年 373年 10.1242 / dev.142679 2 - s2.0 - 85010082168 28143843 应 问:L。 雷 J。 尼克尔斯 J。 Batlle-Morera l 快 B。 Woodgett J。 科恩 P。 史密斯 一个。 胚胎干细胞自我更新的基态 自然 2008年 453年 7194年 519年 523年 10.1038 / nature06968 2 - s2.0 - 44349170450 Yamaji M。 建筑师 J。 哈亚希 K。 太 H。 Yabuta Y。 Kurimoto K。 Nakato R。 山田 Y。 Shirahige K。 斋藤 M。 PRDM14确保天真的多能性通过双重监管的信号和表观遗传途径在小鼠胚胎干细胞 细胞干细胞 2013年 12 3 368年 382年 10.1016 / j.stem.2012.12.012 2 - s2.0 - 84875222965 23333148 Hishida T。 Nozaki Y。 Nakachi Y。 美津浓 Y。 冈崎 Y。 教育津贴 M。 高桥 年代。 Nishimoto M。 奥田硕 一个。 无限自我更新的ESCs通过Myc / Max转录complex-independent机制 细胞干细胞 2011年 9 1 37 49 10.1016 / j.stem.2011.04.020 2 - s2.0 - 79960030545 21726832 Tesar p . J。 整个 j·G。 布鲁克 f。 戴维斯 t·J。 埃文斯 e . P。 麦克 d . L。 加德纳 r . L。 麦凯 r D。 新细胞系小鼠外胚层与人类胚胎干细胞分享定义特征 自然 2007年 448年 7150年 196年 199年 10.1038 / nature05972 2 - s2.0 - 34447528757 17597760 Garcia-Aragoncillo E。 Carrillo J。 Lalli E。 阿格拉 N。 Gomez-Lopez G。 Pestana 一个。 阿隆索 J。 DAX1、EWS / FLI1肿瘤蛋白的直接目标,是一个主要的监管机构尤文氏瘤细胞的细胞循环发展 致癌基因 2008年 27 46 6034年 6043年 10.1038 / onc.2008.203 2 - s2.0 - 53649107137 18591936 金 J。 吸引 a·J。 楚 J。 雪 j·W。 藤原 Y。 金 c·G。 康托尔 答:B。 奥尔金 s . H。 Myc网络占相似性胚胎干细胞和癌症细胞转录程序 细胞 2010年 143年 2 313年 324年 10.1016 / j.cell.2010.09.010 2 - s2.0 - 77957757417 20946988 标志着 H。 Kalkan就“同名同姓 T。 Menafra R。 Denissov 年代。 琼斯 K。 Hofemeister H。 尼克尔斯 J。 克兰兹 一个。 斯图尔特 答:F。 史密斯 一个。 Stunnenberg h·G。 转录和外遗传性基态多能性的基础 细胞 2012年 149年 3 590年 604年 10.1016 / j.cell.2012.03.026 2 - s2.0 - 84860351082 22541430 波伊尔 l。 普拉斯 K。 Zeitlinger J。 Brambrink T。 Medeiros l。 李 t . I。 莱文 美国年代。 Wernig M。 Tajonar 一个。 雷 m·K。 贝尔 g·W。 Otte 答:P。 比达尔 M。 吉福德 d·K。 年轻的 r。 Jaenisch R。 Polycomb复合体抑制发育小鼠胚胎干细胞的监管机构 自然 2006年 441年 7091年 349年 353年 10.1038 / nature04733 2 - s2.0 - 33646882068 李 M。 Belmonte j . C。 基本规则的多能性基因调控网络 自然评论。遗传学 2017年 18 3 180年 191年 10.1038 / nrg.2016.156 2 - s2.0 - 85008400480 28045100 阮 Y。 他 J。 吴 W。 他 P。 田 Y。 肖 l 刘 G。 王 J。 程 Y。 张 年代。 杨 Y。 熊 J。 赵 K。 王ydF4y2Ba Y。 黄 H。 张 J。 江ydF4y2Ba R。 母促进胚胎干细胞的自我更新通过直接原癌基因的转录调控 Oncotarget 2017年 8 29日 47607年 47618年 10.18632 / oncotarget.17744 2 - s2.0 - 85024400238 28548937 Varlakhanova n V。 Cotterman r F。 deVries w . N。 摩根 J。 多纳休 l R。 穆雷 年代。 诺尔斯 B . B。 Knoepfler p S。 _myc_保持胚胎干细胞多能性和自我更新 分化 2010年 80年 1 9 19 10.1016 / j.diff.2010.05.001 2 - s2.0 - 77954142510 20537458 内里 F。 Zippo 一个。 Krepelova 一个。 Cherubini 一个。 Rocchigiani M。 Oliviero 年代。 Myc调节PRC2基因的转录控制胚胎干细胞发育基因的表达 分子和细胞生物学 2012年 32 4 840年 851年 10.1128 / MCB.06148-11 2 - s2.0 - 84856770024 22184065 太阳 C。 Nakatake Y。 Ura所言 H。 船长 T。 羽 H。 Koide H。 横田 T。 干细胞的特异性表达Dax1授予STAT3和Oct3/4胚胎干细胞 生物化学和生物物理研究通信 2008年 372年 1 91年 96年 10.1016 / j.bbrc.2008.04.154 2 - s2.0 - 44649183963 18471437 凯利 诉R。 锤 g D。 LRH-1, Nanog调节Dax1转录在老鼠胚胎干细胞 分子和细胞内分泌学 2011年 332年 1 - 2 116年 124年 10.1016 / j.mce.2010.10.003 2 - s2.0 - 78650520170 20937355 Kawajiri K。 Ikuta T。 铃木 T。 Kusaka M。 Muramatsu表示 M。 Fujieda K。 立花 M。 Morohashi K。 2 LXXLL-motif和激活函数的作用域的亚细胞定位Dax-1 (dosage-sensitive性reversal-adrenal发育不全congenita临界区X染色体,基因1) 分子内分泌学 2003年 17 6 994年 1004年 10.1210 / me.2002 - 0360 2 - s2.0 - 0037841590 12610109 贝克 年代。 李 b K。 Rhee C。 首歌 J。 吸引 a·J。 金 J。 CpG island-mediated全球在小鼠胚胎干细胞基因调控模式 自然通讯 2014年 5 1 5490年 10.1038 / ncomms6490 2 - s2.0 - 84923347365 应 Q.-L。 史密斯 a·G。 定义条件和分化神经承诺 方法酶学 2003年 365年 327年 341年 10.1016 / s0076 - 6879 (03) 65023 - 8 2 - s2.0 - 0346220073 Kuleshov m V。 琼斯 m·R。 Rouillard 答:D。 费尔南德斯 n . F。 段 Q。 王 Z。 Koplev 年代。 詹金斯 s . L。 Jagodnik k . M。 Lachmann 一个。 麦克德莫特 m·G。 蒙泰罗 c, D。 甘德森 g·W。 马'ayan 一个。 Enrichr:一个全面的基因集富集分析web服务器2016年更新 核酸的研究 2016年 44 W1 W90 W97 10.1093 / nar / gkw377 2 - s2.0 - 84987663170 27141961