筛选基因的基因组范围内CRISPR-Cas9促进淘汰赛从天真基于多能性退出

摘要

干细胞和再生医学的两个主要问题是多能性和分化功能细胞或组织的退出。这两个问题的答案对于干细胞的临床翻译和再生医学研究具有重要的价值。虽然打靶的研究已经揭示了多能性维持的真相，但多能性细胞自我更新、增殖和分化成特定细胞系或组织的机制尚未明确。为此，我们充分利用了一项新技术，即基因组规模的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)。作为在基因组特定位点引入有针对性的功能缺失突变的一种有效方法，GeCKO首次能够在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中无偏性地筛选促进多能性退出的关键基因。本研究成功建立了基于GeCKO的模型，筛选了多能性戒断的关键基因。我们的策略包括慢病毒包装和感染技术、慢cas9基因敲除技术、shRNA基因敲除技术、下一代测序技术、基于模型的基因组尺度CRISPR-Cas9敲除分析(MAGeCK分析)、GO分析等。我们的发现为大规模筛选涉及多能性退出的基因提供了一种新的方法，并为细胞命运调控研究提供了一个切入点。

1.介绍

作为一种类型的未分化的原始细胞具有自我更新和多向分化的潜力的多能干细胞可以分化为任何种类的细胞类型中，然后进一步发展为任何组织或器官。多能性是由包含了大量的自动调节回路的转录因子的网络管理。而从多能退出意味着这个非常递归电路的结束，使发育进程和血统的承诺，这是在再生医学，疾病模型，药物筛选，细胞命运调控，个体发育及的领域具有很高的应用价值。目前，大量的研究集中在多能性维持的，而很少看到多能性的出口管制机制。

有许多因素有助于保持多能性。然而，细胞有序退出增殖周期、激活发育过程并最终分化为特定谱系的机制尚不清楚。揭示多能性退出的机制可能有助于发现控制多能性的关键点。平衡增殖和分化，转录因子的水平，包括Oct4,Sox2,Nanog，必须得到很好的控制。这些基因在保持多能性方面起着至关重要的作用。

同时，也需要一定的转录因子来防止多能性基因的过表达或下调。例如，抑制Tcf3(也称为TCF711)会增加的表达Oct4,Nanog，以及其他多能性因子，从而阻止了多能性的退出[1- - - - - -4]。令人惊讶的是，三重删除Etv5,Rbpj,Tcf3破坏ESCs的分化能力，从而使其在自我更新循环中基本未分化，即使存在分化刺激[5]。

此外，p53和Jarid通过抑制Nanog表达诱导多能干细胞分化[6- - - - - -8]。核小体重塑和组蛋白去乙酰化酶复合物Mbd3-NuRD在mESCs的分化中起决定性作用[9]。2013年，Austin Smith报道了Tsc1/2-Flcn-Tfe3在多能性中的作用。Tsc2-Flcn通路的激活可以促进Tfe3蛋白从细胞核向细胞质的转运。同时,TFE3是Esrrb的上游调节剂。因此，从多能性网络的出口是由于各种信号的放大的级联，并通过具体方案[控制10,11]。

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术最初用于细菌和原始细菌的基础生物学研究[12- - - - - -16]。此外，Jinek等。通过组合CRISPR衍生的RNA（crRNA）设计小导RNA（因组）和反式激活RNA（tracrRNA），以及被称为CRISPR-Cas9系统，它帮助引导Cas9蛋白精确地消化DNA [17]。一年后，Cong等首次在人和动物细胞中成功进行了基因组定向编辑，获得了高突变率[18,19]。所述Cas9蛋白能够精确地识别目标通过因组的互补碱基配对的DNA序列，然后在特定位点进行双链DNA裂解[18,20.- - - - - -23]。最近，Zhang等人首次在人类细胞中完成了全基因组CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)。

此外，在黑素瘤模型中发现了涉及vemurafenib耐药的基因，包括先前确定的基因NF1和MED12基因和新发现的NF2,CUL3,TADA2B,TADA1。目前，全基因组CRISPR-Cas9筛选文库已被用于筛选多细胞系和原代细胞的耐药、毒力和抑癌基因[24- - - - - -33]。

为了寻找mESCs多能性退出的关键因素，我们首次采用全基因组CRISPR-Cas9敲除的无偏倚筛选技术，成功建立了基于gecko的模型。我们已经鉴定了能够促进mESCs从多能性中退出的基因。新方法为进一步探索细胞命运调控提供了范例和线索。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

OG2 mESCs属于那种被CBA / CAJ×C57BL / 6J小鼠和的129Sv /宰小鼠（北京查尔斯河公司购买）（从南京大学国家遗传工程小鼠资源库引进）的交叉产生的OG2-129应变。mESCs were maintained, with feeder cells, in DMEM (high glucose, Hyclone) supplemented with 15% FBS (Gibco), 1× NEAA (Gibco), 1× GlutaMAX (Gibco), 1× sodium pyruvate (Gibco), 3 M CHIR99021 (MCE), 1 M PD0325901 (MCE), and 1000 units/ml LIF (Millipore). When the mESCs were cultured on 0.2% gelatin-coated culture dishes instead of feeder cells, mESCs were cultured in N2B27+2i/LIF medium containing DMEM (high glucose, Hyclone), 1× N2 (Gibco), 2× B27 (Gibco), 1× NEAA (Gibco), 1× GlutaMAX (Gibco), 1× sodium pyruvate (Gibco), 0.1 mM ME (Gibco), 3 M CHIR99021 (MCE), 1 M PD0325901 (MCE), and 1000 units/ml LIF (Millipore). Feeder cells were from ICR mice in Beijing Charles River Company. High-glucose DMEM (Hyclone), supplemented with 10% FBS (NTC), 1× NEAA (Gibco), and 1× GlutaMAX (Gibco) was used for feeder cell and 293 T cell cultures.

2.2。WT mESCs的分化

野生型(WT) mESCs在N2B27+2i/LIF培养基中培养[10]。细胞接种于6孔或12孔板，密度为 ⁴（2E4），4E4，6E4，8E4，和10E4。第2i / LIF为12小时或24小时培养后，取出。分化的时间点分别为48小时，72小时和96小时。随后，将细胞收集，并提取RNA用于qPCR;细胞总RNA通过的TRIzol试剂萃取，然后反转录成cDNA。RT-PCR（qPCR的）用cDNA作为模板进行。的qPCR用引物序列显示于表执行1。The qPCR protocol is as follows: firstly, predeformation needs 93°C for 2 min, then amplify for 40 cycles: 93°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and finally 72°C for 7 min for extension.

2.3。壁虎因组文库制备

小鼠基因组规模CRISPR敲除(GeCKO) v2.0池库是全基因组CRISPR基因敲除质粒库的第二版，购自Addgene(#1000000053)。包含GeCKOv2文库的混合lentiCRISPRv2表达载体被提供为两个半文库A和B，浓度为50 ng/μl.共包含130209个独立的sgRNAs，对应20611个靶基因(6个sgRNAs/基因，分别在A文库和B文库中3个)，1175个靶mirna (A文库)，1000个对照sgRNAs(非靶向，A文库和B文库各3个)。CRISPR文库可通过电穿孔转化为细菌进行扩增，严格按照厂家说明操作[23,24]。

2.4。Lenti-Cas9-sgRNA质粒构建

根据初步筛选结果选择候选基因。对于每个基因，我们从GeCKO (v2.0)文库中选择了两个通过阳性富集产生且数量相对较高的sgRNAs。具体而言，有两个gRNAs (guide RNAs) -TCAGCTCGTCGTTCGCTCCG-3和5 -CCGAGCAGCGACAGCGCTT-3靶向Tcf7l1;5 -AACAGATCGTCCATGCAGTG-3和5 -TGAGGGCTTACCATCACCAT-3靶向p53;5 -ACTAACATCGTTGCTAGTAG-3和5 -CACAACTCCAGTGAAGATAG-3靶向Jarid2;和5 -CCGCTGCTGCCCTTGCCCAT-3和5 -CATCTCCTTGCTTCCTAAAG-3靶向FBXW7，克隆到grna表达质粒lentiGuide-Puro中。

将与线性化慢cas9向量末端互补的内聚末端序列添加到正反义序列的一端。进一步，它附加到退火后线性化的向量上。该质粒经转化、涂布平板、菌落采集、扩增后，测序结果正确，可用于转染。

2.5。Plko-shRNA质粒构建

pLKO。1is a replication-incompetent lentiviral vector chosen by the TRC for expression of shRNAs [34]。该shRNA的寡核苷酸的pLKO.1由网站提供的免费（https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland.html)。首先，获得靶基因的shRNA的有义序列，以及基于所述有义序列与反义序列被构建。转发寡的骨架是5CCGG - (x) -CTCGAG (y) (T) TTTTT (G) 3 ,而反向oligo的骨架为5AATT（C）AAAAA（A） - （X）-CTCGAG-（Y）3 。其中，x和y表示的感兴趣的shRNA的具体回文序列，分别。退火后，将合成的引物连接入线性化的pLKO.1载体（消化用EcoRI和AGEI）。该质粒经转化、涂布平板、菌落采集、扩增后，测序结果正确，可用于转染。

2.6。慢病毒生产

两个半库（A和B）被使用，并且病毒颗粒正在用于感染受体细胞之前，从A独立产生和B。 ⁶HEK293T细胞每10 cm培养皿，次日共转染12.5个细胞μg文库A或B质粒(lentiCRISPRv2μ克pMD.2G和7.5 μg psPAX2慢病毒包装质粒，转染液2.5 ml，含156.25个μl (2 M CaCl₂,1250年μl ( ,和1068.75 μl H₂转染对照为O. pr扁豆- mcherry。培养10-16小时，用新鲜培养基代替培养基。48小时后，收集病毒上清，通过0.45μm过滤器(默克Millipore)在8个存在μg/ml聚brene (Sigma-Aldrich)，然后用于感染受体细胞。

2.7。Cas9-Blast高表达的mESC系的构建

慢病毒用lentiCas9-Blast质粒包装，用于野生型mESC感染。感染8小时后更换培养基，继续培养48小时。然后用2筛选表达cas9的细胞μg/ml blasticidin, 3天。为了获得Cas9细胞系的高表达，我们将表达Cas9的mESCs以极低密度接种，确保每个克隆来自单个细胞。3天后选择约20个克隆扩增建立cas9表达细胞系。用Cas9 mRNA表达量最高的细胞系进一步感染GeCKO-sgRNA文库病毒。

2.8。从幼稚多能性中筛选导致mES退出的基因

用GeCKO v2文库转染表达cas9的mES细胞。简单地说, ⁷将每孔表达cas9的mESCs置于15 cm的平板中，置于补充2i的mES培养基中。细胞同时被慢病毒库感染。以低MOI(0.3)感染mESCs，以确保大多数细胞只接受1个病毒构建物。感染8小时后，培养基改为添加2i的新鲜mES培养基。培养48h后，用壁虎诱导表达cas9的mES细胞。2文库用1处理μ克/ ml嘌呤霉素（赛默飞世尔科技）另外4天。为了比较，当质粒文库第一转染到细胞和进化筛选丰度在通道初始丰度48小时嘌呤霉素选择的作为输入1和输入2后附加3个通路（9天）培养在的mES培养基中收集之后，收集细胞与2I。

为利用GeCKOv2文库筛选mES中涉及多能性退出的基因，在2i/LIF退出培养基中进一步选择转染的mESCs，收集2代作为实验组对照组。在这一阶段，大部分细胞已经分化，不能自我更新。选择的细胞在含有2i的mES培养基中再次培养1代，大多数分化的细胞由于不能适应基态mES培养基而不能存活。我们收集可以挽救的细胞作为实验组。

2.9。基因组提取和PCR重测序

异丙醇提取法提取细胞基因组DNA, PCR分离sgRNA序列。所有样品用含蛋白酶K的核裂解缓冲液消化至透明无色。然后依次加入RNase和蛋白沉淀溶液，去除RNA和蛋白污染。异丙醇沉淀后，用新制备的70%乙醇漂洗，风干。样品在水中溶解;测序。

用下一代测序构建图书馆:图书馆是用两步方法构建的。如以往报道[24]中，首先，含有库中的PCR片段从输入1，输入2和实验组扩增。用于扩增lentiCRISPRv2 sgRNAs用于第一PCR引物是感，5 -AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3和反义,5 -CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCC-3 。第二个PCR反应进行对所得的扩增子以添加衔接子序列的测序系统和条形码进行区分多重聚合酶链反应后的各试样。Primers for the second PCR include both a variable length sequence to increase library complexity and an 8 bp barcode for multiplexing of different biological samples. Primer message can refer to Zhang et al. [24]。第一次PCR扩增18个周期，第二次PCR扩增24个周期。在第二次PCR后，使用Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter)进行纯化，然后在NextSeq500测序(Illumina)。

2.10。MAGeCK分析和GO分析

下一代测序数据均用MAGeCK算法进行处理[35]。通过输入2和输入1的对比，得到显著降低的基因，并进行GO分析。

2.11。统计分析

数据以 。采用SPSS22.0和GraphPad Prism软件及基于模型的全基因组CRISPR-Cas9敲除分析(MAGeCK)进行统计分析和绘图。同时,未配对的学生 -检验用于两组间的比较。 被认为是显著的。

3.结果

3.1。基于gecko的mESCs退出多能性的关键因素筛选策略

壁虎（V2）lentiGuide - 普罗于感染低多重质粒文库病毒感染的成mESC的高表达lentiCas9-BLAST（ )。在多能性出口培养基(N2B27-2i/LIF)中诱导细胞分化2代进行筛选。然后加入多能性维持培养基(N2B27+2i/LIF)传代一段(富集)[24]。随后收集样本，提取基因组DNA进行下一代测序。采用MAGeCK算法进行数据管理，从而评价该模型的有效性。此外，筛选候选基因(分析筛选数据)。通过两轮实验，我们可以确定目标基因(图)1(一))。

筛选过程包括以下五个步骤（图1 (b)- - - - - -1 (d))。(1)病毒包装:用lentiGuide-Puro、psPAX2和pMD转染293 T细胞。2G为5:3:2。培养48小时后，收集含病毒的培养液，直接转染细胞，或-80℃保存，10ml /管。(2)转导:将表达高水平lentiCas9-Blast的mESCs接种于8个15cm的平板上 ⁷每板细胞。然后，将细胞与病毒转;其中倾斜体被预先计算。8小时转染后，将培养基更换为含有FBS和2i / LIF的mESC的培养基。After 48 hours of transduction, the cells were treated with 1 mg/ml puromycin for 2 days. The cells that have been successfully transduced and expressed sgRNA were screened and collected. The DNA was extracted and defined as input 1. (3) Mutation: the cells containing lentiGuide-Puro sgRNA library were cultured in the N2B27+2i/LIF medium for 3 passages, and the extracted DNA was defined as input 2. (4) Screening: the 2i/LIF was withdrawn from the culture medium, and the cells were further cultured in the N2B27 medium without 2i/LIF for 2 passages. Most of the cells differentiated, could not self-renew, and easily died, but the cells with target sgRNA did not differentiate and survived. (5) Enrichment: the 2i/LIF was readded into the N2B27 medium. Then, the viable differentiated cells would die because they fail to adapt to the ground-state mESC culture medium. However, those undifferentiated cells or those able to recover would proliferate significantly and accumulate. These cells were collected and their DNA was extracted and defined as the experiment group.

3.2。筛选模型和技术路线的建立

通过对WT mESC分化的多次实验，我们建立了以下分化条件:在12孔板中以80000个细胞/孔的密度继代培养mESC，并填充正常的基态多能维持培养基(N2B27+2i/LIF)。实验组培养24小时后用不含2i/LIF的多效出口培养基(N2B27)替换培养基(N2B27-2i/LIF)。诱导分化48、72小时后收集细胞进行进一步实验。对照组在N2B27+2i/LIF培养基中静置培养48小时后收集。然后从各培养物中提取RNA，通过RT-qPCR检测多能性因子的表达情况。我们发现(1)在更换培养基的时间点上，最好在粘附后24小时更换培养基，而不是12小时。其优点主要是细胞附着和细胞形态较好;(2)在分化时间上，三个多能因子的下降，即Nanog,Esrrb和Dppa5a是理想;(3)随着分化时间的延长，死亡细胞数量增加，活细胞数量减少。综上所述，在进行全基因组基因敲除时，我们将细胞进行3次传代分化，每次传代72小时，从而提高筛选力度，减少假阳性。但筛选验证较晚时，每个传代的诱导分化期为48小时，因为候选基因较少，因此更准确。同时可以缩短实验周期，降低成本，减轻附加因素的影响。结果如图所示2。

3.3。壁虎筛选数据分析

输入1表示刚将GeCKO (v2.0) lentiGuide-Puro sgRNA质粒文库转染到细胞的基态，但未观察到效果。作为输入2的参考，它反映了质粒文库第一次转染到细胞时的初始丰度。因此，输入2反映了GeCKO (v2.0) lentiGuide-Puro sgRNA质粒库影响所有细胞时，在标准传代过程中的进化筛选。

去的比较分析表明,输入2输入1,最消耗的类别或细胞定位sgRNAs目标基因如下:核糖体大亚基生物起源和核糖体亚基出口离原子核,核糖体生物起源,核糖体亚基小出口离原子核,翻译,以及磷脂传输(图3(一个))。因此，KEGG通路中sgRNAs靶向基因消耗最多的功能分类如下:真核生物中的核糖体生成、核苷酸切除修复、酒精中毒、氨基糖、核苷酸糖代谢和核糖体(图)3 (b))。上述观察结果显示，必需存活基因常规传代（输入2 /输入1）期间耗尽。也就是说，细胞将逐渐时保持细胞生存的基因敲除常规通道中丧生。与平均多样性，初级文库相比，它会显示在存活细胞中sgRNAs多样性的减少显著。这上面的逆向选择的观察验证了我们的模型的有效性，并表明我们的屏幕是有效地实现内源性基因敲除的目标。

击倒的Tcf7l1和p53作为参考。通过比较E-group和输入2，我们发现针对阳性对照基因(Tcf7l1和p53)，在库A和库B中有极高的MAGeCK RRA评分(robustrRank aggregation, RRA)3 (d))。MAGeCK分析结果在这两个文库中综合富集程度排序，前两名分别为p53和Tcf7l1，共筛选了72个基因( )。在充分考虑各基因已知的功能、信号通路及相关表观调控效应的基础上，筛选出13个候选基因(包括阳性对照基因)，Tcf7l1和p53)从前72个基因中选出(图3 (c))，以作进一步实验验证。

3.4。13个候选基因的伦蒂 - Cas9-因组淘汰赛后分化验证

13个候选基因分别从GeCKO v2.0质粒文库中选取2个明显富集的sgrna，克隆到pRlenti-Cas9-puro慢病毒载体中。通过病毒转染和感染，将Cas9和sgRNA整合到mESCs中。2i/LIF常规培养1传代后取出。分化48h后，提取RNA，测定三种多潜能因子的mRNA表达水平:Nanog,Esrrb,Dppa5a。其中,Nanog和Esrrb是核心的多能性因子。表达水平越高，多潜能状态越好。如图所示4以非目标为控制，击倒Tcf7l1,p53,Jarid2,FBXW7同时对三个多潜能因子基因的转录修复均有显著影响，Nanog,Esrrb,Dppa5a，它编码多潜能因子。的,Nanog转录水平是最重要的。在上述四种基因进行第​​三轮筛选。

3.5。分化验证后的四个基因的Plko-shRNA的敲除屏蔽

RT-qPCR(数据5和6)，针对这两个内参基因的shrna敲低效应与相应的细胞多能状态(每个基因2-4个shrna)相匹配，这与对照组有显著差异(climb)。即靶基因的多个shRNA靶向产生更好的基因敲低效应，多能性因子的转录水平也更高。结果表明，靶基因转录的减少将使ESCs能够承受分化条件，并损害承诺。在两轮筛选中，被击倒Jarid2和FBXW7与多能性的维持很好地一致，提示这些基因参与了多能性干细胞的多能性退出。

4.讨论

大规模基因筛查持有分子生物学，细胞生物学，肿瘤学，遗传学和病理学[研究很有价值36,37]。随着反向遗传学，我们有机会，以确定关键基因和影响细胞命运的转变，疾病的发生，发展信号通路。然而，低吞吐量，时间的消耗特点，省力苛刻的限制全基因组筛选的广泛应用。否则，我们只能抑制靶基因在转录后水平，而不是完整的淘汰赛。我们在多能细胞的多能性退出研究率先通过了CRISPR / Cas9基因组范围的基因敲除技术。基因由六个sgRNAs有针对性的，不同的位点同时编辑。通过对20611的靶基因和1175倍目标的miRNA完整的淘汰赛中，我们成功地应用全基因组筛选包含在从多能退出的关键基因。用siRNA文库筛选相比，基因组范围的基因敲除基于CRISPR / Cas9筛选具有稳定的淘汰赛表型，小剂量效应，持续时间长的效果的优点。此外，它减少表达的损失的效果，与shRNA的比较。

我们研究的关键设计是筛选策略。筛选策略的原则是提供一个敌对的环境。在这种情况下，活细胞可能包含更多的候选基因[38- - - - - -40]。2i和LIF在基态多能性维持中具有重要意义。在没有2i和LIF的培养基中培养的多能细胞会发生分化或死亡，细胞死亡随着传代次数的增加而增加。然而，如果基因敲除能够完全或部分替代2i和LIF，延缓多能细胞的分化，甚至维持细胞的多能性，则可能会延迟甚至阻止多能性的退出，说明基因在多能性的退出中起着至关重要的作用。我们成功建立了具有该表型的筛选模型。并采用高通量测序对候选基因进行鉴定，同时获得所有数据。通过三次实验进一步验证了结果，并确定了目标基因。

我们的筛选过程取决于丰度和转染效率。用低滴度文库病毒转染细胞，使转染后略有较好的丰度，避免了筛选前的sgRNA偏好。其次，为了保证足够的细胞数量和表型，尽可能减少假阳性和假阴性率，我们加大了筛选力度，增加了不同培养基的传代数，进行了多次筛选。为了排除其他因素对干细胞多能性的干扰并减少我们结果的可变性，我们重复了实验，每次都严格使用相同的最佳方案。

基于CRISPR/Cas9基因敲除的筛选比RNAi敲除的筛选更彻底地失活基因，不受异质性RNAi敲除效率引起的基因表达量效应的影响。此外，由于是基因敲除，筛选也可能更加敏感。而且RNAi的作用是短期的。随着细胞培养，RNAi敲除效率逐渐降低，会带来不可控制的影响。相反，被敲除的细胞会在很长一段时间内具有稳定的遗传[10,41]。里氏和他的同事使用的换位系统屏幕单倍体细胞[42]。缺点是转座子系统在基因组中的插入偏置，蛋白质编码序列仅占基因组的2%左右。因此，大多数插入都不能有效地达到基因敲除的目的。相比之下，基于cas9的筛选可导致基因组中相对精确位置的突变。与此同时，基因体内的插入可能产生具有新功能的蛋白质突变。另外，单倍体细胞毕竟不是正常细胞，所以筛选结果只能作为参考，还需要在正常的二倍体细胞中进行验证。

MacDougall和同事的工作使用了直接差异化的策略来EpiLC [43]。去掉2iL后也加入Fgf2。筛选结果也可能受到Fgf2的影响，我们的方法是在mESC维持介质中去除2i/LIF后进行随机分化。Li和Villegas利用Rex1-GFP报告筛选耐分化的细胞克隆[44,45]。值得注意的是，基于该报告系统的这些筛选结果似乎都与mTOR信号通路有关。而我们通过mESCs能否恢复干细胞样自我更新能力，并在N2B27+2i/LIF培养基中分化后继续维持，来筛选耐分化克隆。

5.结论

我们已经确定了从多能促进出口有4个基因，即TCF7l1,p53,Jarid2,FBXW7。这些基因已经被确认为阳性基因[1- - - - - -7,46]。我们利用大规模基因组筛选技术识别这些基因的事实证明了我们的方法的有效性。我们成功地结合了生命科学领域的两个热点话题，即干细胞命运调控和基因编辑技术。这样，我们不仅为解决多能性退出等具体科学问题提供了一种新的方法，也为生活和科学研究建立了一种思维模式。总之，我们的研究可以为干细胞领域的进一步研究提供新的和有意义的见解。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

作者的贡献

杨斌，邝俊奇，吴楚曼，周文义，朱朔记等对本文贡献。

致谢

这项研究是由中国国家重点研发项目(2017 yfa0105602和2018 yfa0108700号),国家自然科学基金委项目国际合作与交流(81720102004),国家自然科学基金(81570279和81570279号),该研究小组中国广东省自然科学基金项目(2017号a030312007),广州的关键项目科学研究计划(805212639211),广东省大学生科技创新培养专项基金(pdjh2018a0041)，广东省人民医院登峰项目专项(编号:DFJH201812、KJ012019119)。

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