SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/8483035 8483035 研究文章 基于公司筛选基因促进退出天真的多能性CRISPR-Cas9淘汰赛 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1776 - 0703 杨 本 1 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 2681 - 7580 旷 琪 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9520 - 4107 吴 Chuman 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9958 - 3458 周 Wenyi 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7845 - 5919 朱 Shuoji 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3248 - 5597 江 Haodong 2 4 https://orcid.org/0000 - 0002 - 8892 - 5491 翟 紫薇 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2242 - 9903 吴 悦 4 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2324 - 5575 彭 俊威 4 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1461 - 7725 刘 Nanbo 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2131 - 6472 胡 海盐 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2670 - 6496 Ide 纳赛尔穆萨 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7504 - 3633 陈 Ruiping 5 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2884 - 0736 赵 Mingyi 6 https://orcid.org/0000 - 0002 - 4276 - 9593 朱 平 1 2 罗莎 亚历山德罗 1 第二临床医学院 南方医科大学 广州 广东510515年 中国 fimmu.com 2 广东理工学院的心血管疾病 广东省人民医院 广东省医学科学院 广州 广东510080年 中国 gdghospital.org.cn 3 广州生物医药与健康研究院 中国科学院 广州 广东510530年 中国 cas.cn 4 医学院的 华南理工大学 广州 广东510006年 中国 scut.edu.cn 5 心胸外科学系的东部 第一附属医院 中山大学 广州 广东510080年 中国 sysu.edu.cn 6 儿科 第三个湘雅医院 中南大学 长沙 湖南410013年 中国 csu.edu.cn 2020年 3 2 2020年 2020年 18 09年 2019年 31日 12 2019年 08年 01 2020年 3 2 2020年 2020年 版权©2020杨本et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

的两个主要问题的多能性干细胞和再生医学是出口和分化功能的细胞或组织。这两个问题的答案是很有价值的临床干细胞和再生医学研究的翻译。尽管大量研究已经揭示了真相多能性维护,多能细胞自我更新的机制,增殖,分化成特定谱系的细胞或组织尚未定义。为此,我们充分利用新技术,即公司CRISPR-Cas9淘汰赛(壁虎)。作为一个有效的方法引入目标丧失突变在基因组的特定网站,壁虎能够屏幕以公正的方式促进退出的关键基因在小鼠胚胎干细胞多能性(制)的第一次。在这项研究中,我们成功建立了一个模型基于GeCKO屏幕多能性戒断的关键基因。我们的策略包括慢病毒包装技术和感染,lenti-Cas9基因敲除技术,shRNA基因可拆卸的技术,下一代测序,基于模型的分析公司的CRISPR-Cas9淘汰赛(MAGeCK分析),去分析,和其他方法。我们的研究结果提供了一个新颖的方法对大规模筛查多能性基因的退出和细胞命运的监管研究提供了一个入口点。

 特殊项目的登封广东省人民医院的计划 DFJH201812 KJ012019119 专项资金的培养广东大学生科技创新 pdjh2018a0041 广州科学研究计划的关键程序 805212639211 广东省自然科学基金 2017年a030312007 中国国家自然科学基金 81970248 81570279 81720102004 中国国家重点研究和发展项目 2018年yfa0108700 2017年yfa0105602 1。介绍

是一种未分化的原始细胞自我更新和multilineage分化的潜力,多能干细胞可以分化成任何类型的细胞类型,然后进一步发展成任何组织或器官。多能性是由一个包含众多转录因子网络自动调整的循环。和退出多能性意味着这个递归的终结电路,使发育进程和血统的承诺,这是再生医学领域的应用价值高,疾病模型,药物屏幕,细胞命运的规定,和个体发育。目前,大量研究集中在维持多能性,而很少考虑多能性退出的监管机制。

有许多因素,有助于维持多能性。然而,退出机制的细胞增殖周期有序,激活发展过程,并最终分化成特定的血统仍有待确定。多能性揭示机制退出可能导致临界点控制多能性的发现。平衡,增殖和分化转录水平的因素,包括 Oct4, Sox2, Nanog,必须控制。这些基因在维持多能性起到至关重要的作用。

与此同时,某些转录因子的差别也需要防止过度或对这些多能性基因。例如,抑制 Tcf3(也称为 TCF711)会增加的表达 Oct4, Nanog和其他多能性因素,从而防止退出多能性( 1- - - - - - 4]。引人注目的是,三重删除 Etv5, Rbpj, Tcf3废除ESCs的分化的能力,从而使他们在很大程度上未分化的自我循环,即使在差异化的存在刺激( 5]。

此外, p53和 Jarid诱导多能干细胞的分化,通过抑制Nanog表达式( 6- - - - - - 8]。核小体重塑和组蛋白脱乙酰酶复杂Mbd3-NuRD决定性的分化制( 9]。2013年,奥斯汀史密斯报道Tsc1/2-Flcn-Tfe3在多能性的作用。Tsc2-Flcn通路的激活将促进Tfe3蛋白质的运输从细胞核到细胞质中。同时, Tfe3是一个上游Esrrb调节器。因此,退出多能性网络导致一连串的各种信号的放大和由特定的控制程序 10, 11]。

基因编辑技术由CRISPR-Cas9首次开发的基础生物学研究细菌和古细菌类( 12- - - - - - 16]。进一步,Jinek等人设计了一个小导游RNA (sgRNA)通过结合CRISPR-derived RNA (crRNA)和transactivating RNA (tracrRNA),也称为CRISPR-Cas9系统帮助指导Cas9蛋白质消化DNA精确( 17]。一年后,丛等人第一次成功地执行基因组定向编辑在人类和动物细胞突变率高了( 18, 19]。Cas9蛋白可以精确地确定目标DNA序列的互补碱基配对sgRNA然后执行双链DNA乳沟在一个特定的网站( 18, 20.- - - - - - 23]。最近,张等人的第一个完成全基因组CRISPR-Cas9淘汰赛(壁虎)在人类细胞。

此外,基因vemurafenib抵抗黑色素瘤模型中被发现,包括此前发现的基因 NF1和 MED12基因和新发现 NF2, CUL3, TADA2B, TADA1。目前,全基因组CRISPR-Cas9筛选库被采纳为耐药性屏幕,毒性和肿瘤抑制基因在多个细胞谱系和初级细胞( 24- - - - - - 33]。

搜索所涉及的关键因素的多能性出口公司的,,第一次,我们采用了无偏筛查技术的全基因组CRISPR-Cas9击倒并成功建立了gecko核心模型。我们发现有这样的基因,可以促进公司的出口从多能性。新方法为进一步勘探提供了一种范式和线索细胞命运的监管。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养

OG2制属于OG2 - 129菌株产生的交叉的CBA / CaJ×C57BL / 6 j小鼠(介绍南京大学国家遗传工程小鼠资源图书馆)和129 sv / Jae老鼠(从北京查尔斯河公司购买)。公司的维护,馈线细胞,在DMEM(高葡萄糖,Hyclone)补充15%的边后卫(Gibco), 1×NEAA (Gibco), 1×GlutaMAX (Gibco), 1×丙酮酸钠(Gibco), 3 M CHIR99021 (MCE), 1 M PD0325901 (MCE),和1000单位/毫升的生活(微孔)。当制培养0.2% gelatin-coated文化菜而不是馈线细胞,制培养在N2B27 + 2 i /生活中包含DMEM(高葡萄糖,Hyclone), 1×N2 (Gibco), 2×B27 (Gibco), 1×NEAA (Gibco), 1×GlutaMAX (Gibco), 1×丙酮酸钠(Gibco), 0.1毫米(Gibco), 3 M CHIR99021 (MCE), 1 M PD0325901 (MCE),和1000单位/毫升的生活(微孔)。馈线细胞来自查尔斯河公司在北京ICR小鼠。High-glucose DMEM (Hyclone),补充了10%的边后卫(NTC), 1×NEAA (Gibco),和1×GlutaMAX (Gibco)被用于馈电单元和293 T细胞培养。

 2.2。分化的WT公司

野生型(WT)制培养在N2B27 + 2我生活中 10]。细胞被播种到6-well或12-well板的密度 2 × 10 4(2 e4) 4 e4 6 e4, 8 e4, 10 e4。2 i /生活被撤回后12小时或24小时的文化。分化时间点48小时,72小时,96小时。随后,收集细胞,qPCR RNA提取;细胞总RNA提取试剂盒试剂,然后反向转录成互补。rt - pcr (qPCR)进行互补dna作为模板。qPCR进行使用的引物序列显示在表中 1。qPCR协议如下:首先,预变形需要93°C 2分钟,然后放大40周期:93°C 1分钟,1分钟55°C, 72°C 1分钟,最后7分钟的72°C扩展。

细节的引物用于选择基因的存在分析用于PCR实验。

基因名字 引物序列 退火T (°C) 基因库加入数量
Gapdh F: 5 ′ -AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTCA-3 ′ R: 5 ′ -TTGGCAGCACCAGTGGATGCAGGGA-3 ′ 60 NM_001289726.1
Nanog F: 5 ′ -CTCAAGTCCTGAGGCTGACA-3 ′ R: 5 ′ -TGAAACCTGTCCTTGAGTGC-3 ′ 60 NM_028016.3
Esrrb F: 5 ′ -TTTCTGGAACCCATGGAGAG-3 ′ R: 5 ′ -AGCCAGCACCTCCTTCTACA-3 ′ 60 NM_011934.4
Dppa5a F: 5 ′ -GAAGTATTCCAGGTCCAGTC-3 ′ R: 5 ′ -TTGAGAGCCGTAAATGAAGA-3 ′ 60 NM_025274.3
2.3。GeCKO-sgRNA图书馆准备

鼠标公司CRISPR淘汰赛(壁虎)v2.0汇集图书馆是第二版的全基因组基因敲除CRISPR质粒库,从Addgene购买(# 1000000053)。汇集lentiCRISPRv2表达向量包含GeCKOv2库提供了两个half-libraries A和B, 50 ng /浓度 μl。它包含130209个独立sgRNAs总的来说,对应20611年目标基因(六sgRNAs /基因,其中三个在图书馆A和B,分别),1175年目标microrna(图书馆),和1000年控制sgRNAs(不属预定目标的3 A和B的库)。CRISPR库可以通过电穿孔转化成细菌严格[放大根据制造商的指示 23, 24]。

 2.4。Lenti-Cas9-sgRNA质粒构建

基于初步筛选的候选基因选择的结果。对于每一个基因,两个sgRNAs所产生的积极的浓缩和相对更高的统计数据从壁虎(v2.0)库中选择。具体地说,两个gRNAs(指导rna), 5 ′ -TCAGCTCGTCGTTCGCTCCG-3 ′ 和5 ′ -CCGAGCAGCGACAGCGCTT-3 ′ 为目标 Tcf7l1;5 ′ -AACAGATCGTCCATGCAGTG-3 ′ 和5 ′ -TGAGGGCTTACCATCACCAT-3 ′ 为目标 p53;5 ′ -ACTAACATCGTTGCTAGTAG-3 ′ 和5 ′ -CACAACTCCAGTGAAGATAG-3 ′ 为目标 Jarid2;和5 ′ -CCGCTGCTGCCCTTGCCCAT-3 ′ 和5 ′ -CATCTCCTTGCTTCCTAAAG-3 ′ 为目标 Fbxw7克隆到gRNA-expression质粒lentiGuide-Puro。

粘性末端序列与线性化的最后补充lenti-Cas9向量添加的一端/反义序列感。此外,它附着在线性化向量后退火。转换后,板涂层、菌落挑选和放大,可以用于转染质粒测序结果是正确的。

 2.5。Plko-shRNA质粒构建

pLKO。1is a replication-incompetent lentiviral vector chosen by the TRC for expression of shRNAs [ 34]。pLKO shRNA寡核苷酸。1are provided free by the website ( https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland.html)。首先,获得目标基因的shRNA序列感,和反义序列构造了基于序列。转发低聚糖的骨架是5 ′ CCGG - (x) -CTCGAG (y) (T) TTTTT (G) 3 ′ 的骨架,而反向益生元是5 ′ AATT (C)五星级(A) - (x) -CTCGAG (y) 3 ′ 。其中,x和y代表感兴趣的特定的shRNA回文序列,分别。退火后,合成引物被绑定到线性化pLKO。1的向量(消化和EcoRI AgeI)。转换后,板涂层、菌落挑选和放大,可以用于转染质粒测序结果是正确的。

 2.6。慢病毒生产

half-libraries (A和B)被使用,和病毒颗粒产生独立于A和B之前被用于感染受体细胞。 5 × 10 6镀HEK293T细胞每10厘米盘和第二天cotransfected 12.5 μ图书馆g A或B质粒(lentiCRISPRv2) 5 μg pMD。2G, and 7.5  μg psPAX2慢病毒包装质粒,使用2.5毫升的转染装有156.25解决方案 μl 2 M CaCl2,1250年 μl ( 2 × 哈佛商学院 和1068.75 μl H2o . PRlenti-mCherry作为转染控制。细胞被孵化的10到16小时,然后媒体更换新鲜培养基。48小时后,病毒收集上清液,经过0.45 μm过滤器(默克密理博)在8 μg / ml聚凝胺(Sigma-Aldrich),然后用来感染受体细胞。

 2.7。建设Cas9-Blast High-Expressed制血统

与lentiCas9-Blast质粒的慢病毒包装,用于野生型制的感染。培养基是改变后8小时的感染,和细胞进一步培养48小时。然后,Cas9-expressing细胞被选2 μg / ml杀稻瘟菌素3天。为了得到高Cas9细胞系的表达,这些Cas9-expressing制被播种在极低的密度,确保每个克隆起源于单个细胞。3天后,大约20个优良无性系选择扩张和建立Cas9-expressing细胞系。最高的细胞系Cas9 mRNA的表达水平被用于进一步感染GeCKO-sgRNA病毒库。

 2.8。GeCKOv2筛选基因有助于mES退出从天真的多能性

Cas9-expressing mES细胞转导与壁虎v2图书馆。简单地说, 2。4 × 10 7Cas9-expressing制每口井被镀成15厘米板在mES文化媒体补充2我。和细胞同时感染了慢病毒库。制被感染低莫伊(0.3),以确保大多数细胞仅接收1病毒结构。8小时后感染,培养基的改变与我新鲜mES培养基补充。文化的48小时之后,转导Cas9-expressing mES GeCKOv细胞。2图书馆服用1 μg / ml嘌呤霉素(热费希尔科学)为另一个4天。为了比较初始丰富当质粒库第一次筛选大量转染到细胞和演化,48小时后收集细胞嘌呤霉素选择输入1和2后收集额外的3段(9天)文化在mES媒体2。

筛选基因的多能性退出在mES GeCKOv2库,并制进一步在媒介中选择2 i /生活撤军2通道,然后收集实验组控制。在这一步中,大多数细胞分化和自我更新。这些选择的细胞培养在mES中再次与我一段和大部分的分化细胞就无法生存,因为他们不能适应极化子mES的媒介。我们收集这些细胞可以获救,作为实验组。

 2.9。基因组提取和PCR测序

从这些细胞基因组DNA提取使用isopropanol-extracted方法和sgRNA序列PCR分离。所有样品都消化核含有蛋白酶K裂解缓冲到无色透明。然后,核糖核酸酶和蛋白质降雨雪解决方案添加到序列去除RNA和蛋白质污染。与异丙醇沉淀后,样品是用新准备70%酒精清洗和风干。样品溶解在水中;测序。

图书馆建设与下一代测序:图书馆是由一个两步方法。先前报道( 24),首先,PCR片段包含图书馆被放大输入1,输入2,实验组。第一PCR引物用于放大lentiCRISPRv2 sgRNAs意义,5 ′ -AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3 ′ 和反义,5 ′ -CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCC-3 ′ 。进行第二次PCR反应产生的扩增子添加适配器序列测序系统和条形码歧视多重聚合酶链反应后每个样本。第二PCR引物包括一个变量序列长度增加图书馆的复杂性和一个8 bp条形码不同生物样品的多路复用。引物信息可以参考Zhang et al。 24]。放大进行了18第一PCR循环和24第二PCR循环。在第二次PCR,扩增子纯化使用Agencourt AMPure XP珠子(贝克曼库尔特)和混合和测序NextSeq500 (Illumina公司)。

 2.10。MAGeCK分析去分析

下一代测序数据处理MAGeCK算法( 35]。通过比较输入2和1,显著减少基因,进行了分析。

 2.11。统计分析

给出的数据 的意思是 ± SD 。SPSS22.0和GraphPad棱镜软件和基于模型分析的全基因组CRISPR-Cas9淘汰赛(MAGeCK)是采用统计分析和策划。同时,未配对的学生 t 以及用于比较两组。 P < 0.05 被认为是显著的。

 3所示。结果 3.1。gecko核心筛查策略的关键因素的制退出多能性

壁虎(v2) lentiGuide-Puro质粒库病毒感染到制high-expressing lentiCas9-Blast低感染复数( 莫伊 = 0.3 )。细胞诱导分化的多能性的两个通道出口介质(N2B27-2i /生活)筛查。然后,多能性维护媒介(N2B27 + 2 i /生活)添加一个通道(浓缩) 24]。随后,收集到的样本,并为下一代测序基因组DNA提取。MAGeCK算法采用数据管理,从而评估该模型的有效性。此外,候选基因筛选(筛选数据的分析)。两轮的实验,我们可以确定目标基因(图 1(一))。

筛选过程:(一)大纲的研究过程和(b)的技术路线。 2。4 × 10 7lentiCas9-Blast-expressing制与壁虎(v2) lentiGuide-Puro转染2 i /生活,然后输入1收集48小时后嘌呤霉素选择和输入2后额外3通道(9天)培养N2B27 + 2我/生活;实验组收集2通道后的突变期和2通道2 i /生活撤军和多通道2 i /生活条件。2.4 e7代表 2。4 × 10 7mES细胞。(c) OG2制与Cas9-Blast转染质粒和壁虎v2.0 DNA质粒在N2B27 + 2 i /生活中。分化是通过抑制剂消除和浓缩由恢复2 i /生活。(d)阶段和mES细胞的荧光图像三个阶段。酒吧,100 μm。

筛选过程包括以下五个步骤(数字 1 (b)- - - - - - 1 (d))。(1)病毒包装:lentiGuide-Puro转染293 T细胞,psPAX2, pMD。2 g的比率5:3:2。经过48小时的文化、文化媒体收集包含病毒,并直接用于细胞转染,或储存在-80°C, 10毫升/管。(2)传导:制表达高水平的lentiCas9-Blast被播种到八15厘米的盘子, 2。4 × 10 7细胞每板。然后,细胞与病毒转导;翻车机是预先计算的。8小时的转染后,培养基是改变公司的文化中包含的边后卫和2 i /生活。经过48小时的传导,细胞1毫克/毫升嘌呤霉素治疗,疗程2天。表达的细胞已经成功转导和sgRNA筛选和收集。DNA提取和定义为输入1。(3)突变:细胞包含lentiGuide-Puro sgRNA图书馆是培养N2B27 + 2我,生活中3通道和提取的DNA被定义为输入2。(4)筛选:2我/生活是退出了培养基,细胞进一步培养N2B27介质没有2 i /生活2通道。大多数的细胞分化,不能自我更新,和容易死亡,但与目标细胞sgRNA没有区分并存活下来。 (5) Enrichment: the 2i/LIF was readded into the N2B27 medium. Then, the viable differentiated cells would die because they fail to adapt to the ground-state mESC culture medium. However, those undifferentiated cells or those able to recover would proliferate significantly and accumulate. These cells were collected and their DNA was extracted and defined as the experiment group.

 3.2。筛选模型的建立和技术路线

WT公司的分化上的多个实验后,我们建立了以下微分条件:制亚文化在12-well板的密度80000细胞/好,裁判与正常极化子multipotency维护媒介(N2B27 + 2 i /生活)。在实验组中,培养基与multipotency取代退出媒介(N2B27)没有2 i /生活(N2B27-2i /生活)24小时后的文化。诱导分化后48和72小时,细胞进行进一步的实验。在对照组,细胞被压抑了培养N2B27 + 2我,生活中他们收集前48小时。然后,我们从每种文化中提取RNA,多能的表达由RT-qPCR决定因素。我们发现,(1)至于培养基更换的时间点,它会更好,如果我们改变培养基后24小时内粘连,而不是12个小时。的优点主要是更好的细胞连接和细胞形态;(2)分化的时间,三个多能因素的衰落,即 Nanog, Esrrb和 Dppa5a是理想;和(3)分化时间延长,死细胞数量的增加而可行的细胞减少。总之,当进行全基因组基因敲除,期间我们会区分细胞3通道,我们引导每个通道为72小时,从而提高筛查工作,减少假阳性。然而,当筛选进行验证后,每个通道的诱导分化期是48小时,因为有更少的候选基因,从而更加准确。与此同时,它会缩短实验周期,降低成本,减轻其他因素的影响。结果如图所示 2。

OG2制被撤回2 i /生活。(a)中所有组培养N2B27 + 2 i /生活第一个24小时,然后分化是通过抑制剂删除另一个48或72小时的实验小组,而对照组培养N2B27 + 2我/生活额外的48小时。酒吧,100 μm。(b) RT-qPCR分析三个多能性因素的表达野生型。OG2制被撤回2 i /生活。误差棒表示标准错误, ∗ ∗ ∗ P < 0.001 与对照组, n = 2 。

 3.3。壁虎筛选数据分析

输入1代表的基态壁虎(v2.0) lentiGuide-Puro sgRNA图书馆质粒转染到细胞,但没有观察到的效果。的参考输入2,它反映了初始当质粒库第一次转染到细胞丰度。因此,输入2反映了进化筛选标准段落期间,当壁虎(v2.0) lentiGuide-Puro sgRNA质粒库影响所有细胞。

去的比较分析表明,输入2输入1,最消耗的类别或细胞定位sgRNAs目标基因如下:核糖体大亚基生物起源和核糖体亚基出口离原子核,核糖体生物起源,核糖体亚基小出口离原子核,翻译,以及磷脂传输(图 3(一个))。因此,那些最消耗的功能类别KEGG sgRNAs目标基因的途径如下:在真核生物核糖体生物起源,核苷酸切除修复,酗酒,一个氨基糖,和核苷酸糖代谢和核糖体(图 3 (b))。上面的观察表明,基本生存基因耗尽在常规通道(输入2 / 1)。也就是说,细胞会逐渐死亡在一次常规通道的基因使细胞生存的报废。相比平均多样性与主库,它将揭示显著减少sgRNAs在幸存的细胞的多样性。这上面的观察逆向选择验证模型的有效性,表明我们的屏幕是有效实现内源基因的敲除的目标。

筛选数据去分析。(a, b)的比较输入1公司与输入2 -选择筛选。制中最显著减少基因转染壁虎(v2.0)图书馆和b . (c, d)壁虎屏幕制揭示基因的阻力损失赋予承诺。最重要的是丰富的基因包括两个积极的控制 Trp53和 Tcf7l1(排名第一和第二),以及70个候选基因(/ B-2i /生活:借助于库A / B)。

击倒的 Tcf7l1和 p53包括作为参考。通过比较借助于输入2,我们发现浓缩的多个siRNAs目标积极控制基因( Tcf7l1和 p53)具有极高的MAGeCK基本分数(robustrRank聚合,基本在图书馆(图A和B 3 (d))。MAGeCK分析结果综合排名的浓缩在这两个库,和前两名 p53和 Tcf7l1筛选,共有72个基因( P ≤ 0.05 )。基于已知函数的充分考虑,信号通路,和有关每个基因的表观遗传调控效应,13候选基因(包括积极的控制基因, Tcf7l1和 p53)选择前72个基因(图 3 (c))进行进一步的实验验证。

 3.4。分化后验证Lenti-Cas9-sgRNA 13个候选基因的敲除

13个候选基因,两个明显丰富sgRNAs选择从壁虎v2.0每个基因和克隆质粒库pRlenti-Cas9-puro慢病毒载体。Cas9和sgRNA集成到制由病毒转染和感染。2我/生活后被常规文化一个通道。经过48小时的分化,RNA提取测定三个多能性因素的信使RNA表达水平: Nanog, Esrrb, Dppa5a。其中, Nanog和 Esrrb是核心多能性因素。表达水平越高,越好多能性状态。如图 4的淘汰赛,不属预定目标的控制 Tcf7l1, p53, Jarid2, Fbxw7同时显示显著影响转录基因修复三个多能性的因素, Nanog, Esrrb, Dppa5a,其中编码多能因素。的, Nanog转录水平是最重要的。第三轮筛选进行上述四种基因。

RT-qPCR分析三个多能性因素的表达野生型OG2制转染(a) Tcf7l1 lenti-Cas9-sgRNA, (b) p53, Jarid2 (c)和(d) Fbxw7被撤回2 i /生活。误差棒表示标准错误, ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 与不属预定目标的。

 3.5。分化后验证Plko-shRNA击倒的四个基因筛选

RT-qPCR(数据 5和 6),针对这两种参考基因的shrna击倒效果可能与相应的细胞多能性状态(2 - 4每个基因成分),这是明显不同于对照组(争夺)。也就是说,多个目标基因生成更好的基因的shRNA目标击倒效果以及转录水平较高的多能性因素。结果表明,减少记录的ESCs的目标基因将使承受分化条件和影响的承诺。在两轮筛选,击倒 Jarid2和 Fbxw7很符合多能性的维护,这表明这些基因参与了多能干细胞的多能性退出。

RT-qPCR分析的三个多能性因素的表达野生型OG2制转染的plko-shRNA (a) Tcf7l1,(b) p53,(c) Jarid2,(d) Fbxw7和被撤出2 i /生活。误差棒表示标准错误, ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 与争夺。

成分的可拆卸的效率目标的四个候选人:(a) Tcf7l1,(b) p53,(c) Jarid2,(d) Fbxw7。误差棒表示标准错误, ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 与争夺。

 4所示。讨论

大规模遗传筛查是很有价值的研究分子生物学、细胞生物学、肿瘤学、遗传学和病理学( 36, 37]。反向遗传学,我们有机会识别关键基因和细胞信号传导通路从而影响细胞命运转变,疾病发生和发展。然而,低吞吐量的特点,耗费时间,和精力要求限制全基因组筛查的广泛应用。否则,我们只能抑制目标基因在转录后的层面,而不是完整的淘汰赛。我们首先采用CRISPR / Cas9全基因组基因敲除技术在研究多能细胞的多能性退出。基因的目标六sgRNAs,不同地点同时编辑。20611年完成击倒目标microrna基因和1175年目标,我们成功地应用全基因组筛查基因参与退出多能性的关键。与核库筛选相比,全基因组基因敲除筛选基于CRISPR / Cas9淘汰赛表型稳定的优势,小剂量效应,长期效果。同时,减少损失的表达的影响,而成分。

设计在我们的研究中筛选策略的关键。筛查策略的原则是提供一个敌对环境。在此条件下,可行的细胞可能包含更多的候选基因 38- - - - - - 40]。2我在基态和生活是非常重要的多能性维护。多能细胞培养在中如果没有我和生活将微分或死亡,和细胞死亡和通道数量将会增加。然而,如果基因敲除可以完全或部分替代2我和生活,甚至推迟多能细胞的分化和维持细胞多能性,它可能会推迟甚至防止退出多能性,表明一个关键的角色在退出多能性基因。我们成功建立了表型的筛选模型。此外,采用高通量测序确定候选基因,以及获得的所有数据。结果进一步验证了一式三份,目标基因被确定。

我们的筛选过程取决于丰富和转染效率。low-titer图书馆的细胞转染病毒,使一个好的丰富略转染后,避免sgRNA偏好筛选。第二,以确保足够的细胞数量和表型以及减少假阳性和假阴性率尽可能我们提高筛选的努力增加通过鉴别培养基,进行重复检查。排除其他因素的干扰干细胞多能性和减少我们的结果的可变性,实验重复,每次应用严格相同的最优协议。

CRISPR / Cas9 knockout-based基因筛查更彻底的失活的基因比使用RNAi击倒和不受基因表达量的影响引起的异构RNAi击倒的效率。此外,因为它是一个基因敲除,筛查也可能更敏感。更重要的是,RNAi的影响是短期的。细胞培养,RNAi的可拆卸的效率会逐渐减少,这将带来无法控制的影响。相反,有稳定的遗传基因敲除细胞很长一段时间( 10, 41]。状况和他的同事使用换位系统屏幕在单倍体细胞( 42]。转座子系统的缺点是插入基因组中是有偏见的,和蛋白质编码序列只占约2%的基因组。因此,大多数的插入并不能有效的实现基因敲除的目的。相比之下,Cas9-based筛查可以导致基因突变在相对精确的位置。同时,插入基因内部的身体可能产生蛋白质突变与新的功能。此外,单倍体细胞不正常的细胞,因此,筛选结果只能作为参考,还需要验证在正常二倍体细胞。

MacDougall的工作和他的同事们利用的策略直接分化EpiLC [ 43]。Fgf2也添加2 il后删除。筛查结果也可能受到Fgf2的影响,我们的方法是一种随机微分后的2我从公司的维护/生活中。李的工作和Villegas Rex1-GFP记者屏幕细胞克隆耐分化( 44, 45]。值得注意的是,这些记者系统筛查结果基于似乎mTOR相关信号通路。相比之下,我们筛选克隆耐分化制能否恢复干细胞的自我更新能力,可以保持N2B27 + 2后我生活中分化的过程。

 5。结论

我们已经确定4基因促进退出多能性,即 TCF7l1, p53, Jarid2, Fbxw7。这些已经被确认为积极的基因( 1- - - - - - 7, 46]。我们发现这些基因与大规模基因组筛选技术证明了我们的方法的有效性。我们成功地结合生活和科学两个领域的热门话题,即干细胞命运调控和基因编辑技术。通过这种方式,我们不仅提供了一种新方法解决具体的科学问题如退出多能性也建立一个生活和科学研究的思维方式。综上所述,我们的研究可以为进一步研究提供新的和重要的见解在干细胞领域。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

本·杨,琪旷,吴Chuman周,与朱Shuoji贡献本文同样。

 确认

这项研究是由中国国家重点研发项目(2017 yfa0105602和2018 yfa0108700号),国家自然科学基金委项目国际合作与交流(81720102004),国家自然科学基金(81570279和81570279号),该研究小组中国广东省自然科学基金项目(2017号a030312007),广州的关键项目科学研究计划(805212639211),特别基金的培养广东大学生科技创新(没有。pdjh2018a0041)和登封的特殊项目的广东省人民医院(Nos DFJH201812和KJ012019119)。

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