在小鼠肢体缺血模型中，手术损伤和缺血使脂肪间质血管分数升高并增加血管生成能力GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

脂肪源性间质血管碎片(SVF)是自体细胞移植的有效来源。然而，svf的质量和数量取决于患者的年龄、并发症等因素。在这项研究中，我们开发了一种通过外科手术重复增加细胞数量和提高脂肪衍生svf质量的方法，我们称之为“伤口修复启动”。取BALB/c小鼠腹股沟区皮下脂肪，切碎脂肪实质(损伤)，结扎皮下脂肪喂养动脉(缺血)。启动后0、1、3、5或7天分离svf。通过对差异表达基因进行微阵列分析和通路分析，检测引物svf的基因表达水平。采用流式细胞仪分析启动后svf细胞组成的变化。将SVFs移植到同系缺血后肢，观察其血管生成和再生潜能。采用激光多普勒血流灌注仪测量后肢血流，缺血组织CD31染色量化毛细血管密度。分别用荧光免疫染色和Western blotting检测svf中HIF-1 α和VEGF-A合成的稳定性。 As a result, the number of SVFs per fat weight was increased significantly on day 7 after priming. Among the differentially expressed genes were innate immunity-related signals on both days 1 and 3 after priming. In primed SVFs, the CD45-positive blood mononuclear cell fraction decreased, and the CD31-CD45-double negative mesenchymal cell fraction increased on day 7. The F4/80-positive macrophage fraction was increased on days 1 and 7 after priming. There was a serial decrease in the mesenchymal-gated CD34-positive adipose progenitor fraction and mesenchymal-gated CD140A-positive/CD9-positive preadipocyte fraction on days 1 and 3. Transplantation of primed SVFs resulted in increased capillary density and augmented blood flow, improving regeneration of the ischemic limbs. HIF-1 alpha was stabilized in the primed cutaneous fat原位GydF4y2Ba，并且VEGF-A合成的灌注后5天在峰值上。因此，伤口修复引发导致SVF具有增加的数量和增强血管生成潜力。GydF4y2Ba

1.介绍GydF4y2Ba

脂肪衍生的基质血管级分（SVF）是衍生自诱导组织的酶促消化的细胞群[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba］.新鲜分离SVFs不仅是一个富含脂肪来源的干细胞/基质细胞的来源，而且还含有细胞的异质混合物，包括内皮祖细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，周细胞，成纤维细胞，间充质细胞，淋巴细胞，巨噬细胞和前脂肪细胞[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］.SVFs的自体移植是一种快速增长的血管生成治疗。该方案的优点包括丰富的细胞供应，易于无细胞培养的分离，并且没有移植排斥的风险。然而，实际上难以确保临床环境中的均匀SVF质量。几份报告描述了老化[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba糖尿病[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]可能损害SVF的质量和血管生成功能能力。为了实现SVF移植的可重复性和有效性，有必要克服SVF质量的个体变化问题。GydF4y2Ba

在这里，我们证明了脂肪组织的外科治疗可重复增加和重组脂肪来源的svf。我们将这种现象称为“伤口修复底漆”，并开发了一种新的方法，可重复获得数量更多、质量更好的svf。在缺血肢体再生过程中，激活SVFs不仅能增加细胞数量，还能增强血管生成能力。损伤相关的刺激和缺血都是启动的必要条件，免疫细胞通过异质细胞间的通信也参与其中。在小鼠肢体缺血模型中，我们研究了启动SVFs比未启动SVFs促进血管生成和再生的表现。GydF4y2Ba

2。材料和方法GydF4y2Ba

2.1。初步发现和再现“伤口修复灌注”现象GydF4y2Ba

所有动物实验都遵守“Dokkyo医科大学动物实验指南”，尽一切努力减少动物数量和痛苦。9-12周的近交系雄性BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.， Shizuoka, Japan)腹腔注射90mg /kg盐酸氯胺酮(Ketalar;Daiichi Sankyo proarma Co.， Ltd，东京，日本)和10mg /kg盐酸氧lazine (Celactal;拜耳Yakuhin有限公司，日本大阪)。SVFs从BALB/c小鼠腹股沟皮下脂肪中分离出来，并移植到同系肢体缺血模型中，如前所述[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

在一个初步实验中，我们观察到，当一只老鼠因与同窝的老鼠打架而皮肤受伤时，svf的数量会急剧增加(数据未显示)。当我们将接受同种小鼠缺血肢体皮肤损伤的供体小鼠的SVFs(调整到相同数量)移植到同系小鼠的缺血肢体时，血管生成能力大大增强(数据未显示)。我们发现，损伤小鼠的svf移植比未损伤小鼠的血流恢复快得多。因此，我们假设脂肪组织损伤显著增加svf的数量和质量。GydF4y2Ba

然后，我们设计了本研究，在控制条件下再现这种现象，并调查其潜在的机制。在分离svf前几天，脂肪组织被手术破坏。将灌注模型按粉碎脂肪实质(损伤)、结扎皮下脂肪喂养动脉(缺血)和两者均分为3组(损伤+缺血组)。同时采用假手术组，其表皮进行了切割和缝合，但未对脂肪组织进行手术损伤。GydF4y2Ba

２.２.制备SVFsGydF4y2Ba

如前所述，SVF是从近交系BALB/c小鼠中分离出来的，具有创伤修复启动（仅损伤、仅缺血和损伤+缺血）或假手术（非启动SVF）[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba9GydF4y2Ba，但作了几处修改。从腹股沟区取出BALB/c小鼠脂肪组织，剁碎，转移到c管(Miltenyi Biotec Corp，东京，日本)，用0.1%胶原酶I型(Wako Pure Chemical Industries, Ltd，大阪，日本)和0.2% disase II型(Life Technologies)在37°c下消化1小时。消化后的组织每10分钟用MACS解离器(Miltenyi Biotec Corp.，安装了软件程序“m_brain01-02”)机械轻柔地分散一次。停职通过了100分GydF4y2BaμGydF4y2BaM过滤器（BD Falcon，Franklin Lakes，NJ），在420处离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟（LC-200; Toyy Seiko Co.，Ltd，Tokyo，Japan），并重新阐述了Dulbecco的改良Eagle的媒介（DMEM; DEMEM; Life Technologies Oriental Oriental，东京，日本）。用0.4％台盼蓝染色的细胞数，并使用血细胞计数计计算。GydF4y2Ba

2.3。微阵列和通路分析GydF4y2Ba

采用苯酚-氯仿萃取法(RNAiso Plus, Takara Bio Inc.，志贺，日本)，通过引物程序从SVFs中纯化总RNA。为进行比较，取三个时间点(0、1、3天后)。每个时间点用3只单独小鼠进行统计分析。在确认RNA质量后(2100 Bioanalyzer，安捷伦技术公司，Santa Clara, CA, USA)，使用微阵列分析(Affymetrix gene chip expression Array, Mouse430_2, Thermo Fisher Scientific, Inc.， Waltham, MA, USA)测定基因表达水平。使用Affymetrix转录组分析控制台(TAC, Ver3.1.0.5)软件筛选差异表达基因。筛选标准为:(1)表达率小于一半或大于2倍GydF4y2Ba反复测量值的值差异分析小于0.05。随后将差异表达基因列表进口到Ingenuity途径分析软件（Qiagen，Hilden，德国）。Fisher的确切试验用于估计每种途径或功能本体中差异表达基因的“富集”。在规范途径分析中，激活GydF4y2Ba -GydF4y2Ba得分是基于关于“种子分子”的策划信息和数据集中种子的改变来计算。在上游和下游（疾病和功能）分析，激活GydF4y2Ba -GydF4y2Ba基于知识的效果（Ingenuity知识库）之间的一致性来计算得分，并且在数据集中观察到的模式。GydF4y2Ba

2.4。Western Blotting.GydF4y2Ba

分离有或没有引发的SVF，用溶解（7M尿素，2M硫脲和4％CHAPS，Thermo Fisher），使全细胞蛋白质变性。使用Bradford蛋白质测定试剂盒（Bio-rad Laboratories，Inc.，Hercules，Ca，USA）和板式读者（Infinite F200 Pro，Tecan，苏黎世，瑞士）测量蛋白质浓度。随后在十二烷基硫酸锂（NUPAGE样品缓冲液，Thermo Fishific，Inc，Waltham，MA，USA）中稀释蛋白质，浓度为2mg / ml，并在50mM二硫醇中减少。缠绕的基因组DNA在4°C（Bioruptor®II，Sonic Bio Inc.，Kanagawa，Kanagawa，Japan）的脉冲超声剪切30分钟。蛋白质通过12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中的电泳进行尺寸 - 分馏，然后湿 - 转移到PVDF膜（Immobilon-P，Merck Millipore，Billerica，Ma，USA）中。封闭2％脱脂乳TBST（Tris / HCl pH 7.4,150mM NaCl和0.1％吐温20）后，将膜与VEGF-A抗体（＃AB1876-I，Merck Millipore）或Gapdh抗体（＃5174，细胞信号传导技术，Danvers，MA，美国）在4°C过夜。用TBST洗掉非特异性结合，并且使用辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗（＃7074，细胞信号传导技术）和发光反应（#WSE-7120或7110，Atto，Tokyo，Japan）来观察蛋白质抗体复合物。用CCD相机（Luminograph I，Atto）拍摄图像。GydF4y2Ba

2.5。流式细胞仪GydF4y2Ba

在引发（损伤+缺血）后，对从小鼠的腹股沟区域制备的皮下脂肪被取样（损伤+缺血）。将这些样品切碎成小块并用Ca用磷酸盐缓冲盐水（PBS）的胶原酶消化GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}和毫克GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}containing 2% bovine serum albumin (BSA) at 37°C for 45 min using a gentleMACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). The samples were passed through a 100 μGydF4y2BaM尼龙网，随后用DNase I（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国）处理。用PBS用0.5％BSA和2mM乙二胺四乙酸（EDTA）（FACS缓冲液）洗涤细胞，溶血，并重悬于下游实验的FACS缓冲液中。GydF4y2Ba

流式细胞术用于确定SVFS的细胞表面标记呈递[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]. 简单地说，细胞与抗小鼠Fc一起孵育GydF4y2BaγGydF4y2BaRII/III (2.4G2, BD Biosciences, San Jose, CA)在4°C下孵育10分钟，然后用以下抗小鼠抗体染色:针对CD34的fitc偶联抗体，pe偶联抗体cd31, percp - cy5.5偶联抗体cd45, apc偶联抗体cd140a (PDGFR;BD Biosciences)和fitc偶联的抗cd9(赛莫费舍尔科学公司，圣地亚哥，CA)。为了识别M1或M2巨噬细胞，我们使用了fitc标记的抗f4 /80、pe标记的抗cd11c和Alexa Fluor 647标记的抗cd206 (AbD sertec, Oxford, UK)。M1巨噬细胞为f4 /80阳性/ cd11c阳性/ cd206阴性，M2巨噬细胞为f4 /80阳性/ cd11c阴性/ cd206阳性。适当的非特异性同型作为对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson, Mountain View, CA)，使用CellQuest软件(Becton Dickinson)分析细胞。GydF4y2Ba

2.6。小鼠后肢缺血模型及实验方案GydF4y2Ba

小鼠结扎右侧髂外动脉和后肢静脉造成右后肢缺血[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］.小鼠随机分为五组（GydF4y2Ba 分别为对照组(不手术)、假手术组(不注射SVF)、单纯损伤组、单纯缺血组、损伤+缺血组。在8个不同的部位注射svf (GydF4y2Ba 细胞；20 GydF4y2BaμGydF4y2BaL)在缺血肢体内收肌上的作用。在动脉结扎和svf注射之间的24小时间隔使模型过于严重，以至于未启动svf没有显示效果，导致后肢脱落。GydF4y2Ba

2.7。后肢血流量评估GydF4y2Ba

使用激光多普勒血流灌注成像仪(PeriScan PIM III;在术后第0天(手术后1小时内)，以及第3、7和14天。成像前使用脱毛膏去除多余的肢体毛发。小鼠被放置在38°C的加热板上，以尽量减少成像期间的温度变化。在扫描图像上计算血液灌注量作为灌注单位(PU)，比较各组缺血后肢(右侧)的序列变化。同时评估对侧非缺血(左)后肢血流灌注变化，以避免环境光和温度引起的变异偏倚。GydF4y2Ba

2.8。免疫组织化学GydF4y2Ba

石蜡包埋切片（5） GydF4y2BaμGydF4y2BaM厚）接受标准的脱氨烷化和再水化程序。通过高压灭菌，用抗原检索溶液（PH9）（PH9）（Agilent Technologies，Santa Clara，Ca，Ca，Ca，USA）用抗原检索溶液（PH9）（Agilent Technologies，Santa Clara，Ca，Ca，Ca，USA）进行处理。然后将这些部分封闭磷酸盐缓冲盐水（PBS）的3％（V / v）正常牛血清白蛋白（BSA）20分钟。在注射后的第7天和第14天获得缺血性大腿腺面膜骨骼肌组织样品。通过用大鼠抗小鼠CD31（Dianova，Hamburg，Germany）的免疫组织化学染色来评估旁路股骨动脉闭塞区段的侧支血管的存在，并通过光学显微镜评估每次滑动的五个无随机微观场（BZ-X710; Keyence日本章节，大阪。使用抗霉素 - 生物素复合方法（Vectastain Elite ABC套件;载体，Burlingame，Ca）与二氨基苯胺（DAB底物试剂盒; Zymed，S. San Francisco，Ca）作为过氧化物酶基质进行染色。使用Adobe Photoshop CS6（Adobe Systems Inc.，San Jose，CA）量化CD31阳性血管区域作为高功率场（400x）中的总组织区域的百分比。选择阈值并用于识别每个幻灯片上的正像素。百分比区域被计算为相对于每个视图中的总像素总数的正像素的百分比。 Adjacent tissue sections were stained with hematoxylin and eosin [13.GydF4y2Ba]. 在启动后第1天获取皮肤脂肪组织样本。样品在4°C下与兔抗小鼠缺氧诱导因子-（HIF-）1α（#36169，细胞信号技术）孵育过夜。然后将样品与二级抗体Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（#8889，细胞信号技术）孵育1小时 h在室温下。切片复染后，用细胞信号技术（DAPI）进行延长金防褪色处理。使用荧光显微镜（BZ-X710）进行显微镜观察和摄影。GydF4y2Ba

2.9。统计分析GydF4y2Ba

数据显示为GydF4y2Ba ．GydF4y2Ba的Mann-WhitneyGydF4y2Ba测试用于两组比较。使用非参数Fisher的LSD方法分析流式细胞术和细胞计数的数据：Kruskal-Wallis单向分析的差异，然后是Mann-WhitneyGydF4y2Ba作为A测试GydF4y2Ba事后GydF4y2Ba分析。GydF4y2Ba值< 0.05被认为是显著的。使用SPSS 25进行统计分析(IBM公司，Armonk, NY, USA)。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

3.1。手术损伤和缺血（引发）增加SVFs活菌数GydF4y2Ba

我们计算手术治疗（损伤+缺血）SVF的细胞数，以评估伤口修复引发的影响。与基线相比，第7天的引发SVF的活细胞数量增加，而非预浸性的SVFs的活细胞数在第1天，3或7天没有改变。底漆的SVF的总活细胞数量更高为1.72倍（GydF4y2Ba )GydF4y2Ba在第7天，与未受刺激的SVF相比（图GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．Primed SVFs的存活率是GydF4y2Ba （范围，59.1-100％）第1天，GydF4y2Ba (范围，67.8-100%)第3天GydF4y2Ba （范围，77-97.3％）第7天。非预期的SVFS的存活率是GydF4y2Ba (范围，66.7-91.7%)，GydF4y2Ba 第3天（范围71-98.3%），以及GydF4y2Ba （范围，59.2-94.7％）在第7天有涂底漆和nonprimed SVFs之间的存活率没有显著差异。GydF4y2Ba

3.2。底漆（损伤+缺血）显着改变SVFs的基因表达谱GydF4y2Ba

为了获得SVF启动的生物学洞察力，我们进行了微阵列和通路分析。我们比较了启动SVF与非启动SVF的基因表达谱（即启动后第1天或第3天与第0天）。典型途径分析明确强调了先天免疫相关信号，如启动后第1天和第3天髓样细胞（TREM）上表达的触发受体、与急性期反应相关的基因和Toll样受体信号（图GydF4y2Ba2（a）GydF4y2Ba). 与这些结果一致，细胞因子和先天免疫受体是启动期间具有代表性的上游调节因子（图1）GydF4y2Ba2（b）GydF4y2Ba)．在注射后的第1天，显著的生物学改变包括“血液系统发育”、“炎症反应”、“细胞运动”和“免疫细胞运输”(图)GydF4y2Ba2（c）GydF4y2Ba)．在启动后的第3天，其他生物变化，如“机体损伤和异常”和“癌症”也很明显(图)GydF4y2Ba2（c）GydF4y2Ba). 细胞周期相关信号（例如，细胞周期蛋白和细胞周期调节以及Polo样激酶的有丝分裂作用）在随后的时间点完全上调（图GydF4y2Ba2（a）GydF4y2Ba)．由于经典途径分析表明缺氧相关的信号（例如，糖酵解途径）的参与，我们检查的缺氧诱导因子（HIF-）1α的皮肤脂肪蛋白质稳定GydF4y2Ba原位GydF4y2Ba，SVF已被隔离。在手术程序（损伤和缺血）后第1天，观察到HIF-1α的显着稳定（图GydF4y2Ba3（a）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3（d）GydF4y2Ba)．然而，单独的损伤或缺血是不足的现象（图GydF4y2Ba3（b）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3（c）GydF4y2Ba). 这些数据表明，启动通过先天免疫信号的骨髓募集诱导细胞成分的剧烈变化，随后，SVF通过细胞间的相互作用和增殖优化其修复功能。此后，我们从两个不同的方面研究了创伤修复启动：细胞成分的变化（图1）GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)血管生成的功能增强（图GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

3.3。引发（损伤+缺血）改变了SVFS的异质细胞组成GydF4y2Ba

由于SVF由异质性细胞群组成，我们评估了CD45阳性单核细胞、CD31-CD45-双阴性间充质细胞的百分比[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]在启动后第1、3和7天，间充质门控CD34阳性脂肪祖细胞和F4/80阳性巨噬细胞。CD45阳性细胞百分率为GydF4y2Ba (范围，85.46-97.42%)在第1天，GydF4y2Ba （范围，第3天，78.38-98.78％），GydF4y2Ba （范围，66.75-91.38％）在第7天（图GydF4y2Ba4（a）GydF4y2Ba)．在启动后第7天，cd45阳性的SVFs与未启动的SVFs相比显著降低(图)GydF4y2Ba4（a）GydF4y2Ba)．cd31 - cd45双阴性细胞百分比为GydF4y2Ba (范围，1.85-6.13)在第1天，GydF4y2Ba (范围，0.71-8.61)在第3天，和GydF4y2Ba （范围，5.49-18.83）第7天（图GydF4y2Ba4（a）GydF4y2Ba)．启动后第7天，cd31 - cd45双阴性分数明显高于未启动的SVFs(图)GydF4y2Ba4（a）GydF4y2Ba)．两种变量的散点图（CD45阳性和CD31-CD45-双负）在非预期的SVFS上清楚地分离了Primed SVFS（图GydF4y2Ba4（b）GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

已知cd31 - cd45双阴性部分包括具有很大变异性的cd34阳性细胞，从3.5%开始[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba80％[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]. CD31-CD45双阴性部分中的CD34阳性细胞代表脂肪来源的祖细胞。CD31-CD45双阴性组分中CD34阳性细胞的百分比为GydF4y2Ba （范围23.02–55.95）在第1天，GydF4y2Ba (范围，7.59-33.33)GydF4y2Ba （范围，10.36-76.73）第7天的CD34阳性细胞在第3天显著下引发后但均与nonprimed SVFs相比7天相似（图GydF4y2Ba4 (c)GydF4y2Ba)．已知表达CD140A的脂肪祖细胞(PDGFR)根据其生理环境分化为脂肪细胞或成纤维细胞[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.我们测量CD140A-CD9-双阳性细胞作为前脂肪细胞级分和CD140A阳性/ CD9阴性细胞作为共引用级分。CD31-CD45-双负数分数中CD140A-CD9-双阳性细胞的百分比是GydF4y2Ba (范围，20.43-55.17)第1天，GydF4y2Ba （范围13.25–41.04）在第3天，以及GydF4y2Ba (范围，12.81-57.14)。cd31 - cd45双阴性部分中cd140a阳性/ cd9阴性细胞的百分比为GydF4y2Ba (范围，10.26-48.75)第1天，GydF4y2Ba （范围，17.1-55.13）第3天，GydF4y2Ba （范围，22.86-57.26）在第7天。虽然在引发后第1天较低的前脂肪细胞级分，与非预浸的SVFS相比，引发后的共引用级分（图GydF4y2Ba4 (c)GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

F4 / 80阳性分数（巨噬细胞）的百分比是GydF4y2Ba (范围，5.33-38.46)在第1天，GydF4y2Ba (范围，3.12-44.47)在第3天GydF4y2Ba 第7天（范围为4.63–34.29）。M1巨噬细胞（F4/80阳性/CD11c阳性/CD206阴性部分）的百分比为GydF4y2Ba （范围，1.2-6.1）第1天，GydF4y2Ba （范围1.15-5.19）在第3天，并GydF4y2Ba (范围，4.67 ~ 14.36)，M2巨噬细胞(f4 /80阳性/ cd11c阴性/ cd206阳性)GydF4y2Ba (范围，21.82-77.04)在第1天，GydF4y2Ba (范围，27.48-54.29)GydF4y2Ba (范围，21.83-52.37)在第7天。巨噬细胞的百分比在启动后的第1和第7天显著升高，而M1和M2巨噬细胞的比例与未启动的SVFs相比几乎相似(图)GydF4y2Ba4 (d)GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

3.4。手术损伤和缺血的组合是有效的血液流动回收和缺血肢体再生所必需的GydF4y2Ba

为了量化启动SVFs的血管生成能力，我们将SVFs移植到同系后肢缺血小鼠体内。我们准备了四个不同的实验组来观察启动的必要因素。右侧髂外动脉结扎后(第0天)，各组缺血后肢血液灌注明显低于对侧对照组后肢(图)GydF4y2Ba5(一个)GydF4y2Ba)．在SVF注射后第3、7和14天，假手术组(无SVF移植)、单纯损伤组和单纯缺血组的血流恢复均无增加(图)GydF4y2Ba5(一个)GydF4y2Ba和GydF4y2Ba5 (b)GydF4y2Ba). 相反，损伤+缺血组(GydF4y2Ba  在第7天，GydF4y2Ba  PU on day 14) showed significantly higher blood perfusion than the sham group (vs. 第7天，vs。GydF4y2Ba 第14天PU;GydF4y2Ba ），GydF4y2Ba伤兵组(vs。GydF4y2Ba 第7天，vs。GydF4y2Ba 第14天PU;GydF4y2Ba ），GydF4y2Ba缺血组(vs。GydF4y2Ba 第7天，vs。GydF4y2Ba 第14天PU;GydF4y2Ba )GydF4y2Ba注射后第7天和第14天。第14天，损伤+缺血组的血液灌注几乎与对侧对照肢体的血液灌注相等（图1）GydF4y2Ba5 (b)GydF4y2Ba)．始终如一地，第14天的四组缺血性肢体外观表现出显着的改善。在第14天的损伤+缺血组中缺血性肢体皮肤上没有辍学或疤痕外观，而我们可以看到假手术团体中的右缺血肢体，并在仅受伤的群体和缺血中进行疤痕-only组（图GydF4y2Ba5（c）GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

3.5。在肢体缺血期间毛细血管血管生成需要损伤和缺血的组合GydF4y2Ba

最后，我们通过测量毛细血管密度来确定svf的血管生成能力。数字GydF4y2Ba6（a）GydF4y2Ba示出了代表性的显微镜图像为CD31阳性（内皮细胞），其位于缺血后肢肌肉内注射SVF后第14天的的毛细管。这次受伤+缺血组（GydF4y2Ba )GydF4y2Ba显示毛细血管的面积明显大于假手术组(vs。GydF4y2Ba ;GydF4y2Ba ），GydF4y2Ba伤兵组(vs。GydF4y2Ba ;GydF4y2Ba ），GydF4y2Ba缺血组(vs。GydF4y2Ba ;GydF4y2Ba )GydF4y2Ba注射后第14天(图GydF4y2Ba6（b）GydF4y2Ba)．血管内皮生长因子- (VEGF-) A的合成在启动后第0天可以忽略不计，诱导高峰在启动后第5天(图)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)．这些结果表明，损伤和缺血的组合通过合成VEGF-A诱导毛细血管血管生成。GydF4y2Ba

4.讨论GydF4y2Ba

受伤组织释放出影响修复和重塑的各种伤口相关因素[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］.脂肪衍生的SVFs对缺血肢体的自体移植促进人类缺血组织的血管生成和再生[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]以及在鼠标模型中[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.在小鼠模型,细胞因子白介素6、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子,基本成纤维细胞生长因子、血小板源生长factor-bb,肝血管内皮生长因子,生长因子显著增加在第一天外周血移植后脂肪SVFs [GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.在移植后的第7天，但是，这些细胞因子降低到同一水平的对照组小鼠。这表明脂肪来源SVFs的移植通过以下两个步骤改善缺血：（1）全身性的炎症反应动员从骨髓中炎症细胞，和（2）移植的脂肪来源的干/基质细胞和所述动员炎性细胞协同诱导血管生成[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

我们在同系移植实验中偶然发现，严重损伤小鼠体内脂肪来源的SVFs数量增加，并增强了血管生成能力。我们随后开发了一种再现这种现象的方法，并对其机理进行了研究。SVFs的创面修复需要两个手术步骤:切碎脂肪实质(损伤)和结扎皮下脂肪喂养动脉(缺血)。当其中一种(损伤或缺血)缺乏时，肢体缺血血管生成的增强是有限的。然而，在损伤和缺血存在的情况下，我们观察到缺血肢体的血管生成和再生增强。启动后svf细胞数量增加，微阵列分析显示基因表达谱发生了显著变化。随后，我们进行了后续实验，以阐明创伤修复引物的分子和细胞基础。微阵列数据清楚地表明先天免疫信号的广泛上调，提示急性炎症反应的参与。损伤相关分子模式可能是诱发炎症反应的触发器[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］.此外，低氧诱导因子- (HIF-) 1 α在皮肤脂肪中稳定GydF4y2Ba原位GydF4y2Ba在灌注后第1天。PrimedSVFS随后通过第5-7天重新组织非均相细胞组合物并合成丰富的血管内皮生长因子 - （VEGF-）蛋白质。数据支持我们的假设，即引入的SVFs的移植改善了两步的缺血：通过全体细胞群的全身反应和协同合作调动免疫细胞，这有助于有效血管生成。GydF4y2Ba

在本研究中，流式细胞术分析证明了底漆的SVF的细胞组成随时间变化。在引发后，CD45阳性单核细胞级分降低，但CD31-CD45-双阴性间充质细胞级分在第7天增加（图GydF4y2Ba3（a）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3（b）GydF4y2Ba). 最近的报道表明，活化的组织干细胞使巨噬细胞的比例从M1变为M2[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］.因为M2巨噬细胞已知具有组织重塑作用[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba,GydF4y2Ba25GydF4y2Ba，提示M2巨噬细胞可能参与缺血肢体的血管生成和再生。在我们的结果中，虽然f4 /80阳性的巨噬细胞比例在引物后有所增加，但M1 (f4 /80阳性/ cd11c阳性/ cd206阴性部分)和M2 (f4 /80阳性/ cd11c阴性/ cd206阳性部分)细胞比例没有变化。另一种重要的基质成分是脂肪祖细胞，即前脂肪细胞[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］.Shok等人。最近报道，肌纤维细胞的子集通过增殖改变它们的数量[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba前脂肪细胞。但是，我们观察到前脂肪细胞的比例瞬时下降，而prefibroblasts的启动后并没有改变。我们应该执行关于对缺血肢体再生引SVFs的特定细胞成分进一步调查。GydF4y2Ba

人体脂肪衍生的SVFs的处理已经自动化了血管生成疗法，和脂肪来源的SVFs自体移植是目前在各种临床设置执行。然而，在细胞数量和质量的个体差异问题仍然存在一个尚未解决的问题。虽然我们已经提供了被称为“创伤修复启动”的独特理念，并产生一个可重复的外科手术，采用这种方法的人不太可能是可行的。在未来，灌注过程应通过化学或药理学方法来代替，其效果等同于外科引发。例如，引发与刺激先天免疫信号将是一个有希望的替代的化学化合物。这样的化学品或药物灌注可能有助于缺血性心血管疾病可靠和有效的血管生成治疗的发展，如严重肢体缺血。GydF4y2Ba

5。结论GydF4y2Ba

患有损伤+缺血的手术引发脂肪组织导致细胞数增加和脂肪衍生的SVF的更好质量。引发的SVFs在伤口修复期间快速重新组装其细胞组分。居住基质细胞和动员的免疫细胞合作以在缺血组织中达到有效血管生成。GydF4y2Ba

数据可用性GydF4y2Ba

本研究中获得的微阵列数据已保存在基因表达综合数据库中（登录号：GSE 134613）。用于支持本研究结果的其他数据可根据要求从相应作者处获得。GydF4y2Ba

的利益冲突GydF4y2Ba

提交人声明他们没有利益冲突。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

Kishimoto S和Inoue K同样贡献了这项工作。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

我们感谢N. Ohshima女士（Dokkyo Medical大学研究协作和支持中心），H. Hirata先生Y. Machida先生，以及M. Terada博士（Dokkyo Medical大学实验动物研究中心），和S. Satoh女士（先进的医学科学研究中心）为他们的技术支持。这项研究得到了JSPS Kakenhi的支持（授予17K09559）。GydF4y2Ba

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