组织蛋白酶K缺乏受损Ischemia-Induced老年小鼠的新血管形成

文摘

背景。衰老是心血管疾病的主要危险因素。半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶K (CatK)与血管生成的过程,但在血管形成的确切角色个人CatK老化是知之甚少。方法和结果。研究公认的在ischemia-induced CatK血管生成的作用,我们应用一个野生型(CatK岁后肢缺血模型^{+ / +})和CatK-deficient (CatK^−−/老鼠)。连续激光多普勒血流分析显示,经济复苏的缺血性CatK岁/正常血流比值^−−/老鼠在随访期间受到了损害。术后第14天,CatK不足也受损的毛细血管的形成。CatK缺乏降低的水平Notch1裂解,phospho-Akt和/或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白来源于c - kit的缺血性肌肉和骨骼⁺细胞。流式细胞仪分析显示,CatK不足数量的减少内皮祖细胞(EPC)同CD31⁺/ c - kit⁺外周血细胞以及缺血性血管。在体外实验中,CatK^−−/bone-derived c - kit受损⁺细胞功能(迁移、入侵、扩散和tubulogenesis)在老年小鼠。我们的研究结果表明,老化受损ischemia-induced血管生成相关的减少生产和CD31的动员⁺/ c - kit⁺细胞在老鼠身上。结论。这些发现证实了减损ischemia-induced CatK岁新血管形成^−−/老鼠是由于,至少在一定程度上减少EPC动员和相关联的归航的细胞进入血管的损伤在先进的年龄Notch1信号激活。

1。介绍

衰老与能力下降形成新的血管缺血,这是与较高的心血管并发症和减少组织再生的能力。有相当大的兴趣,了解血管生成的机制在人类先进的年龄。新血管形成的过程与细胞外基质(ECM)改造,其中包括各种组件的蛋白水解系统,如基质金属蛋白酶(MMPs)和丝氨酸蛋白酶1- - - - - -4]。多项研究表明,半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶家族成员也参与血管生成的病理生理条件(5- - - - - -8]。

猫家庭成员组织蛋白酶K (CatK)是哺乳动物半胱氨酸肽酶与endo-lysosomes排序并分泌到细胞外空间;它也要求I型胶原蛋白和弹性蛋白的降解9- - - - - -14]。有越来越多的证据证明,具体内部猫和细胞外的功能,而这些功能已经被证明参与心血管发病机制(15- - - - - -18]。最近的数据显示角色CatK在病理条件下,如肾脏疾病,代谢紊乱,atherosclerosis-based心血管疾病(18- - - - - -20.]。然而,很少有研究调查的角色CatK的血管生成在先进的年龄动物或主题。Urbich等人报道,CatL有关键作用的集成循环内皮祖细胞(epc), CatL介导缺血组织血管生成;他们也观察到高表达CatK内皮祖细胞(6,21]。临床试验的结果的干细胞和祖细胞治疗缺血性疾病的老年人有令人失望22]。Samman Tahhan和他的同事们最近报告结束循环祖细胞和临床结果之间的关系在老年急性冠脉综合征患者23]。因此需要确定改善内皮祖细胞的动员和功能老化。

Notch信号调节胚胎模式和二进制细胞命运的决定,它扮演关键角色在哺乳动物胚胎发生和血管生成在成人缺血性四肢的血管发展24,25]。配体结合的切口乳沟是紧随其后γ-secretase-mediated跨膜域内的蛋白水解作用,它与RBP-J蛋白质相互作用;复杂的函数作为下游靶基因的转录因子,它是必不可少的神经发生,肌细胞生成,造血和血管生成26,27]。因此,严格控制终端乳沟事件和Notch信号蛋白水解作用的活动。然而,正如我们之前报道,CatK-mediated Notch信号激活产后血管生成的反应必须在年轻小鼠缺血(28]。Drachman提出,这些现象也可能出现在老年人与多个与年龄相关的变化和人类,他们是由微血管功能受损导致沉淀主要来自Notch-related减少血管生成(29日]。

我们进行了本研究的影响来确定目标删除CatK基因ischemia-induced血管生成和血管化老老鼠,我们试图阐明机制受损的新血管形成涉及Notch信号在老年小鼠的失活。

2。材料和方法

2.1。动物

调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订)。实验动物研究委员会批准的协议是名古屋大学。我们CatK-deficient (CatK生成^−−/)C57BL / 6 j小鼠基因打靶小鼠胚胎干细胞的描述(28),在这项研究中使用的老鼠≧96周的历史。

2.2。鼠标的后肢缺血模型

CatK^−−/和野生型(CatK^{+ / +})同窝出生仔畜控制受到单侧下肢缺血手术在氯胺酮(70毫克/公斤,制药制药、东京)和甲苯噻嗪(4.6毫克/公斤,拜耳制药、东京)麻醉(30.]。在指定的时间点手术后,小鼠安乐死通过过量的氯胺酮和甲苯噻嗪混合物,然后骨骼肌切割出来,立即冻结在液氮温度前储存在−80°C到免疫印迹分析。

2.3。缺血性下肢灌注试验

在指定的时间点,血流量的比值在正常肢体缺血,与激光散斑测量血流成像(LSBFI、Omegazone OZ-1,ω波,东京)中描述(30.]。LSBFI,血流显示像素激光频率的变化的不同的颜色。血流扫描两次后,存储图像受到计算机辅助量化和缺血性和非缺血型四肢的平均流动计算。血流的定量分析的结果表示为左右(缺血)的比值(非缺血型)LDBF避免数据因环境光和温度变化。

2.4。毛细血管密度的测量

我们检测内收肌的毛细血管密度剖面在术后第14天anti-CD31单克隆抗体(mAb)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。内皮细胞是量化通过测量CD31阳性细胞的数量每大功率领域(400×)(30.]。我们测量5个随机选择的微观领域从5到7组织不同部分在每一块来确定每个肌纤维的毛细血管数量。

2.5。免疫印迹分析

蛋白质被均质化与肌肉标本30分钟在冰冷的裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, 1毫米EDTA, 150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 0.25% SDS, pH值7.4)补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒在10毫升(1片),1毫米原钒酸钠和氟化1毫米phenylmethylsulfonyl如[17]。等量(40μg)的蛋白质受到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和electrophoretically转移到聚乙二烯二氟化物膜。这些墨迹是孵化主要抗体:总Notch1裂解Notch1 (c-Notch1),总Akt, phosphor-Akt (p-Akt)β肌动蛋白从细胞信号技术购买(波士顿)。血管内皮生长因子(VEGF)是购自圣克鲁斯生物技术。

2.6。Immunocytofluorescence

免疫荧光分析,他们的固定和阻塞后,相应的肌肉组织在手术后第七天孵化与荧光素isothiocyanate-labeled CD31单克隆抗体和phycoerythrin-conjugated鼠anti-mouse c - kit (BD Pharmingen,圣地亚哥,CA)中描述(31日]。盖玻片是处理延长安装介质(分子探针,尤金或)用共焦显微镜观察和。

2.7。分析内皮祖细胞

在缺血性术后第七天,收集外周血(PB)和骨髓中描述(28]。EPC-like单核细胞(跨国公司)在PB和骨髓CD31⁺或c - kit⁺细胞流式细胞术。总之,PB或骨髓细胞使用鼠标anti-CD16⁺和CD32⁺马伯阻止non-antigen-specific绑定Fc的免疫球蛋白γ三世和足球俱乐部γ二世单核细胞的受体。PB或骨髓细胞被孵化phycoerythrin-conjugated鼠anti-mouse c - kit马伯,紧随其后的是荧光素isothiocyanate-conjugated鼠anti-mouse CD31马伯,用流式细胞术治疗后溶解的解决方案,这些细胞被离心机和流式细胞术分析悬浮在磷酸盐(总细胞数: 跨国公司)。所有抗体从BD Pharmingen流式细胞术分析。

2.8。骨骨髓来源EPC隔离和文化

骨骨髓来源EPC隔离和文化的骨髓细胞从CatK岁被孤立^−−/和CatK^{+ / +}老鼠( 每组)。隔离后单核细胞,骨骨髓来源c - kit⁺细胞被孤立使用CD117微和magnetic-activated细胞排序(mac)根据制造商的指示(Miltenyli研究,Bergisch-Gladbach,德国)。c - kit的⁺骨髓细胞CD31阳性> 90%⁺(描述的30.]。培养细胞展出EC表面标记:CD31和CD117。培养后在内皮生长medium-2 fibronectin-coated菜(EGM-2: Lonza Walkersville, MD)和2%胎牛血清(的边后卫)7天,EPC-like c - kit +细胞收集并用于细胞检测。

2.9。细胞迁移、入侵和扩散的化验

细胞增殖试验是使用细胞效价执行96年ao化验设备(Promega,麦迪逊,WI)。细胞被播种在gelatin-coated 96 -孔板 细胞在100年μL(内皮基底medium-2 (Lonza Walkersville, MD) / 0.3%牛血清白蛋白存在与否的VEGF (50 ng / mL) 48小时和评估。平均每组的值在一式三份,给出了吸光度的强度。

细胞迁移和入侵检测进行了缺氧条件下利用24-well Transwells板块。的细胞入侵和迁移到外膜使用Diff-Quik染色的染色5 - 7选择领域的解决方案和计算每个样本一式三份的钱伯斯高倍镜(200 x)。

2.10。Tubulogenesis化验

细胞 细胞/在24-well-plate培养24小时人工基底膜在内皮基底medium-2包含20 ng / mL的VEGF在缺氧条件下诱导tubulogenic响应。Tubulogenesis量化使用BZ-II分析仪和Exe 1.42软件(日本基恩士、大阪、日本)的数量和长度计算豆芽在六个领域的每一个。

2.11。统计分析

数据表示为 。我们进行了单向方差分析(方差分析)比较三个或更多的团体,紧随其后的是图基的事后测试或学生的 - - - - - -测试(用于比较两组)与SPSS软件版本。19.0 (SPSS,芝加哥,IL)。血流量数据受到双向重复测量方差分析和Bonferroni事后测试。抵押品毛细血管密度由两名观察员评估以盲目的方式和他们获得的值取平均值。概率( )值 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。老化受损血管对缺氧的反应

我们连续LSBFI分析表明,经济复苏的缺血性CatK岁/非缺血型血液流动比率^{+ / +}老鼠仍在随访期间受损(图1(一))。术后第14天,定量免疫染色显示,老年人小鼠毛细血管密度不仅非缺血型还低缺血性肌肉相比,年轻的老鼠(数字1 (b)和1 (c))。流式细胞仪显示的数量EPC-like CD31⁺/ c - kit⁺低细胞在骨髓和PB CatK岁^{+ / +}老鼠相比年轻的控制老鼠在手术后第七天(图2)。老龄化因此似乎损害ischemia-induced小鼠的血管生成和血管生成。

3.2。缺CatK骨髓受损EPC-like CD31⁺/ c - kit⁺细胞动员

已知骨骨髓来源的内皮祖细胞在缺血后新血管形成中发挥部分作用[3]。我们确定的潜在参与CatK EPC动员骨髓。我们评估了内皮祖细胞的动员CatK的骨髓^{+ / +}和CatK^{- / -}老鼠。流式细胞术结果显示CD31的数量明显减少⁺c - kit⁺细胞的PB CatK^−−/老鼠在缺血后第七天(数字3(一个)和3 (b))。然而,基因型之间没有显著差异的数量EPC-like CD31⁺c - kit⁺在骨髓细胞(数字3(一个)和3 (b))。同时,Catk缺陷降低了骨骨髓来源的c-Notch1和p-Akt蛋白质水平c - kit⁺细胞(数据3 (c)和3 (d))。如数据所示4(一)- - - - - -4 (e),CatK^{- / -}来源于c - kit的受损的骨头⁺细胞迁移、入侵、扩散和tubulogenesis。在手术当天7,immunocytofluorescence结果也显示CD31的数量急剧下降⁺/ c - kit⁺细胞缺血性CatK岁的肌肉^−−/老鼠比控制老鼠(图4 (f))。这些发现表明CatK不足可能会损害动员EPC-like细胞从骨髓进入循环支持相关的血管生成减少c-Notch1 / p-Akt信号激活的骨髓细胞EPC-like岁老鼠。

3.3。CatK不足会损害Ischemia-Induced血管生成

确定一个基因消融CatK ischemia-induced影响血管生成的老鼠在先进的年龄,我们遭受CatK^−−/和CatK^{+ / +}小鼠后肢缺血手术。串行LSBFI测量表明CatK^−−/抑制的恢复下肢灌注在随访期间,和缺血性比正常LSBFI在旧CatK显著降低^−−/老鼠相比,年龄控制老鼠(图5(一个))。正如预期的那样,CatK缺乏持续减少缺血性肌肉的毛细血管密度(数字5 (b)和5 (c))我们的研究结果表明,CatK可能导致血管生成在应对老年小鼠缺血受损。

3.4。CatK缺乏减少c-Notch1缺血性组织

作为一个潜在的血管生成中介,我们化验Notch1蛋白的表达在缺血性组织在手术后第七天。免疫印迹分析的结果表明,缺CatK c-Notch1的水平降低,p-Akt, VEGF在老年人缺血性组织老鼠CatK相比^{+ / +}老鼠(图6)。然而,没有显著差异Notch1和Akt总蛋白表达之间的两个基因型。也没有显著差异水平的c-Notch1 CatK之间的非缺血型的肌肉⁺/⁺和CatK⁻/⁻老鼠(数据未显示)。

4所示。讨论

在老化,atherosclerosis-related关键缺血和一种减毒能力应对缺血是截肢的主要原因和心血管疾病预后不佳。在这项研究中,我们评估的影响CatK aging-associated血管新生小鼠在先进的年龄,和我们的研究结果表明,CatK缺陷降低了复苏的血流量和降低骨骨髓来源内皮祖细胞的动员和导航支持相关的缺血性血管生成减少Notch1激活途径。

骨骨髓来源的政府或外围血液内皮祖细胞改善了缺血后新血管形成在各种实验和临床试验22,30.,32]。受损的血管生成在先进个人年龄可能是因为内部血管祖细胞的再生能力下降和/或下降proregenerative利基。然而,还不清楚许多蛋白酶。Urbich等人证明CatL和CatK内皮祖细胞表达的更强烈,而CatL EPC-induced所需新血管形成在缺血性肌肉6];他们没有观察CatK是否影响骨髓内皮祖细胞的动员年龄的动物。我们现在的流式细胞仪和免疫荧光分析显示,缺血后,有明显减少EPC-like CD31⁺/ c - kit⁺细胞年龄CatK PB和缺血性肌肉⁻/⁻老鼠的同龄CatK相比⁺/⁺老鼠。这些数据表明,CatK有着至关重要的作用在缺血性血管内皮祖细胞的动员和导航的新血管形成老化。CatK已经被证明可以促进内皮祖细胞的血管生成活性在年轻的老鼠,包括入侵和tubulogenesis [28]。药理CatK抑制展出的抑制性影响内皮祖细胞的增殖能力的年轻老鼠(28]。我们目前的研究结果表明,享年CatK⁻/⁻小鼠低水平的c-Notch1和p-Akt蛋白质来源于c - kit的骨头⁺控制细胞的细胞相比,享年CatK⁺/⁺老鼠。总的来说,这些观察结果表明,Notch1 / Akt信号激活还可以作为EPC的关键中介功能和动员我们的实验条件下小鼠血管化。

血管生成需要血管基底膜的降解和细胞外基质(ECM)的改造,以使内皮细胞迁移和入侵到周围组织(1]。许多蛋白酶(即。,MMP and serine protease family members) are involved in the degrading of ECM in angiogenesis processes [33]。在他们的评论,然而,van Hinsbergh等人表示,其他蛋白水解途径也在血管生成中发挥作用的行动在缺血性疾病(5]。半胱氨酸组织蛋白酶家族的成员之一,CatK是至关重要的细胞外I型胶原蛋白和弹性蛋白基质代谢[34),它是一个至关重要的候选矩阵退化在血管生成(28]。在目前的研究中,我们观察到CatK删除受损后肢缺血后血流量恢复和毛细血管的形成。我们还观察到c-Notch1和p-Akt减少CatK消融的老老鼠。Notch1受体是一个关键分子参与血管生成在成人(26]。Notch1胞内域c-Notch1最终裂解的γ分泌酶复杂而把dna结合蛋白质激活下游靶基因的转录相关的血管新生因子(26]。蛋白水解活性因此Notch信号转导的非常重要的一步。我们报道了CatK在Notch1的蛋白水解处理过程中发挥作用的敏感性γ分泌酶底物重组CatK (28]。目前的结果还表明,在小鼠岁CatK控制血管生成过程和CatK与Notch1 processing-related特性通过VEGF / Akt信号通路。Takeshita等人报道,内皮Notch1有着至关重要的作用在产后通过Akt通路血管生成(25]。总的来说,这些发现表明有一种蛋白激酶和切口信号激活血管生成之间的关系与年龄无关。

另一方面,最近的两个综合评论文章对老年性血管病理学证实的证据微血管贡献影响微血管密度,以及最近的调查结果显示运动的角色逆转微血管稀疏可能是由胰岛素样生长因子- 1 (IFG-1) [35,36]。积累临床和实验室证据表明锻炼增加血液流动的作用在改善血管完整性和刺激新血管形成的行为通过igf - 1岁的人类和动物。众所周知,有象变性和年龄敏感性之间的荷尔蒙igf - 1水平先进的年龄(37]。我们之前报道,老化受损的新血管形成来响应缺血性压力,与降低血浆VEGF水平下降骨髓EPC动员和归巢到动物缺血性血管(30.,31日]。因此,我们推测血管再生能力下降可能至少部分,由于EPC动员和功能的障碍,这是由年龄敏感性激素降低igf - 1岁的病人。

我们报道的小说发现CatK缺乏损害ischemia-induced新血管形成与减少c-Notch-Akt信号激活骨骨髓来源内皮祖细胞和缺血性肌肉的老老鼠。小说CatK目标的识别旨在调节血管再生的行动将有助于老年人的治疗策略来抢占截肢。

缩写

方差分析:	方差分析
CatK:	组织蛋白酶K
ECM:	细胞外基质
EGM-2:	内皮生长medium-2
LSBFI:	激光散斑血流成像
mac:	Magnetic-activated细胞分类
跨国公司:	EPC-like单核细胞
基质金属蛋白酶:	基质金属蛋白酶
铅:	外周血
扫描电镜:
VEGF:	血管内皮生长因子。

数据可用性

(1)所有数据用于支持本研究的结果中包括这篇文章。(2)所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突的披露关于这个手稿。

作者的贡献

XY和HJ进行实验和数据收集,分析和讨论了数据,导致了手稿的成分;黄建忠、XY和MX进行实验,收集数据,分析和讨论了数据;XWC管理和设计的研究中,处理资金,和写的手稿,修订和批准所有作者。

确认

这项工作的部分资金由中国教育部科研基金(81560149号,81760207,81560240,81770485)。

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