调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订)。实验动物研究委员会批准的协议是名古屋大学。我们CatK-deficient (CatK生成^−−/)C57BL / 6 j小鼠基因打靶小鼠胚胎干细胞的描述( 28),在这项研究中使用的老鼠≧96周的历史。

CatK^−−/和野生型(CatK^{+ / +})同窝出生仔畜控制受到单侧下肢缺血手术在氯胺酮(70毫克/公斤,制药制药、东京)和甲苯噻嗪(4.6毫克/公斤,拜耳制药、东京)麻醉( 30.]。在指定的时间点手术后,小鼠安乐死通过过量的氯胺酮和甲苯噻嗪混合物,然后骨骼肌切割出来,立即冻结在液氮温度前储存在−80°C到免疫印迹分析。

在指定的时间点,血流量的比值在正常肢体缺血,与激光散斑测量血流成像(LSBFI、Omegazone OZ-1,ω波,东京)中描述( 30.]。LSBFI,血流显示像素激光频率的变化的不同的颜色。血流扫描两次后,存储图像受到计算机辅助量化和缺血性和非缺血型四肢的平均流动计算。血流的定量分析的结果表示为左右(缺血)的比值(非缺血型)LDBF避免数据因环境光和温度变化。

我们检测内收肌的毛细血管密度剖面在术后第14天anti-CD31单克隆抗体(mAb)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。内皮细胞是量化通过测量CD31阳性细胞的数量每大功率领域(400×)( 30.]。我们测量5个随机选择的微观领域从5到7组织不同部分在每一块来确定每个肌纤维的毛细血管数量。

蛋白质被均质化与肌肉标本30分钟在冰冷的裂解缓冲(50毫米Tris-HCl, 1毫米EDTA, 150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 0.25% SDS, pH值7.4)补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒在10毫升(1片),1毫米原钒酸钠和氟化1毫米phenylmethylsulfonyl如[ 17]。等量(40 μg)的蛋白质受到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和electrophoretically转移到聚乙二烯二氟化物膜。这些墨迹是孵化主要抗体:总Notch1裂解Notch1 (c-Notch1),总Akt, phosphor-Akt (p-Akt) β肌动蛋白从细胞信号技术购买(波士顿)。血管内皮生长因子(VEGF)是购自圣克鲁斯生物技术。

免疫荧光分析,他们的固定和阻塞后,相应的肌肉组织在手术后第七天孵化与荧光素isothiocyanate-labeled CD31单克隆抗体和phycoerythrin-conjugated鼠anti-mouse c - kit (BD Pharmingen,圣地亚哥,CA)中描述( 31日]。盖玻片是处理延长安装介质(分子探针,尤金或)用共焦显微镜观察和。

在缺血性术后第七天,收集外周血(PB)和骨髓中描述( 28]。EPC-like单核细胞(跨国公司)在PB和骨髓CD31⁺或c - kit⁺细胞流式细胞术。总之,PB或骨髓细胞使用鼠标anti-CD16⁺和CD32⁺马伯阻止non-antigen-specific绑定Fc的免疫球蛋白 γ三世和足球俱乐部 γ二世单核细胞的受体。PB或骨髓细胞被孵化phycoerythrin-conjugated鼠anti-mouse c - kit马伯,紧随其后的是荧光素isothiocyanate-conjugated鼠anti-mouse CD31马伯,用流式细胞术治疗后溶解的解决方案,这些细胞被离心机和流式细胞术分析悬浮在磷酸盐(总细胞数: 2 × 10 4 跨国公司)。所有抗体从BD Pharmingen流式细胞术分析。

骨骨髓来源EPC隔离和文化的骨髓细胞从CatK岁被孤立^−−/和CatK^{+ / +}老鼠( n = 5 每组)。隔离后单核细胞,骨骨髓来源c - kit⁺细胞被孤立使用CD117微和magnetic-activated细胞排序(mac)根据制造商的指示(Miltenyli研究,Bergisch-Gladbach,德国)。c - kit的⁺骨髓细胞CD31阳性> 90%⁺(描述的 30.]。培养细胞展出EC表面标记:CD31和CD117。培养后在内皮生长medium-2 fibronectin-coated菜(EGM-2: Lonza Walkersville, MD)和2%胎牛血清(的边后卫)7天,EPC-like c - kit +细胞收集并用于细胞检测。

细胞增殖试验是使用细胞效价执行96年ao化验设备(Promega,麦迪逊,WI)。细胞被播种在gelatin-coated 96 -孔板 5 × 10 3 细胞在100年 μL(内皮基底medium-2 (Lonza Walkersville, MD) / 0.3%牛血清白蛋白存在与否的VEGF (50 ng / mL) 48小时和评估。平均每组的值在一式三份,给出了吸光度的强度。

细胞迁移和入侵检测进行了缺氧条件下利用24-well Transwells板块。的细胞入侵和迁移到外膜使用Diff-Quik染色的染色5 - 7选择领域的解决方案和计算每个样本一式三份的钱伯斯高倍镜(200 x)。

细胞 2 × 10 4 细胞/在24-well-plate培养24小时人工基底膜在内皮基底medium-2包含20 ng / mL的VEGF在缺氧条件下诱导tubulogenic响应。Tubulogenesis量化使用BZ-II分析仪和Exe 1.42软件(日本基恩士、大阪、日本)的数量和长度计算豆芽在六个领域的每一个。

数据表示为 意味着 ± 扫描电镜 。我们进行了单向方差分析(方差分析)比较三个或更多的团体,紧随其后的是图基的事后测试或学生的 t 以及(用于比较两组)与SPSS软件版本。19.0 (SPSS,芝加哥,IL)。血流量数据受到双向重复测量方差分析和Bonferroni事后测试。抵押品毛细血管密度由两名观察员评估以盲目的方式和他们获得的值取平均值。概率( p )值 p < 0.05 被认为是重要的。

我们连续LSBFI分析表明,经济复苏的缺血性CatK岁/非缺血型血液流动比率^{+ / +}老鼠仍在随访期间受损(图 1(一))。术后第14天,定量免疫染色显示,老年人小鼠毛细血管密度不仅非缺血型还低缺血性肌肉相比,年轻的老鼠(数字 1 (b)和 1 (c))。流式细胞仪显示的数量EPC-like CD31⁺/ c - kit⁺低细胞在骨髓和PB CatK岁^{+ / +}老鼠相比年轻的控制老鼠在手术后第七天(图 2)。老龄化因此似乎损害ischemia-induced小鼠的血管生成和血管生成。

已知骨骨髓来源的内皮祖细胞在缺血后新血管形成中发挥部分作用[ 3]。我们确定的潜在参与CatK EPC动员骨髓。我们评估了内皮祖细胞的动员CatK的骨髓^{+ / +}和CatK^{- / -}老鼠。流式细胞术结果显示CD31的数量明显减少⁺c - kit⁺细胞的PB CatK^−−/老鼠在缺血后第七天(数字 3(一个)和 3 (b))。然而,基因型之间没有显著差异的数量EPC-like CD31⁺c - kit⁺在骨髓细胞(数字 3(一个)和 3 (b))。同时,Catk缺陷降低了骨骨髓来源的c-Notch1和p-Akt蛋白质水平c - kit⁺细胞(数据 3 (c)和 3 (d))。如数据所示 4(一)- - - - - - 4 (e),CatK^{- / -}来源于c - kit的受损的骨头⁺细胞迁移、入侵、扩散和tubulogenesis。在手术当天7,immunocytofluorescence结果也显示CD31的数量急剧下降⁺/ c - kit⁺细胞缺血性CatK岁的肌肉^−−/老鼠比控制老鼠(图 4 (f))。这些发现表明CatK不足可能会损害动员EPC-like细胞从骨髓进入循环支持相关的血管生成减少c-Notch1 / p-Akt信号激活的骨髓细胞EPC-like岁老鼠。

确定一个基因消融CatK ischemia-induced影响血管生成的老鼠在先进的年龄,我们遭受CatK^−−/和CatK^{+ / +}小鼠后肢缺血手术。串行LSBFI测量表明CatK^−−/抑制的恢复下肢灌注在随访期间,和缺血性比正常LSBFI在旧CatK显著降低^−−/老鼠相比,年龄控制老鼠(图 5(一个))。正如预期的那样,CatK缺乏持续减少缺血性肌肉的毛细血管密度(数字 5 (b)和 5 (c))我们的研究结果表明,CatK可能导致血管生成在应对老年小鼠缺血受损。

作为一个潜在的血管生成中介,我们化验Notch1蛋白的表达在缺血性组织在手术后第七天。免疫印迹分析的结果表明,缺CatK c-Notch1的水平降低,p-Akt, VEGF在老年人缺血性组织老鼠CatK相比^{+ / +}老鼠(图 6)。然而,没有显著差异Notch1和Akt总蛋白表达之间的两个基因型。也没有显著差异水平的c-Notch1 CatK之间的非缺血型的肌肉⁺/⁺和CatK⁻/⁻老鼠(数据未显示)。