在富含血小板血浆中BMSCs /软骨细胞砖平衡期间SOX9表达促进了BMSCs稳定的3-D细胞内微环境的构建

摘要

Sox9的是与确定和骨髓的软骨细胞系的维持间充质干细胞（BMSC）的特性的转录因子。在最近的研究中，我们已经证明了软骨碎片聚集体（细胞砖）可促进体内骨髓基质干细胞的软骨。但是，它仍是未知的BMSCs /软骨细胞砖的比率是否对3-d软骨再生和相关分子机制影响显著。To address this issue, the current study subcutaneously injected three groups of cell complex with different rabbit BMSCs/chondrocyte bricks’ ratios (1 : 2, 1 : 1, and 2 : 1) into nude mice. Gross morphology observation, histological and immunohistochemical assays, biochemical analysis, gene expression analysis, and western blot were used to compare the influence of different BMSCs/chondrocyte bricks’ ratios on the properties of tissue-engineered cartilage and explore the related molecular mechanism. The constructs of 1 : 1 BMSCs/chondrocyte bricks, (B1CB1) group resulted in persistent chondrogenesis with appropriate morphology and adequate central nutritional perfusion without ossification. The related mechanism is that increased expression of Sox9 in the B1C1 group promoted chondrogenesis and inhibited the osteogenesis of BMSCs through upregulating Col-II as well as downregulating RUNX2 and downstream of Col-X and Col-I by upregulating Nkx3.2. This study demonstrated that BMSCs/chondrocyte bricks 1:1 should be a suitable ratio and the Sox9-Nkx3.2-RUNX2 pathway was a related mechanism which played an important role in the niche for stable chondrogenesis of BMSCs constructed by chondrocyte bricks and PRP.

1.介绍

由于软骨在体内的再生能力较差，软骨缺损的修复一直是治疗中的一大挑战[1］.植入由自体软骨细胞组成的工程结构是目前流行的方法[2］.然而，在体外膨胀后缺乏自体软骨源和软骨细胞消化剂是软骨细胞的软骨组织工程临床应用的主要障碍[3.］.此外，具有特定形状或自体软骨的移植假体植入可导致并发症的二次畸形或结果，包括免疫排斥，感染和挤压[4］.

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)存在于人体的众多组织中，具有自我更新的能力[5]脑菌分化[6］.此外，MSC可以在体外容易地培养和膨胀，这使得它们为软骨修复提供了特别有吸引力的细胞源[7］.以前的研究表明，骨髓间充质干细胞（BMSC）更容易获得比滑膜间充质干细胞（SDSC），并具有较高的增殖速率以及软骨特异性基因和蛋白质比脂肪间充质干细胞（ADSC中）更高的表达[8，9]，BMSC在软骨再生中已被广泛研究[10.］.然而，当由生长因子（如转化生长因子）诱导时，BMSCs易于分化成骨细胞。β1 (TGF -β1)、骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)或成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2) [11.- - - - - -13.］.结果，工程化的软骨组织最终血管化和体内储备[14.，15.］.

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养是一种很有前途的方法，因为软骨细胞可以促进骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞谱系[16.］.此外，软骨细胞和细胞外基质（ECM）可以为骨髓干细胞提供软骨形成的环境，可以在同一时间抑制肥大[17.］.此外，通过共培养方法减少了软骨细胞的消耗。通过收获小软骨活组织检查，可以修复大缺陷。尽管具有高比率MSC的胶囊成功地修复了软骨缺陷的软骨缺陷等小尺寸软骨缺损，如关节软骨缺陷，长期研究与共培养的疗效加强MSCs的致密分化，进入软骨内的血液化谱系修复大型非复交位点的软骨缺陷仍然是势不必必行的[18.，19.］.这部分是因为复杂的，精致，三维（3-d）培养系统所必需的两个初始软骨和维持软骨细胞表型的。

我们使用了由软骨细胞聚集体（软骨细胞砖）和PRP构建的三维微环境，用于体内BMSC的稳定软骨发生[20.］.我们发现该系统有效地促进了BMSC的软骨发生。为了解决有限的软骨细胞来源的问题，我们希望使用更多的BMSC而不是软骨细胞来构建工程化软骨。然而，当BMSCs比例高于体内长期生长后BMSCs的比例高于软骨细胞的比例时偶尔发生骨化。没有研究表明，体内BMSC和软骨细胞砖（原发性软骨细胞）具有良好的比例，这是进一步有效地应用组织工程软骨的重要信息。为了解决这些问题，我们使用先前建立的方法制备了PRP中的三种细胞复合物，不同的BMSC /软骨细胞砖的比例。在这里，通过评估组织学，糖胺聚糖（Gag）和胶原含量和相关基因表达，将用不同细胞和耳硬细胞砖的不同细胞混合比（BMSCs和耳廓软骨砖的不同细胞混合比构成的形状保留和质量进行了比较。在这项研究中，我们研究了BMSC /软骨细胞砖的比例和相关分子机制对BMSCS稳定诱导的软骨晶体谱系的影响。

2.材料和方法

2．1.细胞隔离

所有动物实验都是由第四军医大学的制度畜牧业和使用委员会批准，PR中国西安（2015年-KQ-002）。BMSCs和软骨细胞从4周龄新西兰兔子中分离出来（ ，购自中国西安第四军医大学动物中心)如前所述[20.］.简单地说，经过物理破坏后，用40毫升Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM;HyClone, Logan City, Utah, USA)， 1500 rpm离心5分钟。去除上清液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，然后用含10%胎牛血清(HyClone)的DMEM低糖重悬(50)μ.青霉素G /ml, 30μ.100μg/ ml链霉素（Amresco公司，克利夫兰，俄亥俄州，美国）。Primary cells were seeded in a 75 cm²文化烧瓶 核细胞/厘米²在补充10％胎牛血清（Hyclone），L-谷氨酰胺的DMEM低葡萄糖（272 μ.g / ml;Amresco），抗坏血酸-2-磷酸盐（50 μ.g / ml;西格玛，圣路易斯，莫，美国），50 μ.青霉素G /ml, 30μ.g/ml链霉素(Amresco)(培养基I)， 37°C, 5%二氧化碳孵育。3天后，第一次换培养基时，将非贴壁细胞去除。其余贴壁细胞进一步培养，每3天更换一次培养基。贴壁细胞孵育至细胞克隆融合度超过80%后，用0.25%胰酶(HyClone)消化，在培养液中传代 细胞/ cm.²．传代1细胞(补充图)1A）用于通过Beckman VI-Cell XR Cell Cell柜台（Beckman Coulter，America）进行细胞计数和测试后进一步的实验。

软骨细胞砖由片段化的软骨细胞膜制成，其在膜形成培养基中增强（DMEM高葡萄糖补充有20％胎牛血清（Hyclone，Logan City，Utah，USA），L-谷氨酰胺（272 μ.g / ml;抗坏血酸-2-磷酸盐(50μ.g / ml;西格玛，圣路易斯，莫，美国），50 μ.青霉素G /ml, 30μ.g/ml链霉素(克利夫兰，俄亥俄州，美国))(medium II)的自制切割系统，根据以前建立的方法[20.］.简单地说，用Beckman Vi-Cell XR Cell Counter (Beckman Coulter，美国)对采集的耳软骨细胞进行计数和检测，并在培养皿中培养 细胞/ cm.²在介质II中的六孔板中（补充图。1B.)．在第10天，当形成软骨细胞的固体白色膜，将膜在一个自制切割系统以实现软骨细胞砖（补充图分段。1C-E.)．

２.２.结构体的制备与动物实验

富含血小板的血浆（PRP）富含雄性兔全血（ ，New Zealand white rabbits weighing 2.5 to 3.0 kg, purchased from the animal center of The Fourth Military Medical University, Xi’an, China) by a two-step centrifugation process, as described elsewhere [20.］.简而言之，从每只兔子的心室吸入18毫升全血，分为两个无菌管，每个含有1ml柠檬酸钠（3.8％）溶液作为抗凝血剂。然后将管在室温下在离心机中以1,800rpm旋转8分钟，并且血液分为三个阶段：血小板差的血浆（顶部），prp（中间）和红细胞（底部）（补充图。1F.)．将上层和中层转移到新的试管中，再以3600转/分离心8分钟。丢弃上清血浆，将含有沉淀血小板的剩余2ml血浆均匀混合，指定PRP。将最终血小板浓度调整为 ．PRP被保存在冰中以备进一步处理。

根据第四军医大学委员会的体制指南进行小鼠的护理和操作程序。将十八周龄雄性裸鼠随机分为三个群体（ 在每组中，从第四军医大学的动物中心购买22至26克，西安，中国）：B1CB2组（BMSCs / Chondrocyte砖'比例为1：2，BMSCs， ；原发性软骨细胞， ），B1CB1组(BMSCs/软骨细胞砖比1:1,BMSCs， ；原发性软骨细胞， ），B2CB1组（BMSCs / Chondrocyte Bricks'比例为2：1，BMSCs， ；原发性软骨细胞， )．小鼠术前适应1周，监测小鼠的一般外观、活动、排泄和体重。总的来说, 细胞在指定的细胞比例悬浮在500 μ.在复合物混合50后，PRP通过16g针皮下注射到裸鼠中，将16g针刺到裸鼠中 μ.L的血栓形成剂（100u / ml在100mg / ml氯化钙中; villalba，马德里，西班牙生物医学）（补充图。1小时，一)．

2.3。大体形态

将样品在假射后的14周从周围组织中解剖，用于测量湿重，厚度和体积，如前所述[20.］.简言之，将样品体积通过水中置换法测定的。将试样固定用缝合线并随后下落轻轻放入装有水的量规;之前和之后的样品浸入水中体积的方差被计算并转化为样品体积。测量之前，将样品用于轮廓变形进行评价。

2.4。生物力学和生化分析

根据Zhang等人描述的那些，在生物力学试验机上分析了工程和正常软骨的机械性能（Instron-5542，Canton，MA）。[21.］.简单地说，施加恒定的压缩应变率0.5 mm/min，直到达到最大变形的80%，并生成应力应变曲线。根据应力应变曲线的斜率计算被测组织的杨氏模量。将工程软骨的杨氏模量与正常软骨进行比较。结果显示为杨氏模量比。

机械测试后，收集样品并切碎用于DNA，GAG和胶原量化。胶原蛋白和糖胺聚糖（GAG）定量的方法描述了[20.］.简而言之，碎成1毫米的样品的部分样品^3.用胃蛋白酶(1 mg/ml, 0.5 M乙酸;MP, Santa Ana, California, USA)和木瓜蛋白酶提取试剂(Sigma, St. Louis, MO, USA)测定胶原蛋白和GAG含量。然后，用Sircol™胶原蛋白测定法(S1000;Biocolor, Carrickfergus, UK)和Blyscan™GAG检测试剂盒(B1000, Biocolor, Carrickfergus, UK)，然后根据试剂盒说明，从胶原蛋白和GAG标准曲线计算每湿重构建的胶原蛋白和GAG。根据制造商的说明，使用Quant-iT dsDNA检测试剂盒和Qubit荧光计系统(Invitrogen公司)测定DNA含量。最终结果为每DNA中胶原蛋白和GAG的含量。

2.5。组织学和免疫组织化学测定

样本被切成6个μ.后米的部分被固定在多聚甲醛中并包埋在石蜡中。苏木精和曙红（H＆E），番红-O，Masson三色，和Von Kossa染色根据标准程序进行。Two-step indirect immunohistochemical staining was performed to investigate the expression of type I, type II, and type X collagen in matrices using a primary anti-collagen type I antibody (mouse anti-rabbit, 1 : 50; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-collagen type II antibody (mouse anti-rabbit, 1 : 50; Acris, Herford, Germany), and anti-collagen type X antibody (mouse anti-rabbit, 1 : 50; Abcam, Cambridge, MA, USA), followed by a horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody (1 : 200 in PBS; Santa Cruz, Dallas, Texas, USA) and color development with diaminobenzidine tetrahydrochloride (Santa Cruz, Texas, USA). The sections were counterstained with hematoxylin solution (Mayer’s).

2.6。RNA分离和实时RT-PCR

通过RNAISO加（Takara，Shiga，Japan）从不同组和兔耳廓软骨中提取的总RNA，其次是一步酚氯仿亚氨基醇提取，如制造商的协议所述。使用七种基因-SOX9，胶原（COL1A1），COL-II（COL2A1），COL-X（COL10A1），NKX3.2，RUNX2和GAPDH-ob-II（COL1A1），COL-X（COL10A1），NKX3.2，RUNX2和GAPDH-PCR分析实时RT-PCR分析One-StepSybr®Primescript™RT-PCR套件（Takara，Shiga，Japan）。实时RT-PCR的结果复制五次，并作为靶基因表达呈现，首先在同一样品中的GAPDH（δ.Ct)，然后在作为天然对照的兔耳软骨中测量靶基因的表达(ΔδCt)。2^{- - - - - -ΔδCt}方法用于比较三组基因表达的差异。Takara设计的兔底漆序列并在本研究中使用的序列1．

2.7。Western印迹分析

收获的新鲜样品在液氮中研磨并用哺乳动物蛋白提取试剂（Pierce，罗克福德，IL，USA），补充有完全蛋白酶抑制剂裂解。皮尔斯BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce）来测定总蛋白含量，将其调节至10 μ.克/μ.湖样品（10. μ.升）上样到10-14％SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，Bedford，MA，USA）。将膜用0.05％Tris-缓冲盐水/吐温20（TBST）5％脱脂牛奶1小时阻断。Then, the membrane was incubated at 4°C overnight with the following primary antibodies: anti-Sox9 (Abcam, Cambridge, MA, USA, 1 : 500) and anti-β-actin (Cell Signaling, Danvers, MA, 1 : 1000). After further washes, the chemiluminescence of the blot was processed with the ECL western blotting substrate (Pierce).

2.8。数据分析

所有结果都表示为 偏差。使用SPSS 17.0软件（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计分析。在数据符合正态分布的前提下，单向ANOVA用于多组比较，其次是Tukey的诚实差异测试; 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。BMSC /软骨细胞砖比率对新出农病软骨变形及收缩的影响

在目前的研究中，软骨细胞砖和PRP用于通过皮下空间中的COTANS持续到BMSC的软骨发生，为BMSCs进行软化的Niche。如图所示1，all the specimens in the 1 : 2 BMSCs/chondrocyte bricks’ group (B1CB2), 1 : 1 BMSCs/chondrocyte bricks’ group (B1CB1), and 2 : 1 BMSCs/chondrocyte bricks’ group (B2CB1) formed homogeneous cartilage-like tissues with a white, pearly, opalescent appearance after 14 weeks of subcutaneous implantation (Figures1(一)-1（C））。B2CB1组的概要与B1CB1组的概要不一样平滑。当我们观察样本的横截面时，我们发现B1CB2组中央部分发生了坏死（图1（d））。为了定量评估BMSC /软骨细胞砖的影响对新出生软骨的变形和收缩的影响，我们在术后14周测量再生组织的体积，厚度和湿重。虽然B1CB1的卷（ ）和b1cb2组（ ）几乎是相同的，它们显着高于B2CB1组（ ， ）(图1(h))。如图1(g)显示，B1CB1组的平均湿重( ）显着高于B1CB2组（ ， ）和B2CB1组（ ， )．因此，B1CB1组的厚度测量( ）显着高于B2CB1组（ ， ）和B1CB2组（ ， ）(图1（一世））。所有上述结果表明，BMSCs /软骨细胞砖的比例为1：1是保持新出生软骨形态的最佳选择。

3.2。BMSCs /软骨细胞砖的平衡改善了体内BMSCs的异位软骨发生

为了检查再生组织的软骨特性，进行组织学，Safranin-O染色和II型胶原免疫染色，以进一步揭示改造结果和工程组织的不同组织学结构。在体内14周后，B1CB1和B2CB1组中的样品在整个移植物中呈现新出生的软骨组织形成，与B1CB2组中的中央坏死相反。在B1CB1和B2CB1组的内部可以观察到细胞存活和组织发育。在B1CB2组中，具有ECM包围的LECUNA的圆形细胞区域，其是典型的软骨形态，稀疏地分布在形成的组织内。在B1CB1组的先前冷凝区域内更深的Safranin-O染色和Col-II免疫染色显示BMSC的细胞发生比其他两组（图2（c）和（d），（h）和（i）和（m）和（n））。此外，B1CB1组中发现了软骨区域的合并和软骨壳的出现（图2(f))。虽然在B2CB1组也可以观察到软骨壳，但骨化现象尤其出现在样本的外部区域(图)2（k））。在B1CB2组中，样品周围的软骨壳显而易见，作为中央部分的坏死（图2（一种））。

为了进一步研究BMSCs /软骨细胞砖的影响对软骨发生的影响，进行三组样品中的胶原和胶原的定量。如图3.显示，B1CB1 ( ）和b1cb2（ ）显著高于B2CB1组( ， )．因此，B2CB1组的每个DNA的胶原蛋白含量（ ）显着低于B1CB1（ ， ）组和B1CB2组（ ， )．更重要的是，B2CB1的每个DNA的GAG和胶原蛋白含量显着低于正常软骨（GAG ， ；胶原 ， ）（数字3(一个)和3 (b))．这些结果表明，B2CB1组中软骨发生的促进并不像其他两组那样有效。为了测试工程化软骨的机械性能以进行未来的临床治疗，我们将年轻的三组的Moduli与皮下孵育14周后与常见的耳廓软骨相比。B1CB1组的杨氏模量约为92.6％的正常耳软骨。由于中央坏死的原因，B1CB2组的杨氏模量仅达到了普通耳软骨的61.7％，其显着低于B1CB1组（ )．然而，B2CB1组的杨氏模量（近156.1％的正常耳软骨）明显高于B1CB1和B1CB2组（ ）因为骨化(图3（c）)．这些结果表明了B1CB1组的临床优势。

3.3。较高比例的软骨细胞砖可防止BMSCs在皮下无晶体位点

Masson的血管颗粒，von Kossa染色和类型和x胶原免疫染色，以分析BMSC /软骨细胞砖比预防皮下无复杂位点的BMSCs的血吸虫学和骨化的影响。von kossa染色显示，钙，显示为黑色晶体，沉积在样品之外，B2CB1组发生肥厚过渡（图4（l））。Masson三色染色的样品表现出的生产B2CB1组，这证实了成熟骨的形成成熟的胶原蛋白（图4（k））。相比之下，在B1CB1和B1CB2组中没有显示沉积沉积或软骨胶原蛋白的产生，从而呈现软骨性性能（图4的（a）和（b）和（f）和（g））。以进一步识别肥大过渡和在不同组中的BMSCs植入骨化，免疫染色I和X型胶原进行类型。根据组织学检查，新成立的ECM呈现更深的染色I型胶原和X型胶原。上述蛋白的较高的表达所指示的B2CB1组中暴露于主机体骨髓干细胞经历了增生性过渡和骨化（图4(m)和(n))。相比之下，B1CB1和B1CB2组的两种胶原蛋白的微弱染色表明，这两组的BMSCs维持低水平的I型和X型胶原蛋白染色，并在14周内避免皮下非软骨源性部位的骨化(图)4(c)及(d)及(h)及(i))。

3.4。通过软骨细胞砖和PRP导向稳定的BMSC稳定的软骨发生，SOX9在SOX9中的表达更高表达

我们监测了三组细胞和天然软骨中Col-I、Col-II和Col-X的转录水平(图)5（b）和5（d）)．如图所示5（b），B1CB1和B1CB2基团中COL-II基因的表达水平明显高于B2CB1组中的基因（ )．相比之下，在14周内，B2CB1组的肥厚标记物Col-X表达显著升高(图)5（c））（ )．因此，在B2CB1组中，骨化-COL-I表达的遗传标记比其他两组（图5（d））（ )．这些结果证实了组织学观察，并提出了软骨细胞砖在微环境中发挥了重要作用，并且软骨细胞砖的高比例促进了软骨发生并防止了BMSC的骨化。

此外，我们监测Sox9的表达水平。实时定量RT-PCR检测结果显示Sox9基因在B1CB1和B1CB2组的转录水平明显高于B2CB1高（ ）(图5（a）)．B1CB1和B1CB2组中软糖基因COL-II的表达水平显着较高（ ）(图5（b）)，而B2CB1组的RUNX2和成骨基因及其下游基因COL-X和COL-I水平显著高于其他两组( ）（数字5（c）-5（e）)．更有甚者，Nkx3.2的表达水平用作RUNX2的B2CB1组中阻抑物是比B1CB2和B1CB2组显著下（ ）(图5（f）)．Western印迹的结果还证实，B2CB1组中SOX9的表达水平明显低于其他两组（ ）(图5（g）)．

4。讨论

用特定形状的工程软骨挑战是在体内达到足够合适的细胞进行播种[16.，21.，22.］.虽然有限数量的分离软骨细胞可以被充分放大，但种子软骨细胞显示脱分化，导致新软骨的生物和力学稳定性受损[23.］.最近，BMSCs和软骨细胞的共培养已被广泛研究软骨组织工程[21.，24.］.除了减少软骨细胞对软骨构建的消耗外，已经证明骨髓间充质干细胞与软骨细胞在体外或体内共培养可以生成软骨组织[25.，26.］.进一步的研究表明，在PRP中均匀地分散的软骨细胞聚集体（软骨细胞砖）可以在非复杂位点提供软骨内的乳蛋白[20.[证实，通过软骨细胞砖的共培育，通过细胞果实增强了BMSCs的增殖和软骨性分化能力和稳定性。还应注意，BMSC可以由在共培养系统中的软骨细胞砖提供的软骨细胞微环境比通过生长因子介导的软骨内诱导更常规地诱导。27.］.更重要的是，Fischer等人[12.]发现软骨细胞分泌的甲状旁腺激素相关蛋白能有效抑制共培养诱导微环境骨髓基质细胞的肥大。

然而，当BMSCs的比例高于软骨细胞砖之后，在长期生长之后BMSCs的比例较高，例如在体内的鼻鼻肌等鼻延伸等鼻子增加的兔子中的免疫动物如兔的长期生长之后，易于血糖织物的比例。没有系统的比较研究，以确定有效的BMSC /软骨细胞砖比的体内工程软骨的高效施工。为了避免外部因素的干扰，研究了兔BMSCs和软骨细胞砖的三种混合比（BMSC /原始软骨细胞计数为1：2,1：1和2：1）对PRP构建体中的细胞和成骨分化的影响并比较裸鼠工程软骨的形状保留和质量。形状的测定表明，BMSC /软骨细胞砖的1：1的比例对工程化软骨形态的稳定性效果更好。通过在细胞外基质中的胶原和GAG和杨氏模量比与正常耳廓软骨相比，通过评估工程化软骨的质量。该研究的结果表明，在工程软骨中，软骨细胞砖的较高比例可以显着增加每个DNA的GAG和胶原含量，这可以改善BMSC软骨发生和组织工程化软骨形成。特别地，软骨细胞砖中足够的ECM为周围压力提供了足够的内在抗性，并且在皮下环境中使形态维持能够。然而，在新出生软骨中央部分导致坏死的软骨细胞砖的高比率将不可避免地影响其机械强度和临床应用。同样，在B2CB1组中发生的骨化也对未来的临床治疗产生了不利影响。 When we increased the ratio of BMSCs in the complex, an overly high ratio of BMSCs could lead to ossification outside the constructs, which would reduce the elasticity of the constructed cartilage. In this study, we proved that the balance of BMSCs and chondrocyte bricks was important for stable morphology and chondrogenesis as well as prevention of ossification, which provided tissue-engineered cartilage with excellent mechanical property for future clinical treatment.

以前的研究表明，软弱性诱导的MSCs在体外易于在皮下植入后用血管侵袭进行钙化[28.，29.］.因此，在皮下环境中MSCs软骨形成的主要挑战不是软骨形成的失败，而是未能维持软骨表型。本研究的一个重要发现是，较高的骨髓间充质干细胞/软骨细胞砖比率将降低保护骨髓间充质干细胞防止皮下非软骨源性部位骨化的效率。体内实验结果显示，软骨内成骨始于邻近宿主组织的骨髓间充质干细胞。我们怀疑较高的骨髓间充质干细胞/软骨细胞砖比值导致骨髓间充质干细胞暴露于皮下非软骨源性部位，这是由于外周PRP的快速降解所致。这种开放的微环境无法保留软骨细胞和ECM释放的旁分泌软骨因子，无法保护骨髓间充质干细胞免受成骨因子的干扰，导致骨髓间充质干细胞进行性骨化。由于裸鼠寿命的限制，为了进一步研究，我们将使用兔耳和关节缺损模型来验证我们的结果。

共培养对体内PRP构建体中软骨和骨质表型的影响是多种因素的结果，包括生长因子[30.］.来自MSC和软骨细胞的可溶性因子的相互作用以及PRP在软骨菌和骨质发生分化期间多次发挥重要作用[31.］.MSCs分化的决定取决于两个主要转录因子:Sox9用于软骨形成，RUNX2用于骨形成[32.，33.］.Sox9通过正向调节MSC分化，在促进软骨分化中起主导作用，并通过Nkx3.2直接抑制RUNX2 [34.，35.］.RUNX2表达刺激成骨细胞谱系的分化，并通过调节成熟成肥大软骨细胞促进软骨细胞发育[36.］.在我们的研究中，我们发现Sox9、RUNX2、Nkx3.2、COL-I、COL-II和COL-X的表达水平随BMSCs/软骨细胞砖比率的变化而变化。软骨细胞砖比例高时，Sox9的表达水平显著升高。此外，软骨形成标记基因COL-II的表达水平在较高比例的软骨细胞砖组(B1CB1和B1CB2)中上调。相反，肥大和骨化相关基因RUNX2在bmmsc组中显著高比例升高，其下游基因COL-X和COL-I在b2cb1组中表达上调。同时，上游基因Nkx3.2在B1CB1和B1CB2组的表达水平显著上调。与成骨的组织学结果相关的预防,Sox9的表达水平增加,软骨细胞的增加砖比,表明Sox9-Nkx3.2-RUNX2通路发挥了重要作用的利基bmsc由软骨细胞砖和PRP的软骨形成。由于细胞种类的限制，Sox9与人类细胞中其他生长因子的相互作用的研究仍在进行中。

5。结论

The study demonstrated that the balance of BMSCs and chondrocyte bricks played a leading role in maintaining stable chondrogenesis and inhibiting ossification of BMSCs in PRP constructs after subcutaneous injection in nude mice and that a 1 : 1 BMSC/chondrocyte bricks’ ratio should be a relatively suitable ratio for cartilage regeneration in vivo. Moreover, the increased expression of Sox9 associated with the balance of BMSCs/chondrocyte bricks was a related factor in maintaining a chondrogenic lineage of BMSCs in the 3-D chondrogenesis microenvironment we constructed.

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

R.B.和Y.Z.构思和设计了这项研究，R.B. y.d.和S.L.设计和执行了实验。L.K.和G.W.分析了数据和模型。R.B.和B.L.写了论文。S.L.、B.L.和Y.Z.修改了论文。

致谢

我们非常感谢魏武提供的宝贵技术支持。基金资助:国家自然科学基金项目(No. 81600830);陕西省自然科学基金项目(No. 2017JQ8035)。

补充材料

补充图1:构建物制备及动物实验:(A) BMSCs。(B)软骨细胞。(C-E)实现软骨细胞砖的过程。(F) PRP的制作过程。(G)移植前用PRP构建细胞复合物。(设定h)皮下注射。（补充材料）

参考

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