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SCI

干细胞国际

1687 - 9678 1687 - 966 x

Hindawi

10.1155 / 2020/5492059 5492059

研究文章

增加表达Sox9的bmsc /软骨细胞平衡砖中富含血小板血浆促进建设一个稳定的3 d软骨形成bmsc的微环境

https://orcid.org/0000 - 0002 - 3535 - 8155 英航 Ruikai ¹

香港梁 ² 吴国峰 ³ 刘羽 ⁴ 越南盾杨ydF4y2Ba ¹

https://orcid.org/0000 - 0003 - 0876 - 2248 李贝 ⁴

https://orcid.org/0000 - 0002 - 8743 - 9643 赵伊敏 ¹

Najimi 幕斯塔法

^{1

军事口腔学的国家重点实验室

部门的假牙修复术

口腔学学院

第四军医大学

长乐西路145

西安

中国

fmmu.edu.cn} ^{2

军事口腔学的国家重点实验室

颌面外科学系

口腔学学院

第四军医大学

长乐西路145

西安

中国

fmmu.edu.cn} ^{3

部门的假牙修复术

口腔学学院

南京大学

中央路

30日南京

中国

nju.edu.cn} ^{4

军事口腔学的国家重点实验室

组织工程中心

口腔学学院

第四军医大学

长乐西路145

西安

中国

fmmu.edu.cn}

2020年

26 5 2020年

2020年 02 01 2020年 03 03 2020年 17 03 2020年 26 5 2020年

这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Sox9是一个内在相关转录因子的决心和维护chondrogenic血统的骨髓间充质干细胞(bmsc)。在最近的研究中,我们证明了分散的软骨细胞总量(细胞砖)可以促进企业综合体内软骨形成。然而,这仍然是未知的bmsc /软骨细胞的比率是否对3 d软骨再生砖有重要影响和相关的分子机制。为了解决这个问题,目前的研究皮下注射三组不同的兔子bmsc /软骨细胞与细胞的复杂砖的比率(1:2、1:1,2:1)裸小鼠。总值形态学观察、组织学和免疫组织化学检测、生化分析、基因表达分析和免疫印迹被用来比较不同bmsc /软骨细胞的影响砖的比率在组织工程软骨的属性和探索相关的分子机制。1:1的构造bmsc /软骨细胞砖(B1CB1)集团与适当的形态学和导致持久的软骨形成足够的营养灌注无骨化中心。相关机制,增加表达Sox9 B1C1组促进软骨形成和抑制bmsc的骨移植Col-II以及表达下调RUNX2和下游Col-X和Col-I上调Nkx3.2。这项研究表明,bmsc /软骨细胞砖1:1应该是一个合适的比例和Sox9-Nkx3.2-RUNX2通路是一个相关的机制发挥了重要作用的利基稳定的bmsc由软骨形成软骨细胞砖和PRP。山'xi省自然科学基金 2017年jq8035 中国国家自然科学基金 81600830 1。介绍</gydF4y2Batitle> <p>修复软骨缺损的治疗一直是一个巨大的挑战,由于体内软骨再生能力差(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B1"> 1</gydF4y2Baxref>]。移植与自体软骨细胞组成的工程建设是目前流行的方法<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B2"> 2</gydF4y2Baxref>]。然而,自体软骨来源的缺乏和软骨细胞去分化后体外扩张是主要障碍的临床应用chondrocyte-based软骨组织工程(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B3"> 3</gydF4y2Baxref>]。此外,植入的圣餐台具有特定形状或自体软骨移植可能导致继发性畸形或导致并发症包括免疫排斥反应,感染,和挤压<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B4"> 4</gydF4y2Baxref>]。</gydF4y2Bap> <p>间充质干细胞(msc)被发现在许多组织在整个身体,能够自我更新(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B5"> 5</gydF4y2Baxref>和chondrogenic分化<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6</gydF4y2Baxref>]。此外,msc可以很容易地在体外培养和扩大,这使得它们特别有吸引力的细胞来源软骨修复(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B7"> 7</gydF4y2Baxref>]。先前的研究表明,骨髓间充质干细胞(bmsc)更容易获得比滑膜间充质干细胞(SDSC)和有一个高增殖率以及高cartilage-specific基因的表达和蛋白质比脂肪间充质干细胞(ADSCs) [<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B8"> 8</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9</gydF4y2Baxref>),所以在软骨再生(bmsc都进行了广泛的调查<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10</gydF4y2Baxref>]。然而,bmsc时很容易分化为骨细胞等生长因子诱导转化生长因子-<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>1 (TGF -<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>1),骨形成protein-2 (BMP-2)或纤维母细胞生长因子2 (FGF-2) [<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B11"> 11</gydF4y2Baxref>- - - - - -<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B13"> 13</gydF4y2Baxref>]。最终的结果,工程软骨组织血管浸润和僵化的体内<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B14"> 14</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B15"> 15</gydF4y2Baxref>]。</gydF4y2Bap> <p>Coculture bmsc与软骨细胞是一种很有前途的方法由于软骨细胞可以促进bmsc的分化成chondrogenic血统(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B16"> 16</gydF4y2Baxref>]。此外,软骨细胞和细胞外基质(ECM)可以提供一个chondrogenic bmsc环境,同时可以抑制肥大(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B17"> 17</gydF4y2Baxref>]。此外,消费coculture减少软骨细胞的方法。可以修复大缺陷,收获小软骨切片。即使chondrons高比例msc已经成功地修复小型软骨关节软骨缺损等缺陷在chondrogenic网站,长期研究的功效coculture增强承诺msc分化成软骨修复一个大缺陷chondrogenic血统的nonchondrogenic网站仍然是必要的(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B18"> 18</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B19"> 19</gydF4y2Baxref>]。部分原因是复杂的,微妙的,三维(3 d)文化系统所必需的初始软骨形成和维持软骨细胞表型。</gydF4y2Bap> <p>我们使用三维微环境由软骨细胞总量(软骨细胞砖)和PRP软骨形成稳定的bmsc体内(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>]。我们发现这个系统有效地促进了bmsc的软骨形成。解决问题的软骨细胞来源有限,我们希望使用更多的bmsc代替软骨细胞构建工程软骨。然而,骨化发生时偶尔bmsc的比例高于软骨细胞在体内的长期增长。没有研究表明bmsc对女性有利的比例和软骨细胞砖(原发性软骨细胞)体内,这是重要的信息为进一步有效的临床应用组织工程软骨。为了解决这些问题,我们准备三种细胞复合物与不同的BMSC / PRP软骨细胞砖的比率使用先前建立的方法。这里,我们比较了形状保留和工程软骨的质量是由不同的细胞混合比率的bmsc和耳软骨细胞砖体内组织学评估,粘多糖(GAG)和胶原蛋白含量,以及相关的基因表达。在这项研究中,我们调查了影响砖BMSC /软骨细胞的比例及相关分子机制的稳定的感应BMSC chondrogenic血统。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2"> <title>2。材料和方法</gydF4y2Batitle> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。细胞隔离</gydF4y2Batitle> <p>所有动物实验机构批准的动物保健和使用委员会第四军医大学,西安,中国(2015 - kq - 002)。bmsc和软骨细胞分离还是雄性新西兰兔(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mi> n</米毫升:mi> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 3</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>动物中心的,购买第四军医大学,西安,中国)如前所述<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>]。短暂,身体中断后,骨髓被从胫骨和股骨的碎片40毫升杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;HyClone,洛根的城市,美国犹他州)和在1500转离心5分钟。上层清液被免职,细胞被洗两次磷酸盐(PBS)然后resuspended DMEM低葡萄糖补充10%胎牛血清(HyClone), 50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>青霉素g / ml, 30岁<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml链霉素(Amresco,克利夫兰,俄亥俄州,美国)。主要的细胞被播种在75厘米<gydF4y2Basup>2</gydF4y2Basup>在培养瓶<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mn> 5</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>有核细胞/厘米<gydF4y2Basup>2</gydF4y2Basup>与10%胎牛血清的DMEM低葡萄糖补充(HyClone)、谷酰胺(272<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml;Amresco), ascorbate-2-phosphate (50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml;σ,圣路易斯,密苏里州,美国),50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>青霉素g / ml, 30岁<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml链霉素(Amresco)(介质I)和孵化37°C和5%的二氧化碳。3天后,不依从细胞被移除在第一次中改变。剩余的贴壁细胞进一步培养介质改变每3天。附着细胞被孵化,直到细胞克隆达到超过80%汇合,然后与0.25%胰蛋白酶消化(HyClone)和亚文化<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mn> 1。0</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/厘米<gydF4y2Basup>2</gydF4y2Basup>。通道1细胞(补充图。<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1</gydF4y2Baxref>)被用于进一步的实验细胞计数和测试后,贝克曼Vi-Cell XR细胞计数器(贝克曼库尔特,美国)。</gydF4y2Bap> <p>软骨细胞砖是由分散的软骨细胞膜,在膜形成增强介质(DMEM高葡萄糖补充20%胎牛血清(美国犹他州HyClone,洛根城市)、谷酰胺(272<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml;Amresco,克利夫兰,俄亥俄州,美国),ascorbate-2-phosphate (50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml;σ,圣路易斯,密苏里州,美国),50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>青霉素g / ml, 30岁<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml链霉素(美国Amresco,克利夫兰,俄亥俄州))(中等II)由一个自制的切割系统根据先前建立的方法(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>]。短暂,收获耳软骨细胞数和测试使用贝克曼Vi-Cell XR细胞计数器(贝克曼库尔特,美国),培养<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 5.21</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/厘米<gydF4y2Basup>2</gydF4y2Basup>在中二世(补充图six-well板块。<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1 b</gydF4y2Baxref>)。在第十天,当软骨细胞形成的白色固体膜,膜分散在一个自制的切割系统为了实现软骨细胞砖(补充图。<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1汉英</gydF4y2Baxref>)。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。制备结构和动物实验</gydF4y2Batitle> <p>富含血小板血浆(PRP)富集于男兔全血(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mi> n</米毫升:mi> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 3</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>、新西兰白兔2.5到3.0公斤,从动物中心购买第四军医大学,西安,中国)通过一个两步离心过程,所述其他地方(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>]。短暂,18毫升全血从每只兔子的心室成两个无菌管,每个包含1毫升柠檬酸钠溶液(3.8%)作为抗凝剂。在1800 rpm管被旋转离心机在室温下8分钟,和血液分为三个阶段:platelet-poor等离子体(上),PRP(中间),红细胞(下)(补充图。<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1 f</gydF4y2Baxref>)。顶部和中间层被转移到新管和离心机在3600 rpm 8分钟。浮在表面的等离子体被丢弃,剩下的2毫升血浆含有沉淀血小板和指定的PRP混合均匀。最后的血小板浓度调整<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mn> 20.9</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 1。1</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mtext> 毫升</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>。PRP保存在冰的进一步措施。</gydF4y2Bap> <p>老鼠的护理和手术过程按照制度执行委员会指南第四军医大学。十八5-week-old男性裸体小鼠被随机分为三组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mi> n</米毫升:mi> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 6</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>在每组,22到26克重量,从动物中心购买第四军医大学,西安,中国):B1CB2集团(bmsc /软骨细胞砖”比1:2,bmsc,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:mn> 1</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>;主要的软骨细胞,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mn> 2</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>),B1CB1集团(bmsc /软骨细胞砖的bmsc, 1: 1的比例<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:mn> 1。5</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>;主要的软骨细胞,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:mn> 1。5</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>),B2CB1集团(bmsc /软骨细胞砖的比2:1,bmsc,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:mn> 2</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>;主要的软骨细胞,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:mn> 1</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>)。小鼠适应了1星期前操作和监控的一般外观,活动,排泄和重量。总的来说,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:mn> 3</米毫升:mn> <mml:mo> ×</米毫升:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</米毫升:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7</米毫升:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞在表示细胞比率在500年被停职<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l通过16 G针PRP和皮下注射到裸鼠的复杂混合后50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l形成血栓的代理(100 U /毫升100毫克/毫升氯化钙;Villalba,马德里,西班牙生物医学)(补充图。<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1 h,我</gydF4y2Baxref>)。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。生产总值(gdp)形态</gydF4y2Batitle> <p>样本在14周接受周围组织的解剖测量湿重量,厚度,和卷,如前所述<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>]。简单地说,样品卷被水位移测量方法。标本被缝合固定,然后轻轻地扔进一个装满水的测量;的方差标本浸泡前后水量计算体积和转化为示例。在测量之前,轮廓变形的标本进行了评估。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>2.4。生物力学和生物化学分析</gydF4y2Batitle> <p>工程和正常软骨的力学性能进行了分析在生物力学试验机(instron - 5542,广州,MA),根据这些描述Zhang et al。<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B21"> 21</gydF4y2Baxref>]。简而言之,一个常数压缩应变率0.5毫米/分钟应用直到80%的最大变形和应力应变曲线生成实现。杨氏模量的测试组织计算基于应力应变曲线的斜率。工程软骨的杨氏模量比正常的软骨。结果显示,杨氏模量比。</gydF4y2Bap> <p>机械测试后,样品被收集和切碎的DNA,插科打诨,胶原蛋白量化。胶原蛋白和粘多糖的过程(GAG)量化是前面描述的<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>]。短暂,部分样品碎成1毫米<gydF4y2Basup>3</gydF4y2Basup>件与胃蛋白酶消化(1毫克/毫升0.5乙酸;MP,圣安娜,美国加州)和木瓜蛋白酶提取试剂(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)对胶原蛋白和恶作剧的内容。然后,测量胶原蛋白和呕吐在上层清液浓度进行与Sircol™胶原蛋白试验(S1000;Biocolor, Carrickfergus,英国)和Blyscan™GAG化验设备(B1000, Biocolor, Carrickfergus,英国),其次是计算每湿重的胶原蛋白和呕吐的构建胶原蛋白和插科打诨标准曲线,根据设备指令。DNA含量是决定使用Quant-iT dsDNA试验装备和量子位荧光计系统(英杰公司)根据制造商的指示。最终结果显示,胶原蛋白和呕吐/ DNA的内容。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。组织学和免疫组织化学分析</gydF4y2Batitle> <p>样本切成6<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米部分后固定在多聚甲醛和嵌入在石蜡。苏木精和伊红()),safranin-O,马森的三色的,冯Kossa染色按照标准程序进行。两步间接免疫组织化学染色法进行调查I型的表达,II型和X型胶原在矩阵使用主anti-collagen I型抗体(鼠标anti-rabbit, 1: 50;Abcam、剑桥、马、美国),anti-collagen II型抗体(鼠标anti-rabbit, 1: 50;阿克利,Herford,德国),anti-collagen类型X抗体(鼠标anti-rabbit, 1: 50;Abcam,剑桥,妈,美国),紧随其后的是一个辣根peroxidase-conjugated anti-mouse抗体(PBS 1: 200;圣克鲁斯,达拉斯,德克萨斯,美国)和显色diaminobenzidine tetrahydrochloride(美国德克萨斯州圣克鲁斯)。与苏木精复染色的部分解决方案(Mayer)。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。RNA隔离和实时rt - pcr</gydF4y2Batitle> <p>总RNA提取不同群体和兔耳软骨RNAiso +(豆类、志贺、日本),其次是一步苯酚chloroformisoamyl酒精提取,所述的制造商的协议。七genes-Sox9实时rt - pcr分析,胶原蛋白——(COL)我(Col1a1) COL-II (Col2a1) COL-X (Col10a1) Nkx3.2 RUNX2, Gapdh-was执行使用一步SYBR®PrimeScript™rt - pcr试剂盒(豆类、志贺、日本)。五次实时rt - pcr的结果复制,并作为目标归一化首先Gapdh基因表达相同的样品(<gydF4y2Baitalic> Δ</gydF4y2Baitalic>Ct),然后目标基因的表达以兔耳软骨作为本地控制(<gydF4y2Baitalic> ΔΔ</gydF4y2Baitalic>Ct)。2<gydF4y2Basup>- - - - - -<gydF4y2Baitalic> ΔΔ</gydF4y2Baitalic>Ct</gydF4y2Basup>方法是用来比较三组中基因表达的差异。兔子引物序列设计的豆类和用于这项研究展示在表<gydF4y2Baxref rid="tab1" ref-type="table"> 1</gydF4y2Baxref>。</gydF4y2Bap> <table-wrap id="tab1"> <label>表1</lgydF4y2Baabel> <p>真的time-PCR基因引物序列。</gydF4y2Bap> <table> <thead> <tr> <th align="left">基因</gydF4y2Bath> <th align="center">引物</gydF4y2Bath> </tr> </thead> <tbody> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Col1a1</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Col2a1</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GACCCCATGCAGTACATG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GACGGTCTTGCCCCACTT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Col10a1</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GGGATGCCTCTTGTCAGTGC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M25"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ATCTTGGGTCATAGTGCTGCTG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M26"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Sox9</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M27"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-AATCTCCTGGACCCCTTCAT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M28"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M29"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GTCCTCCTCGCTCTCCTTCT-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M30"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Runx2</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M31"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GACTGTGGTTACCGTCATGG-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M32"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M33"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ACTTGGTTTTTCATAACAGC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M34"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Nkx3.2</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M35"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-GATGCGGGCCGCCAAGGACC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M36"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M37"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-AGGAGGCGGGAGCCCGACAC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M38"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="left" rowspan="2"> <italic> Gapdh</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">前5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M39"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M40"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> <tr> <td align="center">反向5<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M41"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>-ATGCCAGTGACGTTCCCGTTCAGC-3<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M42"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ′</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></td> </tr> </tbody> </table> </table-wrap> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。免疫印迹分析</gydF4y2Batitle> <p>收获的新鲜样本在液态氮与哺乳动物细胞溶解蛋白质提取试剂(美国皮尔斯,罗克福德,IL)补充完整的蛋白酶抑制剂。皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯)是用来确定总蛋白质含量,调整到10<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>克/<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>(10 l。样品<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l)被加载到10 - 14% SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(密理博公司,贝德福德,妈,美国)。使用5%的脱脂牛奶膜被封锁Tris-buffered 0.05%生理盐水/渐变20 (TBST) 1小时。然后,孕育了膜在一夜之间4°C以下主要抗体:anti-Sox9 (Abcam、剑桥、马、美国、1:500)和反<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>肌动蛋白(细胞信号,丹弗斯,妈,1:1000)。进一步洗后,化学发光的污点是处理ECL免疫印迹基质(皮尔斯)。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。数据分析</gydF4y2Batitle> <p>所有的结果都表示为<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M43"> <mml:mtext> 的意思是</米毫升:mtext> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mtext> 标准</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>偏差。使用SPSS 17.0统计分析软件SPSS,芝加哥,美国)。数据符合正态分布的前提下,单向方差分析被用于多集团比较,其次是图基的诚实的显著差异测试;<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M44"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.05</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>被认为是显示统计学意义。</gydF4y2Bap> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3所示。结果</gydF4y2Batitle> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。bmsc /软骨细胞的影响砖的比率新生软骨的变形和收缩</gydF4y2Batitle> <p>在最近的研究中,软骨细胞砖和PRP被用来提供一个chondrogenic利基cotransplantation bmsc的皮下软骨形成的空间。如图<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>,所有的标本1:2 bmsc /软骨细胞砖”集团(B1CB2), 1: 1 bmsc /软骨细胞砖”集团(B1CB1),和2:1 bmsc /软骨细胞砖”集团(B2CB1)形成均匀cartilage-like组织呈白色,珍珠,乳白色的外表后14周的皮下植入(数字<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>(一)-<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>(c))。B2CB1组的轮廓B1CB1集团的并不是那么顺利。当我们观察横截面上的样品,我们发现坏死发生在中央B1CB2组(图的一部分<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>(d))。定量评估bmsc /软骨细胞的影响砖的比率的收缩变形和新生的软骨,我们测量了卷,厚度,以及湿法再生组织的重量在术后14周。尽管B1CB1的卷(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M45"> <mml:mn> 355.0</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 12.9</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> l</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)和B1CB2组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M46"> <mml:mn> 336.0</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 28.6</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> l</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)几乎是相同的,他们明显高于B2CB1集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M47"> <mml:mn> 268.0</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 21.1</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> l</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M48"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>(h))。如图<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>(g)显示,平均湿重的B1CB1集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M49"> <mml:mn> 351.8</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 27.1</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫克</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)明显高于B1CB2集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M50"> <mml:mn> 195.2</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 7.2</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫克</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M51"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)和B2CB1集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M52"> <mml:mn> 316.51</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 21.62</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫克</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M53"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.05</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。因此,B1CB1组的厚度测量<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M54"> <mml:mn> 3所示。8</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.2</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫米</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)明显高于B2CB1集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M55"> <mml:mn> 2。9</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.2</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫米</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M56"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)和B1CB2集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M57"> <mml:mn> 1。6</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.1</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫米</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M58"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1</gydF4y2Baxref>(我))。上述结果表明,bmsc /软骨细胞砖1:1的比例是最优维护新生软骨的形态。</gydF4y2Bap> <fig id="fig1"> <label>图1</lgydF4y2Baabel> <p>bmsc /软骨细胞的影响砖的比率新生软骨的变形和收缩。密切的宏观视图从B1CB2再生软骨,B1CB1和B2CB1组14周后在体内孵化。样品是从小鼠在不同群体提出不同的卷,重量和厚度。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M59"> <mml:mi> N</米毫升:mi> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 6</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M60"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M61"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.05</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>。</gydF4y2Bap> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.001"></graphic> </fig> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。平衡bmsc /软骨细胞砖提高异位bmsc体内软骨形成</gydF4y2Batitle> <p>检查软骨再生组织的特点,组织学检查safranin-O染色和II型胶原免疫染色进行进一步揭示重建结果和工程组织的不同的组织学结构。14周后体内,样品在B1CB1和B2CB1组织了新生整个移植软骨组织的形成,是与中央坏死B1CB2组。可以观察到的细胞生存和组织发展的内部B1CB1和B2CB1组。B1CB2集团地区的圆形细胞缺损ECM包围,这是典型的软骨形态,是分散在形成组织。更深的safranin-O染色和COL-II疣状B1CB1组前面的冷凝区域内显示更好的软骨形成的bmsc比其他两组(图<gydF4y2Baxref ref-type="fig" rid="fig2"> 2</gydF4y2Baxref>(c)和(d), (h)和(我),(m)和(n))。此外,合并软骨地区和软骨的出现壳B1CB1组(图中被发现<gydF4y2Baxref ref-type="fig" rid="fig2"> 2</gydF4y2Baxref>(f))。虽然软骨炮弹B2CB1组中也可以观察到,骨化出现尤其是外地区的样本(图<gydF4y2Baxref ref-type="fig" rid="fig2"> 2</gydF4y2Baxref>(k))。B1CB2组样本周围的软骨层明显,中部坏死(图<gydF4y2Baxref ref-type="fig" rid="fig2"> 2</gydF4y2Baxref>(a))。</gydF4y2Bap> <fig id="fig2"> <label>图2</lgydF4y2Baabel> <p>bmsc /软骨细胞的平衡砖提高综合体内的异位软骨形成。检查移植体内在14周的软骨形成。合并图像表明,B1CB1和B2CB1组表现出细胞生存和组织形成整个移植(f, k),而B1CB2组中央坏死(a)展出。所有三组提出chondrogenic bmsc的分化,经苏木精和伊红()),safranin-O染色,和COL-II疣状(b - d、g - l - n),而骨发生在样品B2CB1组(l - n)。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M62"> <mml:mtext> 规模</米毫升:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 酒吧</米毫升:mtext> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 2</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 毫米</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,放大×40 (f, k);<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M63"> <mml:mtext> 规模</米毫升:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 酒吧</米毫升:mtext> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 50</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> 毫克ydF4y2Ba</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>,放大×200 (b - e, g - j, l - o)。</gydF4y2Bap> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.002"></graphic> </fig> <p>进一步研究bmsc /软骨细胞的影响砖的比率在软骨形成,量化样本三组内的胶原蛋白和呕吐。如图<gydF4y2Baxref rid="fig3" ref-type="fig"> 3</gydF4y2Baxref>所示,插科打诨每B1CB1的DNA含量(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M64"> <mml:mn> 5.93</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.71</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)和B1CB2 (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M65"> <mml:mn> 5.81</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.61</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)组显著高于B2CB1组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M66"> <mml:mn> 4.16</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.56</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M67"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。因此,胶原蛋白含量每的DNA B2CB1集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M68"> <mml:mn> 0.41</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.052</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>)明显低于B1CB1 (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M69"> <mml:mn> 0.56</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.032</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M70"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)组和B1CB2组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M71"> <mml:mn> 0.57</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.043</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M72"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。更重要的是,呕吐和胶原蛋白含量每DNA B2CB1显著低于正常软骨(呕吐吗<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M73"> <mml:mn> 6.13</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.42</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M74"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>;胶原蛋白<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M75"> <mml:mn> 0.61</米毫升:mn> <mml:mo> ±</米毫升:mo> <mml:mn> 0.046</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> <mml:mo> /</米毫升:mo> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> g</米毫升:mtext> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M76"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(数据<gydF4y2Baxref rid="fig3a" ref-type="fig"> 3(一个)</gydF4y2Baxref>和<gydF4y2Baxref rid="fig3b" ref-type="fig"> 3 (b)</gydF4y2Baxref>)。这些结果表明,促进软骨形成B2CB1组并不是那么有效,其他两组。为了测试工程软骨的力学性能对未来临床治疗,我们比较年轻的模三组正常耳软骨皮下14周后孵化。B1CB1集团的杨氏模量达到大约92.6%的正常耳软骨。中央坏死的原因,杨氏模量B1CB2组只有达到61.7%的正常耳软骨,这明显低于B1CB1集团(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M77"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。然而,B2CB1集团的杨氏模量(近156.1%的正常耳软骨)明显高于B1CB1和B1CB2组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M78"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)因为骨化(图<gydF4y2Baxref rid="fig3c" ref-type="fig"> 3 (c)</gydF4y2Baxref>)。这些结果表明B1CB1组的临床优势。</gydF4y2Bap> <fig-group id="fig3"> <label>图3</lgydF4y2Baabel> <p>生化和生物力学特征。(a, b)定量分析的DNA在14周术后呕吐和胶原蛋白。(c)相比,杨氏模量比耳软骨。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M79"> <mml:mi> N</米毫升:mi> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 5</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M80"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>。</gydF4y2Bap> <fig id="fig3a"> <label>(一)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.003a"></graphic> </fig> <fig id="fig3b"> <label>(b)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.003b"></graphic> </fig> <fig id="fig3c"> <label>(c)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.003c"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。更高比例的软骨细胞砖防止bmsc的骨化皮下Nonchondrogenic网站</gydF4y2Batitle> <p>马森的三色的染色,冯Kossa染色,类型和X胶原蛋白免疫染色的影响进行了分析bmsc /软骨细胞砖头对预防营养不良的比率和骨化的bmsc皮下nonchondrogenic网站。冯Kossa染色显示,钙,显示为黑色的水晶,是沉积样品外,肥厚性转变发生在B2CB1组(图<gydF4y2Baxref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</gydF4y2Baxref>(左))。马森的三色的染色样品展示了成熟的胶原蛋白的生产B2CB1集团证实了一个成熟骨(图的形成<gydF4y2Baxref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</gydF4y2Baxref>(k))。相比之下,没有钙沉积或软骨胶原蛋白生产B1CB1和B1CB2团体所示,因此呈现chondrogenic性能(图<gydF4y2Baxref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</gydF4y2Baxref>(a)和(b)和(f)和(g))。进一步确定植入的肥厚性过渡和骨化伴在不同的组,对I型和X型胶原免疫染色。根据组织学检查,新成立的ECM提出更深层次的对I型胶原染色和X型胶原蛋白。高表达上述蛋白质表明bmsc暴露于宿主的身体B2CB1组经历了肥厚性过渡和骨化(图<gydF4y2Baxref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</gydF4y2Baxref>(m)和(n))。相比之下,微弱的染色的胶原蛋白在B1CB1和B1CB2团体表示,伴着这两个组维护的低级I型和X型胶原染色和在皮下nonchondrogenic免受骨化网站通过14周(图<gydF4y2Baxref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</gydF4y2Baxref>(c)和(d)和(h)和(我))。</gydF4y2Bap> <fig id="fig4"> <label>图4</lgydF4y2Baabel> <p>更高比例的软骨细胞砖防止骨化的bmsc皮下nonchondrogenic网站。检查骨移植体内在14周。相比B2CB1组(k - n), B1CB1和B1CB2组没有出现骨化的bmsc 14周(a - d, f - i),经Von-Kossa,马森的三色的,COL-I, COL-X疣状。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M81"> <mml:mtext> 规模</米毫升:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 酒吧</米毫升:mtext> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 50</米毫升:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ</米毫升:mi> <mml:mtext> 毫克ydF4y2Ba</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>,放大×100。</gydF4y2Bap> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.004"></graphic> </fig> </sec> <sec id="sec3.4"> <title>3.4。高表达Sox9的MSC利基由软骨细胞砖和PRP指南稳定的bmsc软骨形成</gydF4y2Batitle> <p>我们监控的转录水平Col-I, Col-II, Col-X在细胞内三组和本机软骨(数字<gydF4y2Baxref rid="fig5b" ref-type="fig"> 5 (b)</gydF4y2Baxref>和<gydF4y2Baxref rid="fig5d" ref-type="fig"> 5 (d)</gydF4y2Baxref>)。如图<gydF4y2Baxref rid="fig5b" ref-type="fig"> 5 (b)</gydF4y2Baxref>,B1CB1 Col-II基因的表达水平和B1CB2组显著高于B2CB1组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M82"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。相比之下,肥厚性标记Col-X表达明显高于B2CB1组通过14周(图<gydF4y2Baxref rid="fig5c" ref-type="fig"> 5 (c)</gydF4y2Baxref>)(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M83"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。因此,遗传标记的ossification-Col-I表达B2CB1组也高于其他两组(图<gydF4y2Baxref rid="fig5d" ref-type="fig"> 5 (d)</gydF4y2Baxref>)(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M84"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)。这些结果证实了组织学观察和建议砖软骨细胞微环境中发挥了重要作用,软骨细胞比例高砖促进软骨形成,防止bmsc的骨化。</gydF4y2Bap> <fig-group id="fig5"> <label>图5</lgydF4y2Baabel> <p>高表达Sox9的MSC利基由软骨细胞砖和PRP指南稳定的bmsc软骨形成。实时rt - pcr的样本在第14周(a - f)透露Col-I不符的表情,Col-II, Col-X, RUNX2, Nkx3.2, Sox9在不同的团体,都归一化兔耳软骨。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M85"> <mml:mi> N</米毫升:mi> <mml:mo> =</米毫升:mo> <mml:mn> 5</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M86"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</米毫升:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>。(e)免疫印迹Sox9。</gydF4y2Bap> <fig id="fig5a"> <label>(一)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005a"></graphic> </fig> <fig id="fig5b"> <label>(b)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005b"></graphic> </fig> <fig id="fig5c"> <label>(c)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005c"></graphic> </fig> <fig id="fig5d"> <label>(d)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005d"></graphic> </fig> <fig id="fig5e"> <label>(e)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005e"></graphic> </fig> <fig id="fig5f"> <label>(f)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005f"></graphic> </fig> <fig id="fig5g"> <label>(g)</lgydF4y2Baabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.fig.005g"></graphic> </fig> </fig-group> <p>此外,我们监控Sox9的表达水平。实时rt - pcr表明,转录水平的Sox9 B1CB1和B1CB2组高于B2CB1 (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M87"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<gydF4y2Baxref rid="fig5a" ref-type="fig"> 5(一个)</gydF4y2Baxref>)。COL-II chondrogenic基因的表达水平明显高于B1CB1和B1CB2组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M88"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<gydF4y2Baxref rid="fig5b" ref-type="fig"> 5 (b)</gydF4y2Baxref>),而肥厚性和成骨的基因RUNX2的水平和其下游基因COL-X COL-I B2CB1组明显高于其他两组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M89"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(数据<gydF4y2Baxref rid="fig5c" ref-type="fig"> 5 (c)</gydF4y2Baxref>-<gydF4y2Baxref rid="fig5e" ref-type="fig"> 5 (e)</gydF4y2Baxref>)。更重要的是,表达水平的Nkx3.2充当RUNX2的阻遏B2CB1组显著低于B1CB2和B1CB2组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M90"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<gydF4y2Baxref rid="fig5f" ref-type="fig"> 5 (f)</gydF4y2Baxref>)。免疫印迹结果还证实,Sox9 B2CB1组的表达水平显著低于其他两组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M91"> <mml:mi> P</米毫升:mi> <mml:mo> <</米毫升:mo> <mml:mn> 0.01</米毫升:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<gydF4y2Baxref rid="fig5g" ref-type="fig"> 5 (g)</gydF4y2Baxref>)。</gydF4y2Bap> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4所示。讨论</gydF4y2Batitle> <p>工程软骨具有特定形状的一个挑战是实现足够适合播种体内的细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B16"> 16</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B21"> 21</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B22"> 22</gydF4y2Baxref>]。尽管数量有限的孤立的软骨细胞可以充分放大,播种软骨细胞去分化,导致受损neocartilage的生物和机械稳定性<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B23"> 23</gydF4y2Baxref>]。最近,coculture bmsc与软骨细胞已被广泛研究在软骨组织工程<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B21"> 21</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B24"> 24</gydF4y2Baxref>]。除了减少消费软骨软骨细胞的建筑,它已经表明,软骨组织可以产生bmsc cocultured与软骨细胞体外或体内<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B25"> 25</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B26"> 26</gydF4y2Baxref>]。进一步研究表明,软骨细胞总量(软骨细胞砖)均匀地分布在PRP能提供在nonchondrogenic chondrogenic利基网站(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</gydF4y2Baxref>],它证实了增殖和chondrogenic分化能力和稳定性的bmsc与软骨细胞砖被coculture增强。还应该指出,bmsc chondrogenic引发的更均匀微环境由软骨细胞提供砖coculture系统比增长factor-mediated chondrogenic感应(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B27"> 27</gydF4y2Baxref>]。更重要的是,费舍尔et al。<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</gydF4y2Baxref>)发现甲状旁腺与荷尔蒙相关的蛋白质分泌软骨细胞可以抑制肥大引起的bmsc coculture微环境。</gydF4y2Bap> <p>然而,骨化发生时偶尔bmsc的比例高于软骨细胞砖经过长期增长在免疫动物比如兔子nonchondrogenic网站像鼻增强体内。没有系统的比较研究,以确定有效的bmsc /软骨细胞砖的比率为高效建设工程软骨体内。为了避免来自外部因素的干扰,我们调查了三个兔子BMSC的混合比率和软骨细胞的影响砖(BMSC /原始软骨细胞计数1:2、1:1和2:1)chondrogenic和成骨分化PRP构造和比较保留形状和质量工程软骨的裸小鼠。形状测定表明,1:1的比例bmsc /软骨细胞砖更有影响工程软骨形态的稳定性。工程软骨的质量评估,评估每个DNA在细胞外基质胶原蛋白和呕吐以及杨氏模量比与正常耳软骨相比。这项研究的结果表明,更高比例的软骨细胞砖可以显著增加呕吐和每DNA工程软骨的胶原蛋白含量,从而改善BMSC软骨形成和组织工程软骨的形成。特别是,足够的ECM在软骨细胞砖提供足够的固有电阻周围的压力,使形态维护在皮下的环境中。然而,高比率的软骨细胞砖导致新生软骨坏死的核心部分将不可避免地影响其机械强度和临床应用。同样,骨化发生B2CB1组对未来临床治疗也有不利影响。当我们增加的比率bmsc的复杂,过于高比率的bmsc可能导致骨化外结构,这将减少构建软骨的弹性。 In this study, we proved that the balance of BMSCs and chondrocyte bricks was important for stable morphology and chondrogenesis as well as prevention of ossification, which provided tissue-engineered cartilage with excellent mechanical property for future clinical treatment.</p> <p>先前的研究表明,chondrogenically诱导msc在体外被植入后容易钙化和血管侵犯皮下注射(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B28"> 28</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B29"> 29日</gydF4y2Baxref>]。因此,msc软骨形成的主要挑战皮下环境不是软骨形成的失败但未能维持软骨表型。在这项研究中一个重要的发现是,更高的bmsc /软骨细胞砖的比例将减少保护的效率从骨化伴皮下nonchondrogenic网站。体内结果表明,软骨内骨化从bmsc邻近周围宿主组织。我们怀疑bmsc /软骨细胞砖的比率更高导致暴露引起的bmsc皮下nonchondrogenic站点周边PRP的快速退化。这个开口微环境未能保持软骨细胞分泌chondrogenic因子释放以及ECM和保护bmsc由成骨的干扰因素,导致进步的bmsc的骨化。因为裸小鼠寿命的限制,在进一步的研究中,我们将使用一只兔子耳和关节缺损模型来测试我们的结果。</gydF4y2Bap> <p>的影响coculture软骨和骨的表现型的PRP构造体内是多种因素的结果,包括生长因子(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.</gydF4y2Baxref>]。交互的可溶性因子msc和软骨细胞以及PRP扮演重要角色在多个步骤chondrogenic和成骨分化<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B31"> 31日</gydF4y2Baxref>]。骨髓间充质分化的决定取决于两个主要转录因子:Sox9软骨形成和RUNX2骨(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B32"> 32</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B33"> 33</gydF4y2Baxref>]。Sox9方面发挥了主导作用chondrogenic分化通过积极调节MSC分化和压制RUNX2 Nkx3.2直接(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B34"> 34</gydF4y2Baxref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B35"> 35</gydF4y2Baxref>]。RUNX2表情刺激成骨细胞谱系分化,导致软骨细胞通过调节发展成熟为肥厚性软骨细胞(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B36"> 36</gydF4y2Baxref>]。在我们的研究中,我们发现Sox9的表达水平,RUNX2, Nkx3.2, COL-I, COL-II, COL-X随bmsc /软骨细胞砖的比率的变化。Sox9的表达水平显著增加,软骨细胞砖高的比率。此外,软骨形成标记基因的表达水平COL-II更高比例的软骨细胞中调节砖组(B1CB1和B1CB2)。相反,肥大和ossification-related基因RUNX2显著增加比例高的BMSC集团和其下游基因COL-X COL-I B2CB1group表达调节。同时,上游基因的表达水平在B1CB1 Nkx3.2 B1CB2组显著调节。与成骨的组织学结果相关的预防,Sox9的表达水平增加,软骨细胞的增加砖比,表明Sox9-Nkx3.2-RUNX2通路发挥了重要作用的利基bmsc由软骨细胞砖和PRP的软骨形成。关于细胞物种的限制,研究Sox9的交互与其他生长因子在人类细胞仍在进行中。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec5"> <title>5。结论</gydF4y2Batitle> <p>研究表明,BMSC的平衡和软骨细胞砖中扮演主要角色在维持稳定的软骨形成和抑制成骨BMSC的PRP构造在裸小鼠皮下注射后,1:1 BMSC /软骨细胞砖的比例应该是一个相对适合体内软骨再生的比例。此外,与资产相关的增加表达Sox9 bmsc /软骨细胞的砖是维持一个相关因素chondrogenic血统的bmsc 3 d软骨形成微环境构建。</gydF4y2Bap> </sec> <back> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性</gydF4y2Batitle> <p>使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。</gydF4y2Bap> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>的利益冲突</gydF4y2Batitle> <p>作者宣称没有利益冲突。</gydF4y2Bap> </sec> <sec> <title>作者的贡献</gydF4y2Batitle> <p>R.B. Y.Z.的构思和设计研究,R.B. y . d和S.L.设计并进行实验。L.K.和G.W.分析数据和模型。R.B.和文学士写道。S.L.文学士和Y.Z.修订。</gydF4y2Bap> </sec> <ack> <title>确认</gydF4y2Batitle> <p>我们感谢吴魏无价的技术专长。这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81600830)和山'xi省自然科学基金(批准号2017 jq8035)。</gydF4y2Bap> </ack> <sec sec-type="supplementary-material" id="supplementary-material-1"> <title>补充材料</gydF4y2Batitle> <supplementary-material xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/5492059.f1.pdf" id="supp-1" mimetype="application/pdf"> <label>补充材料</lgydF4y2Baabel> <p>补充图1:制备结构和动物实验:(一)伴。(B)软骨细胞。(汉英)过程实现软骨细胞的砖。(F) PRP的形成过程。之前与PRP (G)构造复杂的细胞移植。(设定h)皮下注射。</gydF4y2Bap> </supplementary-material> </sec> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1</lgydF4y2Baabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 比安科</gydF4y2Basurname> <given-names> P。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 曹</gydF4y2Basurname> <given-names> X。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Frenette</gydF4y2Basurname> <given-names> p S。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 毛</gydF4y2Basurname> <given-names> J·J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 罗比</gydF4y2Basurname> <given-names> p·G。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 席梦思床品公司</gydF4y2Basurname> <given-names> p . J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 王</gydF4y2Basurname> <given-names> c . Y。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 意义,意义和意义:翻译间充质干细胞在医学的科学</gydF4y2Baarticle-title> <source> <italic> 自然医学</gydF4y2Baitalic> <year> 2013年</gydF4y2Bayear> <volume> 19</gydF4y2Bavolume> <issue> 1</gydF4y2Baissue> <fpage> 35</gydF4y2Bafpage> <lpage> 42</lgydF4y2Bapage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1038 / nm.3028</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84872088799</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 23296015</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2</lgydF4y2Baabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 穆米</gydF4y2Basurname> <given-names> M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 巴贝罗</gydF4y2Basurname> <given-names> 一个。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 也</gydF4y2Basurname> <given-names> 年代。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Wixmerten</gydF4y2Basurname> <given-names> 一个。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 菲</gydF4y2Basurname> <given-names> 年代。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 狼</gydF4y2Basurname> <given-names> F。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Asnaghi</gydF4y2Basurname> <given-names> a . M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Baumhoer</gydF4y2Basurname> <given-names> D。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Bieri</gydF4y2Basurname> <given-names> O。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Kretzschmar</gydF4y2Basurname> <given-names> M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Pagenstert</gydF4y2Basurname> <given-names> G。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Haug</gydF4y2Basurname> <given-names> M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Schaefer</gydF4y2Basurname> <given-names> d . J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 马丁</gydF4y2Basurname> <given-names> 我。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 雅克布</gydF4y2Basurname> <given-names> M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 鼻chondrocyte-based工程自体软骨组织修复关节软骨的缺损:一项观察first-in-human审判</gydF4y2Baarticle-title> <source> <italic> 《柳叶刀》</gydF4y2Baitalic> <year> 2016年</gydF4y2Bayear> <volume> 388年</gydF4y2Bavolume> <issue> 10055年</gydF4y2Baissue> <fpage> 1985年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 1994年</lgydF4y2Bapage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1016 / s0140 31658 - 0 - 6736 (16)</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84992579418</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B3" content-type="article"> <label>3</lgydF4y2Baabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Makris</gydF4y2Basurname> <given-names> 大肠。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Gomoll</gydF4y2Basurname> <given-names> a . H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Malizos</gydF4y2Basurname> <given-names> k . N。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 胡</gydF4y2Basurname> <given-names> j . C。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Athanasiou</gydF4y2Basurname> <given-names> k。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 修复和关节软骨组织工程技术</gydF4y2Baarticle-title> <source> <italic> 自然评论风湿病学</gydF4y2Baitalic> <year> 2015年</gydF4y2Bayear> <volume> 11</gydF4y2Bavolume> <issue> 1</gydF4y2Baissue> <fpage> 21</gydF4y2Bafpage> <lpage> 34</lgydF4y2Bapage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1038 / nrrheum.2014.157</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84926337395</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 25247412</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B4" content-type="article"> <label>4</lgydF4y2Baabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 乔</gydF4y2Basurname> <given-names> c . H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 李</gydF4y2Basurname> <given-names> y G。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 胫骨</gydF4y2Basurname> <given-names> w·H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 金</gydF4y2Basurname> <given-names> H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 柴</gydF4y2Basurname> <given-names> j·W。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 宋</gydF4y2Basurname> <given-names> e . C。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 金</gydF4y2Basurname> <given-names> j·E。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 垫片</gydF4y2Basurname> <given-names> H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 胫骨</gydF4y2Basurname> <given-names> j·S。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 胫骨</gydF4y2Basurname> <given-names> i S。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 类风湿性关节炎</gydF4y2Basurname> <given-names> j . C。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 哦</gydF4y2Basurname> <given-names> 年代。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 尹</gydF4y2Basurname> <given-names> k . S。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 关节内注射间充质干细胞治疗膝骨关节炎:一个概念验证的临床试验</gydF4y2Baarticle-title> <source> <italic> 干细胞</gydF4y2Baitalic> <year> 2014年</gydF4y2Bayear> <volume> 32</gydF4y2Bavolume> <issue> 5</gydF4y2Baissue> <fpage> 1254年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 1266年</lgydF4y2Bapage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1002 / stem.1634</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84898944698</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 24449146</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B5" content-type="article"> <label>5</lgydF4y2Baabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 赵</gydF4y2Basurname> <given-names> H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 冯</gydF4y2Basurname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 何</gydF4y2Basurname> <given-names> t . V。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 格里姆斯</gydF4y2Basurname> <given-names> W。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 浦田</gydF4y2Basurname> <given-names> M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 柴</gydF4y2Basurname> <given-names> Y。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 缝合为间充质干细胞提供了一个利基的颅面骨骼</gydF4y2Baarticle-title> <source> <italic> 自然细胞生物学</gydF4y2Baitalic> <year> 2015年</gydF4y2Bayear> <volume> 17</gydF4y2Bavolume> <issue> 4</gydF4y2Baissue> <fpage> 386年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 396年</lgydF4y2Bapage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1038 / ncb3139</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84925941028</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 25799059</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B6" content-type="article"> <label>6</lgydF4y2Baabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Meretoja</gydF4y2Basurname> <given-names> 诉V。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Dahlin</gydF4y2Basurname> <given-names> r . 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