低剂量地西他滨协助的人脐带间充质干在保护细胞β细胞通过调节2型糖尿病小鼠的巨噬细胞表型

摘要

背景.进步β细胞功能障碍，2型糖尿病的主要特征（T2D），是密切相关的胰岛内炎性巨噬细胞的浸润。间充质干细胞（MSCs）已被确定为缓解β-细胞功能障碍通过调节巨噬细胞表型在T2D，但恢复β-一次MSC输注的细胞是相对短暂的。据报道，Decitabine (DAC)可使巨噬细胞向低剂量的抗炎表型极化。因此，我们研究了低剂量地他滨是否能增强间充质干细胞的抗糖尿病作用，进一步促进间充质干细胞的修复β细胞功能。方法.我们诱发高脂饮食和链脲佐菌素注射T2D小鼠模型。将小鼠分成5组：正常组，T2D组中，DAC组中，MSC组，并且MSC加DAC组（MD组）。我们检查了血糖和小鼠1,2的血清胰岛素水平，和4周的MSC和/或DAC处理后。动态改变胰岛和经由免疫荧光法检测intraislet巨噬细胞的表型。在体外，我们探索了MSC和DAC对巨噬细胞极化的影响。结果.血糖和血清胰岛素水平显示，DAC可使T2D小鼠的MSCs的抗糖尿病作用延长至4周。免疫荧光染色显示，MD组的胰岛较MSC组有更持久的形态学和结构改良。有趣的是，进一步的分析显示，治疗4周后，MD组胰岛中选择性活化的巨噬细胞(M2，抗炎)增多，而经典活化的巨噬细胞(M1，促炎)减少。体外研究表明，DAC和MSCs通过PI3K/AKT通路进一步极化巨噬细胞，使其从M1向M2表型转变。结论.这些数据公布该DAC延长MSCs的降血糖作用，促进可持续发展β-cell恢复，可能通过调节巨噬细胞的表型。我们的研究结果提供T2D一个最好的治疗策略。

1.介绍

逐步下降β细胞质量和功能，2型糖尿病（T2D）的一个主要特征，将不可避免地导致胰岛素缺乏随着病情的发展[1]。现有的治疗方法如胰岛素促泌剂可以暂时增加胰岛素的分泌，但与外源性胰岛素补给品类似，不能逆转进行性改变β细胞功能障碍(2]。此外，尽管二肽基肽IV（DPP-IV）抑制剂和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂增强的可能作用β-细胞功能，这些药物对人类胰岛的影响尚未得到充分证实[3，4]。这凸显了需要寻找新的治疗目标T2D的基本病机。

间充质干细胞（MSCs）是成纤维样的成体干细胞。除了他们的自我再生和多向分化能力，间充质干也具有广泛的免疫调节性能和抗炎作用[五-8]。值得注意的是，小样本的临床试验和实验研究表明，MSC输液可能保存功能β细胞质量和改善高血糖T2D个体[9-15]。班萨利等人。报告说，自体MSC移植降低的胰岛素需求和升高的刺激T2D患者C-肽水平在一项前瞻性，随机，单盲安慰剂对照研究[15]。硅等。[9]发现T2D大鼠表现出改善的MSC输注后的血糖稳态和胰岛质量。

有趣的是，越来越多的研究表明，MSC诱导胰岛修复的潜在机制是密切相关的intraislet巨噬细胞表型的改变。巨噬细胞通常分为两种表型：“经典活化” M1巨噬细胞和“可选择性活化的” M2巨噬细胞，虽然二分法是过于简单化[16]。通常，M1巨噬细胞分泌高水平的促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-1β（IL-β)，并在炎症的发生和发展过程中起着至关重要的作用。Ehses等人发现T2D患者和啮齿动物胰岛内的巨噬细胞比健康对照组多[17]。进一步的调查表明，正常动物的胰岛居民表现出的巨噬细胞的表型M2，而对那些促炎极化T2D模型的胰岛内积累的巨噬细胞，从而导致β细胞功能障碍(18]。相比之下，M2巨噬细胞被认为是在炎症消退，促进组织修复[关键效应细胞19，20]。新出现的证据表明M2巨噬细胞在β-细胞保护、修复和再生[21-23]。肖等人。[24]发现M2巨噬细胞诱导的β-细胞增殖后胰管结扎和消耗巨噬细胞与氯膦酸盐导致下降β细胞复制。值得注意的是，Yin等人[25]发现，在T2D小鼠中，MSC诱导的β-cell恢复是由于巨噬细胞的表型和intraislet炎症的后续分辨率的改变，这表明不像其他antihyperglycemia剂，MSC可以保护β- T2D发病机制关键方面的细胞。

然而，尽管有这些令人鼓舞的结果，单次MSC灌注的疗效持续时间相对较短[9]。例如，Si等人[9]发现单个MSC输注抗糖尿病作用下保持少于4周在T2D大鼠。临床试验也显示出类似的结果[14，26]。Liu等人[14发现通过一次静脉注射和一次胰腺内血管内注射接受间充质干细胞移植的患者的糖化血红蛋白水平在前3个月逐渐下降，但在接下来的9个月逐渐上升。

地西他滨（DAC），一个hypoethylating剂时，在血液疾病的治疗经常被使用。最近，一些研究已经揭示DAC的在促进实体肿瘤的免疫疗法的检查点的效力，表明DAC具有在低剂量的免疫调节性质[27]。此外，越来越多的信息表明，低剂量的DAC能够预防或治疗一些炎症疾病，如急性肺损伤和动脉粥样硬化[28，29]。有趣的是，DAC对这些炎症性疾病的预防或治疗作用也被归因于巨噬细胞表型的调节。曹等人[29发现低剂量DAC通过抑制促炎性巨噬细胞来改善动脉粥样硬化。Thangavel等人[28]表明，DAC的组合治疗和另一后生改性剂曲古菌素A通过调节巨噬细胞的表型抑制内毒素血症诱发的急性肺损伤。定的DAC和MSC的相似免疫调节能力，MSC输注DAC治疗的联合可以增强MSC的抗炎效力，导致改进的抗糖尿病作用。

本研究采用链脲佐菌素(STZ)/高脂饮食诱导T2D小鼠，研究MSCs与DAC联合使用对T2D小鼠的治疗作用。单次静脉输注人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)，并连续5天给予DAC，小鼠葡萄糖稳态较长，恢复时间较长β-细胞质量比单纯给予间充质干细胞输注的大，同时伴有胰岛巨噬细胞表型向M2的极化。在体外，DAC增强了UC-MSCs对巨噬细胞向M2状态极化的作用。综上所述，我们的研究表明联合治疗UC-MSCs和DAC可能是T2D较好的治疗策略。

2。材料和方法

2.1。动物实验

8周龄雄性C57BL/6J小鼠，购于中国人民解放军总医院。小鼠置于标准的饲养条件下(室温恒定为25℃，12 h/12 h明暗循环，自由获取食物和水)。为了诱导T2D模型，小鼠给予高脂肪饮食(西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，S0130) 8周，然后腹腔注射90 mg/kg STZ(西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯)。对照组给予正常鼠粮(NCD)喂养8周。随机血糖水平连续3天高于16.7 mmol/L的小鼠为T2D小鼠。我们还进行了腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTTs)和腹腔内胰岛素耐量试验(IPITTs)来验证T2D模型。对于IPGTT和IPITT，小鼠禁食一夜，注射葡萄糖(1 g/kg)或胰岛素(1 U/kg)，然后在注射后30、60、90和120分钟检测血糖水平。T2D小鼠随机分为4组:(1)DAC组小鼠连续5天腹腔给予0.25 mg/kg DAC。(2) MSC组小鼠灌胃 UC-MSCs经尾静脉悬挂于0.2 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。(3) MSC和DAC联合组小鼠均接受单次MSC灌注和5天DAC给药。(4) T2D组小鼠经尾静脉给予0.2 mL PBS。随机血糖水平和体重每周测量两次。IPGTT和IPITT分别在MSC输注后1、2和4周进行。血清胰岛素浓度检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)，根据制造商的说明。所有实验方案均经中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准。

2.2。细胞培养

在获得书面知情同意的情况下，从中国人民解放军总医院分娩的妇女身上获取人脐带。经中国人民解放军总医院伦理委员会批准。UC-MSCs被分离出来，并按照之前的描述进行了表征[三十，31]。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)隔绝的股骨和胫骨6雄性小鼠培养C57BL / 6 j 1640年RMPI(美国CA Gibco)补充10%胎牛血清(美国CA Gibco)、青霉素链霉素(美国Gibco) 1%, 100 ng / mL - csf(研发系统、MN、美国)37°C公司5%₂.培养5天后，细胞的身份通过抗F4 / 80流式细胞术证实。Peritoneal macrophages were collected from 6-week-old C57BL/6J male mice by peritoneal lavage with 1.5 mL RMPI 1640 and cultured with RMPI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin streptomycin. The morphology of the macrophages was observed with phase-contrast microscopic images. BMDMs or peritoneal macrophages were seeded onto six-well plates, and then 100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich, USA) and 50 ng/mL IFNγ(R&D Systems, MN, USA)诱导巨噬细胞进入M1表型24 h。然后，培养巨噬细胞 Transwell系统中的UC-MSCs在巨噬细胞培养基中添加或不添加DAC。

2.3。免疫荧光染色

小鼠胰腺组织分别于MSC灌注后1、2、4周收集。首先，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠，用PBS经左心室灌注，接着4%多聚甲醛。然后，将胰酶分离，用30%蔗糖/PB脱水过夜，并嵌入最佳切割温度化合物(OCT)中。胰腺切片(6mm)用切片机(Thermo Fisher Scientific)切片，在4°C的湿化室中孵育过夜，使用针对胰岛素的初级抗体(1/200，豚鼠，Sigma-Aldrich)、胰高血糖素(1/ 2000，小鼠，Abcam)、Pdx1(1/200，兔，CST)、CD11c(1/200，小鼠，Abcam)、IL1β（1/100，兔，Abcam公司），F4 / 80（1/200，兔，Sigma-Aldrich公司），和FIZZ1（1/200，兔，Abcam公司）。After the sections were washed with PBS, they were incubated for 2 h with a secondary antibody (1 : 500; Alexa Fluor 488/594-conjugated secondary antibodies, Invitrogen) at room temperature. Nuclei were stained with DAPI (4 ，6-diamidino-2-phenylindole Sigma-Aldrich)。这些图像是用共焦激光扫描显微镜(奥林巴斯，东京，日本)拍摄的。4%多聚甲醛固定腹腔巨噬细胞于玻璃板上。其余步骤按照上面描述的方式执行。

2.4。CCK-8法

BMDMs接种于96孔板上 cells/well and cultured with RMPI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, 1% penicillin streptomycin, and 100 ng/mL M-CSF for 24 h. Next, cells were treated with DAC at different concentrations (0, 1, 5, 10, 25, 50, 100, and 500 nmol/L) for 72 h. Then, the cells were incubated with fresh media containing CCK-8 for 30 min. The optical density was measured at OD450. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Kit was purchased from DOJINDO Molecular Technologies.

2.5。实时定量逆转录聚合酶链式反应

总RNA从使用Trizol试剂（Invitrogen）的BMDM提取，并根据制造商的说明用纳米滴系统（赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，MA）进行定量。然后，将RNA逆转录成cDNA逆转录试剂盒（赛默飞世尔科技，弗里蒙特，CA，HTTP：//www.thermo)。实时逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)采用SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA，http://www.appliedbiosystems.com)。热循环程序为94°C持续3 min，随后为40个循环，95°C持续15 s, 60°C持续15 s, 72°C持续30 s。β-Actin作为参考基因。PCR引物见补充表1.

2.6。西方墨点法

的BMDM用冷PBS洗涤两次，然后用蛋白提取试剂（CWBIO，中国），其同时含有蛋白酶抑制剂（CWBIO，中国）和磷酸酶抑制剂（Roche，瑞士）进行裂解。在裂解物中的蛋白质浓度通过BCA测定（赛默飞世尔科技）来确定。每个组的蛋白的等量上样到SDS-PAGE凝胶上，并随后转移至PVDF膜。Next, membranes were blocked in 10% BSA and incubated with a primary antibody against Arg-1 (1 : 1000, Abcam, USA), iNOS (1 : 1000, Abcam, USA), PI3K (1 : 1000, CST, USA), p-AKT (1 : 1000, CST, USA), AKT (1 : 1000, CST, USA),β-tubulin (1 : 2000, ZSJQ-BIO, China), and GAPDH (1 : 2000, ZSJQ-BIO, China) overnight at 4°C. Then, the membranes were washed with TBST three times and incubated with the corresponding HRP-conjugated secondary antibodies for 1 h at room temperature. The blotting was detected by the ECL detection system (PPLYGEN, China) and analyzed by ImageJ software (NIH, MD).ββ-微管蛋白和GAPDH用作内部对照。

2.7。流式细胞仪分析

收集BMDMs并将其悬浮于PBS中，然后与pe偶联的anti-F4/80抗体(美国eBioscience公司)和同型抗体在室温下孵育15分钟。细胞用PBS洗涤两次，200次重悬μL PBS，流式细胞仪检测。

2.8。统计分析

所有的结果都表示为 至少3个独立实验。使用SPSS统计软件version 19 (SPSS Inc.， IBM)对结果进行分析。方法的差异采用非配对法进行评估 -必要时进行检验或单因素方差分析。 被认为是统计显著。

3.结果

3.1。与单纯输注UC-MSC相比，UC-MSC输注联合DAC具有更长的抗糖尿病作用

我们研究了UC-MSCs和DAC对高脂饮食和STZ注射诱导的T2D小鼠的抗糖尿病作用。首先，我们通过测量体重、血糖水平、IPGTT和IPITT来评估T2D小鼠模型。注射STZ前，hfc -fed小鼠体重平均比正常小鼠重13.1 g。注射STZ后一周，STZ处理组的血糖水平是正常小鼠的2倍(补充图)1A)。此外，IPGTT和IPITT进一步证实了T2D模型的成功(补充图)1B和1C)。将T2D小鼠分为4组，分别给予不同的处理。DM组、MSC组、DAC组分别给予PBS、UC-MSC、DAC处理。MSC + DAC组(MD组)小鼠分别接受单次UC-MSC灌注和5天DAC注射。饮食喂养的老鼠是正常组。T2D组( ）呈持续性高血糖症和体重逐渐减少，而MSC组的血糖水平（ ）和MD组（ ）拒绝一个星期后MSC输液程度相似。尽管如此，DAC单独并没有表现出降血糖作用（ )。正如以前的报告中所建议的，MSC组的葡萄糖水平逐渐升高，并在研究期结束时（显示不同于T2D组的无显著差异 )。有趣的是，治疗4周后，MD组的血糖维持在较T2D组低的水平( ）（数字图1（a）)。因此，我们检测到的血清胰岛素浓度，发现在T2D组中的空腹血清胰岛素水平的持续下降，表明逐行β细胞功能障碍。间充质干细胞输注可暂时逆转血清胰岛素浓度的下降，而间充质干细胞与DAC联合应用可延长胰岛素浓度的升高(图)图1（b）)。此外,IPGTT和IPITT的结果表明,MSC组和MD组显示类似的改善血糖代谢和胰岛素敏感性一周后治疗,但MD组表现出更好的性能治疗4周后,与血糖水平(数据一致1 (c)和1 (d))。总之，这些结果提示DAC可将MSCs的抗糖尿病作用延长至治疗后4周。

3.2。UC-MSC输液正DAC处理促进胰岛的更持久的恢复与UC-MSC输液比单独

为了评估在减轻MSC和DAC的有效性β细胞功能障碍，我们通过免疫荧光染色探讨各组胰岛的动态变化。T2D组小鼠胰岛质量下降，结构明显异常。我们还量化了胰岛在胰腺各部分的数量。MSC灌注和UC-MSC+DAC处理均能改善治疗1周后胰岛的形态学和结构损伤，增加了每节胰岛的数目(图)2（一种））。然而，MSC组中胰岛的修复相对短暂的。UC-MSC注射4周后，胰岛质量是不同于T2D组没有区别。令人鼓舞的是，在MD保持组胰岛治疗4周后的持续恢复（图2（一种））。每部分胰岛MD组中的（数 ）治疗4周后也显著高于MSC组( ）（数字2(c))。接下来，我们评估了生命的表达β免疫荧光法检测细胞转录因子Pdx1。与正常组相比，T2D组胰岛素阳性细胞表达Pdx1的比例在治疗后一周下降至55.4%，并随时间持续下降。UC-MSC输注和UC-MSC+DAC治疗均使这一比例在治疗一周后提高到约70%。治疗4周后，MSC组与T2D组间表达Pdx1的胰岛素阳性细胞比例无显著性差异，而MD组仍明显高于T2D组(见图)2（b）和2(d))。这些观察结果表明，DAC能有效延长UC-MSC对胰岛质量和功能的影响，这与观察到的血糖水平一致。

3.3。UC-MSC+DAC治疗可诱导巨噬细胞M2极化，减轻胰岛炎症

T2D的特点是低度炎症，和β细胞功能障碍密切相关，所述炎症微胰岛[内32]。摘要意思β是最关键的细胞因子之一，说明进展β细胞功能障碍(32]。因此，我们对IL1的表达进行了评估β在小岛。与之前的报道相似，IL1也有明显的积累β在糖尿病胰岛。与正常组相比，T2D组胰岛内IL1水平高出近10倍β阳性细胞。MSC输液和MD治疗都显着降低IL1的intraislet表达β治疗1周后恢复正常。随着时间的推移，IL1的岛内表达β该MSC组中的轻度增加。治疗4周后，在MD组的胰岛表明IL-1的表达最低β五组中(图)3（a）和3(c))。

促炎性巨噬细胞被认为是intraislet炎性细胞因子如IL-1的最重要的因素β并发挥重要作用β细胞功能障碍(22];因此，我们研究了胰岛中巨噬细胞的数量和表型。我们发现，与正常组相比，T2D组、DAC组、MSC组、MD组胰岛中f4 /80阳性细胞数量增加，但四组间无明显差异(图)3（b）和3(d))。由于M1巨噬细胞和巨噬细胞的M2发挥进展和炎症的消退不同的角色，intraislet巨噬细胞的表型是由免疫荧光法检测。有趣的是，有在MSC输液和DAC处理后的巨噬细胞的表型显着的改变。我们计算在每个胰岛部的CD11c阳性细胞和FIZZ1阳性细胞的数目。一个星期后的治疗，有许多的CD11c阳性细胞和T2D组在几个FIZZ1阳性细胞。该MSC组和MD组中的CD11c阳性细胞的数目显着降低，和FIZZ1阳性细胞的数量与所述T2D组中（图相比增加4（a）和4（b）中），表明巨噬细胞M1在MSC和MD组朝M2极化。然后，MSC组中，FIZZ1阳性细胞的数量随时间减少。四个星期治疗后，共聚焦显微照片显示了MD组中比在MSC组中明显更多FIZZ1阳性巨噬细胞和略少的CD11c阳性的巨噬细胞（图4（一种）-4(d))。综上所述，UC-MSCs联合DAC联合治疗对胰岛内巨噬细胞向M2的极化有持续的影响，这可能是导致IL1积累减少的原因之一β在小岛。

3.4。对M2 UC-MSC的+ DAC进一步偏光M1巨噬细胞与UC-MSC单独治疗体外相比

的MSC已经很好地建立为能够偏斜的巨噬细胞朝向抗炎表型在体内和体外的[五，8，33-36]。给定的表型的巨噬细胞在体内的改变，我们研究了DAC是否可以增强MSC的对体外巨噬细胞极化的影响。我们使用这两种小鼠骨髓衍生的巨噬细胞（的BMDM）和腹腔巨噬细胞，其身份通过分别流式细胞术和免疫荧光，评价（补充图图2A和2B)。首先，为了确定巨噬细胞中DAC的适当剂量，我们进行了CCK-8实验，发现当巨噬细胞在25 nM浓度下处理72h后，细胞活力在10 nM时没有减弱并达到最大(图)5(一个))。此外，我们发现DAC可以将BMDMs倾斜成M2，这与之前的研究结果一致[28，29，37在我们的体外模型中，10 nmol/L剂量的DAC对巨噬细胞极化的影响最优(数据未显示)。因此，10nm DAC被应用于体外研究。我们使用LPS (100 ng/mL)和IFNγ(50 ng/mL)诱导巨噬细胞向M1转移，然后将巨噬细胞与UC-MSCs在Transwell系统中培养，巨噬细胞介质中存在或不存在DAC。LPS+IFN后BMDMs形态发生改变γ处理（补充图2C)。RT-PCR分析表明的Arg-1，巨噬细胞M2相关基因的增加的表达，并减少的巨噬细胞M1相关的基因（NOS2，TNF表达α和IL1β）在与MSC + DAC相比单独用MSC或DAC处理的细胞的巨噬细胞（图图5（b）)。类似地，免疫印迹分析显示的Arg-1表达的上调的DAC组和MSC组中的两个在与在LPS + IFN相比γ基，和MD治疗导致表达相对的Arg-1与用单独的MSC或DAC治疗显著增强。此外，MD治疗进一步下调的iNOS（图表达图5（c）和图5（d）)。并行地，结果由腹膜巨噬细胞（图的免疫荧光分析证实图5（e）和图5（f）)。总之，这些结果表明，UC-MSC和DAC的组合可以进一步分化M1巨噬细胞对M2巨噬细胞。

3.5。UC-MSC的+ DAC通过PI3K / Akt信号通路调控巨噬细胞极化

为了通过UC-MSC+DAC处理确定巨噬细胞极化的潜在机制，我们研究了可能的信号通路。研究发现，PI3K/AKT信号通路在巨噬细胞活化和极化过程中起重要作用[38，39]。PI3K/AKT通路的激活导致可诱导的NO合成酶减少，促炎细胞因子表达降低[40，41]，而PI3K / AKT途径的结果的一系列M2基因，包括减少的表达的下调的Arg-1 [42]。因此，我们检测在通过western印迹的PI3K / AKT途径分子的表达。MD处理后，巨噬细胞显示出PI3K明显增加和P-AKT表达（图图6（a）和图6（b）)。接下来，我们使用LY294002，PI3K的抑制剂，阻断的BMDM和腹腔巨噬细胞的PI3K / AKT途径。Western印迹和免疫荧光分析都表明，LY294002部分地抑制精氨酸-1的表达和升高的iNOS表达（图图7（a）-图7（d）)。由于不能完全抑制PI3K / AKT途径，精氨酸-1的表达仍然是LY294002组英寸此外，RT-PCR验证的结果，并表明炎性细胞因子的上调（TNFα和摘要意思β) Ly294002处理后(见图)图7（e）)。这些结果提示UC-MSCs+DAC极化巨噬细胞至少部分通过PI3K/AKT通路向抗炎型转化。

总之，这些结果，在体内和体外，表明UC-MSCs结合DAC极化巨噬细胞向抗炎类型，导致延长β-细胞修复与T2D小鼠葡萄糖稳态的改善(图)8)。

4.讨论

T2D已成为全世界主要的公共卫生问题。由于其再生特性和强大的免疫调节能力，MSCs被认为是T2D治疗的理想候选细胞[43]，但单个MSC输液的功效已在动物实验[被相对瞬态9]和临床试验[14，26]。因此，寻找提高或延长骨髓间充质干细胞疗效的策略是有意义的。据我们所知，这是首次证实UC-MSCs与DAC联合应用，与单纯灌注UC-MSC相比，可促进胰岛的持续恢复，从而延长了MSC的抗糖尿病作用，从而丰富了MSC的治疗。

的MSC，其被认为具有由两个的改良胰岛素抵抗和胰岛恢复函数[根本治疗T2D的能力9，11，43]，已经有前途的应用前景。但是，单个MSC输注后有限的降血糖作用将限制其临床使用。目前，许多研究者都致力于增强或通过在T2D的治疗的各种方法延长MSC的治疗效果。胡等人。[44报道了两种间充质干细胞输液与10周的西格列汀灌胃给药的联合应用改善了T2D大鼠的血糖平衡。与间充质干细胞输注联合日常口服药物治疗相比，间充质干细胞与DAC联合治疗可简化间充质干细胞的临床应用。郝等人[10]发现，在2周的时间间隔的骨髓的MSC的多个静脉输注在T2D大鼠持续反转的高血糖症。然而，MSC的多次输注可能会增加潜在的副作用，如肺和上呼吸道的不良事件，过敏性事件，以及肿瘤形成的风险。我们的研究结果可能有助于降低未来的临床应用MSC输液的频率，从而减少MSC输注的潜在风险。其他研究已经结合MSC输注高压氧[45]，调整MSC输注途径[10，46]，但没有研究已经延长了单个MSC输注的治疗持续时间至4周在体内。

巨噬细胞是T2D胰岛病理过程发生和进展的关键效应因子[21，22，47]。一般地，巨噬细胞被分为两种表型：“经典活化” M1巨噬细胞和“可选择性活化的” M2巨噬细胞。响应于由产生的趋化因子β- 细胞，M1样单核细胞/巨噬细胞渗入的胰岛和分泌大量的炎性细胞因子，导致β细胞功能障碍及丧失[18，47]。相比之下，新出现的数据表明，胰岛中的M2巨噬细胞参与了β细胞保护，修复，再生后急性或慢性损伤胰岛[23，24，48，49]。Criscimanna等人[49]发现朝M2巨噬细胞适当极化是为胰腺再生必要的。新出现的数据表明，MSC诱导的巨噬细胞极化起着2型糖尿病小鼠中的胰岛功能的保护中起重要作用[50]。Yin等。[25]发现UC-MSC分泌的IL-6朝向M2两极分化巨噬细胞。体内UC-MSC输注导致胰岛更M2巨噬细胞和在T2D小鼠因此减轻胰岛功能障碍，和IL6生产MSC的抑制导致更少的intraislet M2巨噬细胞和衰减胰岛恢复，表明M2巨噬细胞中发挥重要作用MSC诱导胰岛恢复。根据以前的研究，我们在T2D小鼠胰岛观察到M1巨噬细胞显着升高。然而，1周后的UC-MSC输注，M1巨噬细胞减少，而M2巨噬细胞显着的胰岛内增加，并且所述改变的单个MSC输注4周后变得微不足道。有趣的是，不同于单独UC-MSC输注，DAC加的MSC进一步延长MSC诱导的巨噬细胞intraislet极化。值得注意的是，朝着M2 intraislet巨噬细胞的极化在体内是与MD组中胰岛的恢复平行，并且在体外研究还表明，间充质干加DAC进一步极化朝向M2巨噬细胞的表型。因此，虽然我们没有贫化的巨噬细胞，观察MSC正DAC治疗后胰岛变化，上述结果表明，MD诱导胰岛恢复可能是冲高intraislet巨噬细胞极化。

DAC，一种后生改性剂，是能够诱导DNA低甲基化和重新激活基因表达。虽然DAC是在高剂量的细胞毒性，在低剂量时，它已被证明是安全的，并且美国食品和药物管理局批准用于治疗骨髓增生异常综合征和慢性粒细胞白血病。In this study, DAC (0.25 mg/kg) was administered by intraperitoneal injection for 5 consecutive days. McCabe et al. [51] showed that mice treated with 0.25 mg/kg DAC for 18 weeks did not suffer from any visible side effects, indicating that DAC at this low dose was safe. In parallel, we observed no significant differences in body weight and food intake between the T2D group and the DAC group (data not shown). Despite hematological diseases, increasing data demonstrate that DAC is a promising therapeutic modality for other diseases. Recent studies found that DAC was effective in the treatment of solid tumors by promoting immune checkpoint therapy and sensitizing chemotherapeutic drugs [52]。DAC还具有在低剂量下对免疫细胞的免疫调节作用，包括巨噬细胞和T reg细胞[28，29，53]，因此，施加于自身免疫性或炎性疾病的治疗效果。一些研究已经与具有治疗炎症性疾病类似的免疫调节作用的DAC药物合用DAC。Thangavel等人[28]报道，DAC或组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）单独只对巨噬细胞极化的影响有限，但DAC和TSA的组合治疗导致在C57 / BL大量巨噬细胞的表型变化和减轻内毒素血症诱发的急性肺损伤老鼠。我们的研究还发现，DAC呈温带和对巨噬细胞极化温和的影响，但DAC与UC-MSC的组合表现出巨噬细胞在体外显着的表型变化，表明有希望的方法来增强MSC的治疗效果，以及一个扩张的应用DAC。

鉴于胰岛内巨噬细胞表型的改变，我们在体外研究了UC-MSCs和DAC对巨噬细胞极化的影响。我们发现，DAC与UC-MSCs的结合导致巨噬细胞的表型发生显著变化。进一步研究发现MSC+ dac诱导的巨噬细胞极化部分是由PI3K/AKT通路诱导的，而PI3K/AKT通路是控制巨噬细胞极化的关键[38，39，41，54]。Li等人。[55]报道DAC可导致VSIG4基因低甲基化，从而增强PI3K/AKT-STAT3信号通路，从而抑制M1巨噬细胞活化。鉴于DAC是一种脱甲基剂，在未来的研究中，我们应该确定DAC的脱甲基作用是否会直接影响PI3K/AKT的表达，从而引起巨噬细胞的极化。

5。结论

综上所述，我们的研究首次发现，单次UC-MSC输注联合低剂量DAC，通过持续的胰岛修复，有效延长了UC-MSCs对T2D小鼠的治疗效果，这与胰岛内M2巨噬细胞升高、M1巨噬细胞减少有关。在体外，我们发现UC-MSCs联合DAC通过增强PI3K/AKT通路更有效地促进M1巨噬细胞向M2的极化。这些结果表明UC-MSCs联合DAC是一种很有前途的T2D治疗策略。

数据可用性

在研究期间使用和/或分析的数据集可根据要求从第一作者处获得。

的利益冲突

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

作者的贡献

经学与俞琤同等贡献这项工作。

致谢

我们感谢来自内分泌科和科解放军总医院分子生物学的技术援助和李冰冰，综研谢，李翔，吴志强，淼淼白，梁冬有益的建议，和其他成员。这项工作是由中国国家自然科学基金（81700679，81700680，81900704和）和中国（2013AA020105和2012AA020502）的科学技术部的863个项目的支持。

补充材料

补充图1：小鼠T2D模型的识别。补充图2：骨髓衍生巨噬细胞（的BMDM）和腹腔巨噬细胞的识别。补充表1：靶基因的引物序列（小鼠）。（补充材料）

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版权

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