1。介绍
逐步下降
β细胞质量和功能,2型糖尿病的主要特征(T2D),将不可避免地导致胰岛素缺乏随着疾病进展(
1]。现有的治疗方法如胰岛素促分泌素可以暂时增加胰岛素分泌,但类似于外源性胰岛素补充,他们无法扭转进步
β细胞功能障碍(
2]。此外,尽管可能角色dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV)抑制剂和glucagon-like peptide-1 (GLP-1)受体受体激动剂在提高
β在啮齿动物细胞功能,这些药物的效果对人类胰岛尚未完全确认(
3,
4]。这凸显了需要找到新的治疗目标T2D的基本病机。
间充质干细胞(msc)呈成体干细胞。除了self-renewable和多功能分化能力,msc还具有广泛的免疫调节特性和抗炎作用
5- - - - - -
8]。值得注意的是,小样本临床试验和实验研究已经证明,MSC输液可以保护功能
β细胞质量和改善高血糖T2D个体(
9- - - - - -
15]。巴恩等人报道,自体MSC移植减少胰岛素T2D患者的需求和刺激c -肽水平升高。她们在一次前瞻性随机单盲安慰剂对照研究[
15]。如果et al。
9)发现T2D老鼠表现出改善血糖稳态和MSC输液后胰岛的质量。
有趣的是,越来越多的研究表明,MSC-induced胰岛修复的潜在机制密切相关的变更intraislet巨噬细胞表型。巨噬细胞通常分为两个表型:经典激活巨噬细胞M1和M2巨噬细胞“或者激活”,尽管二分法是一种简化(
16]。一般来说,M1巨噬细胞分泌高水平的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF
α)和interleukin-1β(摘要意思
β),在炎症的发生和发展起着至关重要的作用。ehs等人发现,有更多的巨噬细胞胰岛内T2D患者比健康对照组和啮齿动物(
17]。进一步调查表明,islet-resident正常动物表现出一个平方米的巨噬细胞表型,而积累的巨噬细胞在小岛T2D模型对促炎的极化,导致
β细胞功能障碍(
18]。相比之下,M2巨噬细胞被认为是至关重要的效应细胞炎症的分辨率和促进组织修复
19,
20.]。证据表明M2巨噬细胞的作用
β细胞保护、修复、再生(
21- - - - - -
23]。肖et al。
24发现M2巨噬细胞诱导
β细胞增殖后胰管结扎,耗尽胰腺与clodronate导致巨噬细胞减少
β细胞复制。值得注意的是,阴et al。
25)发现,在T2D老鼠,MSC-induced
β细胞修复导致巨噬细胞表型的改变和随后的解决intraislet炎症,表明与其他antihyperglycemia代理,msc可以保护
β肽T2D的发病机制的关键方面。
然而,尽管有这些令人鼓舞的结果,单一MSC输液的效果持续时间相对短暂的(
9]。例如,如果et al。
9)发现,单个MSC注入的抗糖尿病的作用是维持不到4周T2D老鼠。临床试验中也表现出类似的结果(
14,
26]。刘等人。
14]发现,患者的糖化血红蛋白水平收到通过静脉注射和MSC移植胰腺内血管内注射前3个月但逐渐增加递减在接下来的9个月。
hypoethylating代理Decitabine (DAC),通常用于治疗血液疾病。最近,一些研究揭示了DAC的有效性在促进免疫治疗实体肿瘤的检查站,表明DAC在低剂量免疫调节特性(
27]。此外,越来越多的信息表明,低剂量的DAC能够预防或治疗某些炎症性疾病,如急性肺损伤和动脉粥样硬化(
28,
29日]。有趣的是,这些炎症的预防或治疗效果的DAC疾病也被归因于调节巨噬细胞的表型。曹et al。
29日)发现低剂量的DAC改善动脉粥样硬化,抑制炎性巨噬细胞。Thangavel et al。
28显示联合治疗的DAC,另一个表观遗传修饰符trichostatin抑制endotoxemia-induced急性肺损伤通过调节巨噬细胞表型。考虑到类似的DAC的免疫调节能力和MSC, MSC与DAC输液治疗的结合可以提高MSC的抗炎效果,导致一种改进的抗糖尿病的效果。
在这项研究中,我们研究了组合方案的治疗效果的msc和DAC链脲霉素(STZ) /脂肪食源性T2D老鼠。老鼠接受一个人类脐静脉输液cord-derived msc (UC-MSCs)结合连续5天的DAC管理,他们显示相对延长葡萄糖体内平衡和更持久的恢复
β细胞质量比给定MSC注入,这是伴随着巨噬细胞表型的极化对M2小岛。体外,DAC增强UC-MSCs的影响对M2巨噬细胞极化状态。综上所述,我们的研究表明,组合疗法UC-MSCs和DAC T2D可能是一个更好的治疗策略。
2。材料和方法
2.1。动物实验
八周大的雄性C57BL / 6 j小鼠从中国人民解放军总医院的购买。老鼠在标准住房条件(恒定室温25°C, 12 h / 12 h光明与黑暗周期,和免费的食物和水)。诱导T2D模型,小鼠高脂饮食(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,S0130) 8周,然后被腹腔注射STZ 90毫克/公斤(Sigma-Aldrich,圣路易斯)。正常对照组小鼠喂养食物饮食(非传染性疾病),8周。老鼠的随机血糖水平高于16.7更易与L连续三天被认为是T2D老鼠。腹腔内葡萄糖耐量测试(IPGTTs)和腹腔内胰岛素耐受性测试(IPITTs)也T2D模型进行验证。IPGTT和IPITT,小鼠禁食过夜和注射葡萄糖(1克/公斤)或胰岛素(1 U /公斤),然后是血糖水平被发现在30岁,60岁,90年,120分钟后注入。T2D小鼠随机分为4组:(1)DAC组小鼠腹腔注射0.25毫克/公斤DAC连续5天。(2)老鼠MSC组被注入了
1
×
10
6
UC-MSCs悬浮在0.2毫升磷酸盐(PBS)通过尾静脉。(3)小鼠的MSC和DAC组一个MSC注入和5天DAC管理。(4)小鼠T2D组通过尾静脉注射0.2毫升PBS。随机血糖和体重测量每周两次。IPGTT和IPITT进行1、2和4周后注入MSC。血清胰岛素浓度检测到的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(研发系统、明尼阿波利斯、MN)根据制造商的指示。所有实验协议是医学伦理委员会批准的中国人民解放军总医院。
2.2。细胞培养
人类脐带获得女性生在中国人民解放军总医院的书面知情同意。这个过程是经伦理委员会批准的中国人民解放军总医院。UC-MSCs分离和特征如前所述
30.,
31日]。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)隔绝的股骨和胫骨6雄性小鼠培养C57BL / 6 j 1640年RMPI(美国CA Gibco)补充10%胎牛血清(美国CA Gibco)、青霉素链霉素(美国Gibco) 1%, 100 ng / mL - csf(研发系统、MN、美国)37°C公司5%2。经过5天的文化,证实了细胞的身份anti-F4/80流式细胞术。腹膜巨噬细胞收集从6 C57BL / 6 j雄性小鼠腹膜灌洗与1.5毫升RMPI 1640和培养RMPI 1640补充10%胎牛血清和1%青霉素链霉素。巨噬细胞的形态学观察与相差显微镜图像。BMDMs或腹膜巨噬细胞被播种到six-well盘子,然后100 ng / mL有限合伙人(美国Sigma-Aldrich)和50 ng / mL干扰素
γ(美国研发系统,MN)添加24 h诱导巨噬细胞M1表型。然后,巨噬细胞被培养
4
×
10
4
UC-MSCs Transwell系统中有或没有添加DAC巨噬细胞媒体。
2.3。免疫荧光染色
胰腺组织的小鼠都收获1 2或4周后注入MSC。首先,麻醉小鼠腹腔内注射1%戊巴比妥钠(50毫克/公斤)和PBS灌注通过左心室,其次是4%多聚甲醛。然后,胰腺分离、脱水与30%蔗糖/ PB一夜之间,和嵌入在最佳切削温度复合(10月)。胰腺部分(6毫米)被切片机切片(热费希尔科学)和孵化一夜之间在4°C调湿室与主胰岛素抗体(1/200,豚鼠,Sigma-Aldrich),胰高糖素(可以说、鼠标、Abcam) Pdx1(1/200,兔子,CST) CD11c(1/200、鼠标、Abcam),摘要意思
β(1/100,兔子,Abcam) F4/80(1/200,兔子,Sigma-Aldrich)和Fizz1(1/200,兔子,Abcam)。部分与PBS洗后,他们孵化2 h二级抗体(1:500;Alexa萤石488/594-conjugated二级抗体,英杰公司)在室温下。核与DAPI染色(4
′
、6-diamidino-2-phenylindole Sigma-Aldrich)。捕获的图像用共焦激光扫描显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。腹膜巨噬细胞分布在玻璃盖玻片和4%多聚甲醛固定。剩下的步骤进行如上所述。
2.4。CCK-8化验
BMDMs被播种在96孔板
1
×
10
4
细胞/ 1640和培养RMPI补充10%胎牛血清,1%青霉素,链霉素和100 ng / mL - csf 24 h。接下来,细胞在不同浓度处理DAC(0、1、5、10、25、50、100和500 nmol / L) 72 h。然后,这些细胞被孵化与新媒体包含CCK-8 30分钟。在OD450光密度测定。细胞计数Kit-8 (CCK-8)工具包是购自DOJINDO分子技术。
2.5。定量实时逆转录酶聚合酶链反应
总RNA提取BMDMs使用试剂盒试剂(表达载体)和量化与NanoDrop系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的指示。然后,RNA是相对地转录cDNA逆转录工具包(热费希尔科学、弗里蒙特、钙、
http://www.thermo)。定量实时逆转录酶聚合酶链反应(存在)是7500年在重复执行实时PCR系统SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司,促进城市、钙、
http://www.appliedbiosystems.com)。热循环程序3分钟94°C,紧随其后的是40周期在95°C 15秒,15秒60°C, 72°C 30年代。
β肌动蛋白基因被用作参考。PCR引物补充表中列出
1。
2.6。西方墨点法
BMDMs与冷PBS洗两次,然后用蛋白质细胞溶解提取试剂(CWBIO,中国),含有两种蛋白酶抑制剂(CWBIO,中国)和磷酸酶抑制剂(瑞士罗氏公司)。蛋白质浓度溶解产物是由BCA化验(热费希尔科学)。等量的蛋白质每组都装上sds - page凝胶,随后转移到PVDF膜。接下来,膜被封锁在10% BSA和孵化主要抗体Arg-1 (Abcam 1: 1000年,美国),伊诺(Abcam 1: 1000年,美国),PI3K (CST 1: 1000年,美国),p-AKT (CST 1: 1000年,美国),一种蛋白激酶(CST 1: 1000年,美国),
β微管蛋白(ZSJQ-BIO 1: 2000年,中国),和GAPDH (ZSJQ-BIO 1: 2000年,中国)一夜之间在4°C。然后,膜与TBST清洗三次,孵化与相应HRP-conjugated二级抗体在室温下1 h。印迹是发射极耦合逻辑检测系统检测到的(PPLYGEN,中国),分析了ImageJ软件(国家卫生研究院博士)。
β微管蛋白和GAPDH是作为内部控制。
2.7。流式细胞术分析
BMDMs收获和悬浮在PBS和随后孵化PE-conjugated anti-F4/80抗体(美国eBioscience)和同形像抗体在室温下15分钟。PBS的细胞被洗了两次,200年resuspended
μL PBS,然后通过流式细胞术分析。
2.8。统计分析
所有的结果
的意思是
±
SD
从至少三个独立的实验。结果分析了使用SPSS统计软件版本19 (IBM SPSS Inc .)。差异意味着使用未配对进行了评估
t
在需要时以及或单向方差分析。
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。UC-MSC灌注结合DAC显示一个更长期糖尿病作用而独自UC-MSC输液
我们调查了糖尿病作用UC-MSCs和DAC T2D引起的小鼠高脂饮食和STZ注入。首先,我们评估了T2D小鼠模型通过测量体重、血糖水平、IPGTT, IPITT。注射STZ之前,HFD-fed小鼠比正常小鼠的平均13.1克。注射STZ后一周,STZ-treated组的血糖水平高出两倍比正常小鼠(补充图
1)。此外,IPGTT IPITT进一步证实T2D的成功模型(补充数据
1 b和c)。然后,T2D老鼠被分成4组和接受不同的治疗方法。老鼠在DM组,MSC集团和DAC组收到了PBS输液,UC-MSC输液,分别和DAC的治疗。老鼠MSC + DAC组(MD组)获得单个UC-MSC输液和注射5天DAC。chow饮食小鼠正常组。T2D组(
30.6
±
0.9
更易
/
l
显示持续的高血糖和逐步减少体重,而MSC组的血糖水平(
26.8
±
1。3
更易
/
l
)和MD组(
25.1
±
1。3
更易
/
l
)拒绝类似的学位MSC输液后一周。尽管如此,DAC没有显示血糖过低的影响(
29.7
±
0.7
更易
/
l
)。先前的报道表明,MSC组的血糖水平逐渐增加,显示无显著差异的研究结束的时期(T2D集团
29.9
±
1。4
更易
/
l
)。有趣的是,MD组的血糖水平维持在较低水平比T2D组治疗后4周(
24.6
±
0.9
更易
/
l
)(图
1(一))。因此,我们发现血清胰岛素浓度,发现连续减少T2D组空腹血清胰岛素水平,表明进步
β细胞功能障碍。MSC输液是暂时性的逆转血清胰岛素浓度的下降,而MSC和DAC施加持续增强(图
1 (b))。此外,IPGTT和IPITT的结果表明,MSC组和MD组显示类似的改善血糖代谢和胰岛素敏感性一周后治疗,但MD组表现出更好的性能治疗4周后,与血糖水平(数据一致
1 (c)和
1 (d))。总之,这些结果表明,DAC延长msc治疗后4周的抗糖尿病的效果。
人类脐cord-derived-mesenchymal干细胞(UC-MSC)注入结合decitabine (DAC)施加更多的长期抗糖尿病的效果比单独治疗。(a)测量血糖水平连续MSC注入和DAC后治疗。(b)空腹血清胰岛素水平的五组被ELISA检测到1,2,4周后UC-MSC注入和DAC的治疗。葡萄糖耐量(c和d)评估了腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT) (c)和胰岛素耐受性评价了腹腔内胰岛素耐量试验(IPITT) 1, 2, 4周后UC-MSC注入和DAC的治疗。IPITT,结果相对于最初的血糖浓度。(一)——(d)的值是
的意思是
±
SD
;
n
=
6
每组小鼠;
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。缩写:UC-MSC-human脐cord-derived间充质干细胞;DAC-decitabine;STZ-streptozotocin;2 T2D-type糖尿病。
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3.2。UC-MSC注入+ DAC治疗促进一个更持久的恢复胰岛与UC-MSC输液
评估的有效性msc,在减轻DAC
β细胞功能障碍,我们探讨了小岛的动态变化在每一组通过免疫荧光染色。T2D组的小鼠表现出减少胰岛细胞的质量,这是明显的异常结构。我们也量化的每个部分胰腺的胰岛数量。MSC注入和UC-MSC + DAC治疗改善形态和结构损伤胰岛治疗后1周和增加胰岛的数量每节(图
2(a))。然而,恢复胰岛MSC组相对短暂。UC-MSC灌注后4周,胰岛质量T2D组的区别。令人鼓舞的是,MD组保持持续恢复胰岛治疗后4周(图
2(a))。小岛的数量每节MD组(
13.2
±
0.7
)在治疗后4周也显著高于在MSC集团(
10.5
±
0.8
)(图
2(c))。接下来,我们评估的表现至关重要
β通过免疫荧光细胞转录因子Pdx1。insulin-positive细胞表达的比率Pdx1 T2D组治疗后一周下降到55.4%,随着时间的推移不断下降的价格相比正常组。UC-MSC注入和UC-MSC + DAC治疗不仅提升了治疗后一周大约70%的比率。4周治疗后,没有明显差异的比率insulin-positive细胞表达Pdx1 MSC组和T2D组之间,虽然比MD组仍明显高于T2D集团(数据
2(b)和
2(d))。这些观察表明,DAC有效延长UC-MSC对胰岛的影响质量和功能,这是根据观察到的血糖水平。
人类脐cord-derived——(UC)间充质干细胞(msc)结合decitabine (DAC)表现出持久的恢复胰岛功能。(一)代表小岛沾胰岛素(绿色)和胰高血糖素抗体(红色)的五组1,2,4周后治疗。核与DAPI标记。酒吧规模:50
μm。(b)两倍显微照片沾anti-insulin(绿色)和anti-Pdx1(红色)抗体的五组1,2,4周后治疗。核与DAPI标记。酒吧规模:50
μm。(c)量化每冰冻切片免疫荧光染色后观察到的小岛。(d)量化insulin-positive细胞coexpressing Pdx1。量化是由评估小岛从每组至少5部分。数据的显示
的意思是
±
SD
,
n
=
5
量
6
每组小鼠;
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。
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3.3。UC-MSC + DAC治疗诱导M2巨噬细胞极化和减轻炎症胰岛
T2D的特点是慢性炎症
β细胞功能障碍密切相关的炎性微环境内小岛(
32]。摘要意思
β是最关键的细胞因子之一,占进步吗
β细胞功能障碍(
32]。因此,我们评估摘要意思的表达
β在小岛。类似于先前的报道,有一个明显的积累摘要意思
β在糖尿病胰岛。T2D组与正常组相比,表现出几乎有着较高的intraislet摘要意思
β阳性细胞。MSC注入和医学治疗显著降低intraislet摘要意思的表达
β正常的程度在治疗后1周。随着时间的推移,intraislet摘要意思的表达
βMSC组轻度增加。治疗后4周,小岛的MD组显示最低的摘要意思的表达
β五组(数字
3(一)和
3(c))。
人类脐cord-derived——(UC)间充质干细胞(msc)结合decitabine (DAC)减轻intraislet摘要意思
β表达和导致微妙的巨噬细胞的数量增加。(一)代表小岛沾胰岛素抗体(绿色)和摘要意思
β(红色)的五组1、2和4周后治疗。(b)代表小岛沾胰岛素抗体(绿色)和F4/80(红色)5组1,2,4周后治疗。核与DAPI标记。酒吧规模:50
μ摘要意思。m。(c)量化
β艾滋病患者每胰岛细胞。(d)的量化F4/80-positive每胰岛细胞。量化是由评估小岛从每组至少6部分。数据的显示
的意思是
±
SD
,
n
=
6
每组小鼠;
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。
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促炎巨噬细胞被认为是最重要的贡献者intraislet炎性细胞因子如摘要意思
β发挥重要作用
β细胞功能障碍(
22];因此,我们调查了小岛的数量和巨噬细胞的表型。我们发现,相比之下,F4/80-positive细胞的数量在正常组,F4/80-positive胰岛细胞的数量提高T2D集团DAC, MSC, MD组,但没有明显的差异四组数据
3(b)和
3(d))。鉴于巨噬细胞M1和M2巨噬细胞炎症的进展和解决扮演着不同的角色,intraislet巨噬细胞的表型是由免疫荧光检测。有趣的是,有著名的MSC输液后巨噬细胞表型的变化,DAC治疗。我们清点的数量CD11c-positive每个胰岛细胞和Fizz1-positive细胞部分。治疗一周后,有许多CD11c-positive细胞和少数Fizz1-positive T2D组。MSC CD11c-positive细胞群的数量和MD组显著减少,和Fizz1-positive细胞的数量增加的价格相比T2D集团(数字
4(一)和
4(b)),这表明M1巨噬细胞极化对M2 MSC和MD组。然后,在MSC集团Fizz1-positive细胞的数量减少。治疗后4周,共焦显微图显示显然更Fizz1-positive巨噬细胞和CD11c-positive巨噬细胞在MD组略少于MSC组(数字
4(一)-
4(d))。总的来说,这些结果表明,UC-MSCs + DAC的联合治疗产生了持续的影响对M2 intraislet巨噬细胞的极化,减少积累了摘要意思
β在小岛。
人类脐cord-derived——(UC)间充质干细胞(msc)结合decitabine (DAC)诱导M2巨噬细胞极化的小岛。(一)代表小岛沾胰岛素抗体(绿色)和Fizz1(红色)的五组1,2,4周后治疗。核与DAPI标记。酒吧规模:50
μm。(b)代表小岛沾胰岛素抗体(绿色)和CD11c(红色)的五组1,2,4周后治疗。核与DAPI标记。酒吧规模:50
μm。(c)的量化Fizz1-positive每胰岛细胞。(d)的量化CD11c-positive每胰岛细胞。量化是由评估小岛从每组至少6部分。数据的显示
的意思是
±
SD
,
n
=
6
每组小鼠;
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。
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3.4。UC-MSCs + DAC进一步极化M1巨噬细胞对M2与UC-MSC治疗体外
msc建立能够扭曲巨噬细胞向抗炎表型体内和体外(
5,
8,
33- - - - - -
36]。鉴于体内巨噬细胞表型的改变,我们研究了DAC能否增加msc在体外巨噬细胞极化的影响。我们使用两个老鼠骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和腹膜巨噬细胞的身份进行评估通过流式细胞仪和免疫荧光,分别为(补充数据
2 a和2 b)。首先,确定一个适当的剂量DAC的巨噬细胞,我们执行CCK-8化验,发现当巨噬细胞治疗与DAC浓度高达25 nM 72 h,细胞生存能力不减毒和最大化10 nM(图
5(一个))。此外,我们发现DAC可以斜BMDMs M2,先前的研究显示[
28,
29日,
37),剂量的DAC 10 nmol / L实现最优对巨噬细胞极化的影响在我们的体外模型(数据未显示)。因此,10 nM DAC是应用于体外研究。我们利用有限合伙人(100 ng / mL)和干扰素
γ(50 ng / mL)诱导巨噬细胞M1,然后M1巨噬细胞培养与UC-MSCs Transwell系统在媒体巨噬细胞DAC的存在与否。有限合伙人+干扰素后BMDMs的形态学改变
γ治疗(补充图
2摄氏度)。rt - pcr分析显示Arg-1表达的增加,M2 macrophage-related基因,和减少M1 macrophage-related基因的表达(NOS2, TNF
α,摘要意思
β)与msc巨噬细胞治疗+ DAC相比,细胞用msc治疗或DAC(图
5 (b))。类似地,免疫印迹分析显示一个upregulation Arg-1表达式的DAC组和MSC集团的价格相比有限合伙人+干扰素
γ组和医学治疗导致显著增加Arg-1表达相对于msc治疗或独自DAC。此外,医学治疗进一步下调伊诺(数据的表达
5 (c)和
5 (d))。同时,结果证实了腹膜巨噬细胞的免疫荧光分析(数据
5 (e)和
5 (f))。总之,这些结果表明UC-MSCs和DAC的组合可能会进一步对M2巨噬细胞极化M1巨噬细胞。
人类脐cord-derived——(UC)间充质干细胞(msc)结合decitabine (DAC)进一步极化M1对M2 UC-MSCs相比,体外巨噬细胞。(一)BMDMs孵化与DAC浓度范围从0到500 nmol / L 72 h。细胞生存能力由CCK-8分析决定。未经处理的数据表示为百分数控制细胞。(b-f)巨噬细胞单独培养(控制)或结合有限合伙人+干扰素
γ24 h,然后刺激巨噬细胞单独培养(有限合伙人+干扰素
γ)或UC-MSCs (msc), DAC (DAC)或UC-MSCs和DAC (M + D)在Transwell系统72 h。(b)定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)分析五组。结果提出了相对于对照组,设置为1。(c和d)免疫印迹分析和量化BMDMs Arg-1和伊诺表达。
β微管蛋白被用作蛋白质加载控制。(e和f)免疫荧光和量化Arg-1伊诺腹膜巨噬细胞中表达。核与DAPI标记。酒吧规模:100
μm值
的意思是
±
SD
三个单独的实验。(a)和(氟):
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。(b)
§
p
<
0.05
(与控制);
∗
p
<
0.05
(与有限合伙人+干扰素
γ);
__
p
<
0.05
(与MSC)。
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3.5。UC-MSCs + DAC调节巨噬细胞极化通过PI3K / AKT信号通路
确认巨噬细胞极化的基本机制UC-MSC + DAC治疗,我们调查了可能的信号通路。研究发现,PI3K / AKT信号通路在巨噬细胞激活和极化至关重要
38,
39]。PI3K / AKT通路的激活导致更少的诱导没有合酶和减少促炎细胞因子表达(
40,
41的差别),而对这些PI3K / AKT途径导致减少了一系列M2基因的表达,包括Arg-1 [
42]。因此我们发现分子的表达PI3K / AKT途径免疫印迹。医学治疗后,巨噬细胞显示一个明显的PI3K和p-AKT表达式(数字
6(一)和
6 (b))。接下来,我们使用LY294002, PI3K的抑制剂,阻止PI3K / AKT通路BMDMs和腹膜巨噬细胞。免疫印迹和免疫荧光分析都表明,LY294002部分抑制Arg-1表达和高架伊诺表达式(数字
7(一)- - - - - -
7 (d))。由于不能完全抑制PI3K / AKT通路,Arg-1表达式仍然Ly294002组。此外,rt - pcr验证结果和显示的upregulation炎性细胞因子(TNF
α和摘要意思
βLy294002治疗后(图)
7 (e))。这些结果表明,UC-MSCs + DAC极化巨噬细胞抗炎类型至少部分通过PI3K / AKT通路。
UC-MSCs结合decitabine诱导PI3K / AKT通路的激活。(a和b)免疫印迹分析和量化的磷酸化AKT (p-AKT),总AKT, PI3K和GAPDH BMDMs表达式。GAPDH被用作蛋白质加载控制。值
的意思是
±
SD
三个单独的实验。
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。
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人类脐cord-derived——(UC)间充质干细胞(msc)结合decitabine (DAC)调节巨噬细胞极化通过PI3K / AKT信号通路。(a和b)免疫印迹分析和量化PI3K的磷酸化AKT (p-AKT),总AKT,进气阀打开,Arg-1, GAPDH BMDMs。GAPDH被用作蛋白质加载控制。(c和d)免疫荧光和量化Arg-1和伊诺腹膜巨噬细胞。核与DAPI标记。酒吧规模:100
μm。(e) Arg-1 rt - pcr分析,NOS2摘要意思
β,肿瘤坏死因子
α表达的五组。结果提出了相对于对照组,设置为1。值
的意思是
±
SD
三个单独的实验。(模拟)
∗
p
<
0.05
和
∗
∗
p
<
0.01
。(e)
§
p
<
0.05
(与控制);
∗
p
<
0.05
(与有限合伙人+干扰素
γ);
__
p
<
0.05
(与MSC);
#
p
<
0.05
(与M + D)。
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一起,这些结果,体内和体外,证明UC-MSCs结合DAC极化巨噬细胞抗炎类型,导致长时间
β细胞修复和改善葡萄糖稳态T2D老鼠(图
8)。
原理图的影响人类脐cord-derived——(UC)间充质干细胞(msc)结合decitabine (DAC) T2D老鼠。促炎M1巨噬细胞导致的累积
β细胞功能障碍和葡萄糖T2D的动态平衡。UC-MSCs结合DAC诱导巨噬细胞极化持续对M2通过PI3K / AKT信号通路,导致长时间
β细胞修复和改善葡萄糖体内平衡。
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4所示。讨论
T2D已成为世界范围的一个主要公共健康问题。由于再生能力和强大的免疫调节功能,msc被认为是理想的候选细胞T2D治疗(
43),但单个MSC输注的疗效相对瞬态在动物实验(
9和临床试验
14,
26]。因此,搜索策略来增强或延长msc的功效是有意义的。我们所知,这是第一次研究证明UC-MSCs和DAC显示长期糖尿病作用通过促进持续恢复胰岛与UC-MSC注入,从而丰富了MSC治疗。
msc,被认为有能力治疗T2D从根本上改善胰岛素抵抗和恢复胰岛功能(
9,
11,
43),有应用前景。然而,有限的降糖效果后一个MSC注入将限制其临床使用。目前,许多研究人员致力于提高或延长的治疗效果,通过各种方法治疗T2D msc。胡锦涛et al。(
44)报道,两个MSC的组合与10周的胃内的政府注入T2D sitagliptin显示改善血糖稳态的老鼠。与MSC注入日常口腔医学治疗的组合,组合疗法MSC和DAC可能简化应用程序在临床使用MSC。郝et al。
10)发现的多个静脉注入骨髓msc间隔可持续逆转在T2D高血糖大鼠2周。然而,msc的多个输液的风险可能会增加潜在的副作用,如肺和上呼吸道不良事件,过敏事件,和肿瘤的形成。我们的发现可能有助于减少MSC灌注在未来临床应用的频率,因此减少MSC输液的潜在风险。其他研究MSC注入与高压氧结合起来
45),调整MSC注入的方法
10,
46),但没有研究长期的治疗持续时间一个MSC体内注入到4周。
巨噬细胞的发病和进展的关键效应器胰岛T2D的病理过程
21,
22,
47]。一般情况下,巨噬细胞分为两种表型:经典激活巨噬细胞M1和M2巨噬细胞或者激活。针对趋化因子所产生的
β肽,M1-like单核细胞/巨噬细胞渗透到小岛和分泌大量的促炎细胞因子,导致
β细胞功能障碍和损失(
18,
47]。相比之下,新兴的数据表明,M2巨噬细胞在小岛的贡献
β细胞保护、修复、再生后急性或慢性胰岛损伤(
23,
24,
48,
49]。Criscimanna et al。
49)发现,适当的巨噬细胞极化对M2胰腺再生所必需的。新兴的数据表明,MSC-induced巨噬细胞极化的保护起着重要的作用在2型糖尿病小鼠胰岛功能(
50]。阴et al。
25)发现UC-MSCs分泌白细胞介素6极化对M2巨噬细胞。体内UC-MSC注入导致更多M2巨噬细胞在胰腺胰岛,因此缓解T2D小鼠胰岛功能障碍,在msc和抑制白细胞介素6生产导致更少的intraislet M2巨噬细胞和减毒胰岛修复,表明M2巨噬细胞MSC-induced胰岛修复中发挥重要作用。根据先前的研究,我们观察到大量海拔在小岛T2D小鼠巨噬细胞M1。然而,UC-MSC灌注后1周,M1巨噬细胞减少,而M2胰岛内巨噬细胞显著增加,改变成了无关紧要的单一MSC灌注后4周。有趣的是,不像UC-MSC输液,DAC + msc进一步延长MSC-induced intraislet巨噬细胞极化。值得注意的是,intraislet巨噬细胞的极化对M2体内与恢复胰岛MD组和体外研究也表明,msc + DAC进一步极化对M2巨噬细胞表型。因此,尽管我们没有耗尽巨噬细胞观察胰岛改变MSC + DAC治疗后,上述结果表明,MD-induced胰岛修复可能是归因于intraislet巨噬细胞极化。
DAC,一种表观遗传修饰符,能够诱导DNA hypomethylation和激活基因表达。尽管DAC是细胞毒性在高剂量,在低剂量,它已被证明是安全的,美国食品和药物管理局批准的治疗骨髓增生异常综合征和慢性myelomonocytic白血病。在这项研究中,DAC(0.25毫克/公斤)是由腹腔内注射连续5天。麦凯布等。
51)表明,老鼠接受0.25毫克/公斤DAC 18周没有遭受任何可见的副作用,表明DAC低剂量是安全的。同时,我们观察到无显著差异在体重和食物摄入量T2D组和DAC(数据未显示)。尽管血液疾病,增加数据证明DAC是一种很有前途的治疗方法为其他疾病。最近的研究发现,DAC是有效治疗实体肿瘤通过促进免疫疗法和敏化检查站化疗药物(
52]。DAC还具有免疫调节对免疫细胞的影响,包括巨噬细胞和Treg细胞低剂量(
28,
29日,
53),因此发挥自身免疫或炎症性疾病的治疗效果。一些研究结合DAC和药物,具有类似的免疫调节效应DAC治疗炎症性疾病。Thangavel et al。
28)报道,DAC或组蛋白脱乙酰酶抑制剂Trichostatin (TSA)仅只有一个巨噬细胞极化的影响有限,但DAC和TSA的联合治疗导致大量巨噬细胞表型变化和缓解endotoxemia-induced C57 /提单小鼠急性肺损伤。我们的研究还发现,DAC显示温带和温和的对巨噬细胞极化的影响,但与UC-MSCs DAC的结合表现出引人注目的体外巨噬细胞表型变化,展示了一个有前途的方法来加强MSC治疗效果以及不断扩大的DAC的应用。
鉴于胰岛内巨噬细胞表型的改变,我们调查了UC-MSCs和DAC对体外巨噬细胞极化的影响。我们发现与UC-MSCs DAC的结合导致了戏剧性的巨噬细胞表型变化。进一步调查发现,MSC + DAC-induced巨噬细胞极化引起的部分是PI3K / AKT通路,在巨噬细胞极化的控制是至关重要的
38,
39,
41,
54]。李等人。
55)报道,DAC可能导致的hypomethylation VSIG4基因,因此提高PI3K / AKT-STAT3信号通路,导致M1巨噬细胞活化的抑制作用。鉴于DAC是脱甲基作用剂,在将来的研究中,我们应该确定DAC的脱甲基作用效果直接影响PI3K / AKT的表达,从而导致巨噬细胞的极化。