脂肪源间充质干细胞在尿毒症大鼠腹膜纤维化模型中调节纤维化和炎症

摘要

腹膜纤维化（PF）表示腹膜透析（PD）的长期并发症，影响腹膜（PM）功能。脂肪组织来源的间质干细胞（ASC）显示免疫调节作用，并且可以代表一个策略，以阻止PF。这项研究的目的是分析在尿毒症大鼠开发的实验模型PF ASC的效果。以模仿患者长期PD，组合模型，其特点是PF和慢性肾脏病（CKD）的结合临床情况，Wistar大鼠被开发。大鼠用0.75％含腺嘌呤饲料喂养，30天，以诱导CKD尿毒症。PF用葡萄糖酸氯己定（CG）从第15天至30的腹膜内注射诱导。 在第15天和第21天静脉注射ASC。大鼠分为5组:对照组、正常大鼠;CKD，大鼠接受腺嘌呤饲料;PF，老鼠接收CG;CKD+PF, CKD合并PF大鼠;CKD+PF+ASC组尿毒症大鼠。用马尾松三色染色评价PF。通过免疫组织化学、多重分析和qPCR来评估炎症和纤维相关因子。与对照组和CKD组相比，GC给药导致PF和CKD+PF组PM厚度和炎症显著增加。ASC处理阻碍了PF的发展。 Further, the upregulation of profibrotic factors (TGF-β在CKD+PF组中，ASC明显改善了肌成纤维细胞表达的增加。除了抗纤维化作用外，ASC还具有抗炎作用，可避免白细胞浸润和炎症细胞因子(IL-1)过表达β肿瘤坏死因子-α和IL-6)在GC诱导的PM中。在CKD+PF的实验模型中，ASC能够有效地阻止PF的发展，可能是由于其免疫调节特性。这些结果表明，ASC可能是治疗长期pd相关性纤维化的一种潜在策略。

1.介绍

腹膜透析（PD）是一种安全的维持生命的肾脏替代方式，终末期肾病（ESRD）全球治疗使用。根据最后的注册表，全球透析人口的11％是在PD [1- - - - - -3.]。在许多国家，腹膜透析患者的预后与血液透析患者相当，甚至更好，而且腹膜透析的成本效益也更高。

尽管与血液透析相比，腹膜透析可以更好地保存患者的残余肾功能，提高患者的生活质量，但腹膜透析促进腹膜膜持续暴露于生物不相容的高渗透析溶液中，从而导致慢性腹膜透析炎症。此外，PD患者还存在感染性腹膜炎的风险。长期暴露于腹膜透析液与感染性腹膜炎反复发作相关，可诱发炎症、新生血管生成和腹膜纤维化(PF)，从而损害其功能，导致这种方式的技术失败[4,5]。

PF的病理生理包括间皮细胞的丢失和间皮下区域的增厚，主要由细胞外基质(ECM)和肌成纤维细胞组成。最近的研究提出，间皮细胞是肌成纤维细胞的一个重要来源，通过上皮-间充质转化。然而，最近的一项研究显示，间皮亚常驻成纤维细胞作为肌成纤维细胞前体在PF中发挥重要作用[6]。除了肌成纤维细胞外，还经常观察到白细胞如巨噬细胞和t细胞浸润的间皮亚细胞。这些炎症细胞的激活是由刺激性刺激驱动的，如透析液中高浓度的葡萄糖和葡萄糖降解产物，它们开始合成并释放大量促炎因子，即IL-1-β肿瘤坏死因子-α、IL-6，特别是转化生长因子-β(TGF -β)。TGF -下β信号转导，肌成纤维细胞，特征为α-SMA表达，产生ECM蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白等，导致PF的发生[7,8]。

目前的策略，在提交给PD患者减少PF包括使用bioincompatible透析液。此外，抗纤维化的药物，如他莫昔芬的临床管理，已在一些患者描述为试图废除腹膜的炎症和纤维化。然而，这些方法仅是部分有效的[7,9,10]。此外，炎症和TGF-的实验阻断β在动物模型中，丙戊酸、三苯氧胺和骨形态发生蛋白-7 (BMP7)在阻止PF进展方面显示了积极的作用。然而，需要进一步的研究来确认这些化合物的有效性和安全性[5,10]。

在此背景下，替代的研究方法，以防止PF，如基于细胞的疗法，是极为重要的。以前的实验研究表明，间充质干细胞（MSC）的管理，防止肾脏炎症和纤维化的发展，急性和慢性肾脏病（CKD）的模式促进肾脏保护作用，由于其免疫调节作用[11,12]。因为有表达相似性肾和腹膜纤维发生的机制,本研究的目的是分析潜在的抗炎和antifibrotic影响脂肪细胞在大鼠MSC (ASC)政府提交给尿毒症CKD + PF的组合模型,更好的再现了长期帕金森病的病理生理的场景。

2.材料和方法

2.1。动物模型

38只成年雄性Wistar大鼠体重300-350克，从圣保罗大学(USP)当地动物设施获得。动物被饲养在恒温的环境中 °C, under a 12 h light/dark cycle and had free access to tap water. All animal procedures were approved by the Research Ethics Committee of USP Faculty of Medicine (FMUSP-CAPPesq 029/2016) and were conducted in accordance with our institutional guidelines and with international regulations for manipulation and care of experimental animals. In order to mimic the clinical situation of patients on long-term PD, a combo model, characterized by the combination of PF and uremia, was employed in the present study [10]。尿毒症诱导富含腺嘌呤饮食。二十四个动物喂食连续30天0.75％含腺嘌呤大鼠饮食（西格玛公司，St.Louis，USA），而其余的14只动物用标准大鼠食物（Nuvital实验室，巴西库里蒂巴）进料。PF是由葡萄糖酸氯己定的IP注射（CG）在24只动物诱导。体重评估每周一次，并与自动光电装置清醒的动物（Visitech系统，USA）测定尾套收缩压，在研究期结束时。

2.2。试验协议

给予富含腺嘌呤的饮食15天后，当尿毒症已经建立时，每日IP注射CG诱导PF。两次静脉注射 治疗组在两个不同的时间分别给予ASC。第一剂量ASC与第一次IP CG注射同时给予(在开始给予富含腺嘌呤的饮食15天后)。第二次是在6天后，即开始使用富含腺嘌呤的饮食后21天。对所有动物进行了共计30天的研究。我们的实验方案包括以下几组:(我)CKD：接收富含腺嘌呤的饮食30天的动物引起严重的CKD（ )(2)PF:以标准大鼠饲料喂养，提交cg诱导的PF模型( )(3)CKD + PF：富含腺嘌呤饮食管理后15天提交给CG-诱导的PF模型CKD动物开始（ )(iv)CKD+PF+ASC: CKD+PF动物灌2次 每个ASC，用无菌PBS稀释。第一次输注与第一次CG IP注射同时进行，是在开始给予富含腺嘌呤饮食15天后，第二次是在开始给予富含腺嘌呤饮食21天后( )（五）对照组:喂食标准大鼠饲料，不加治疗30天( )。

2.3。大鼠ASC的分离、扩增和鉴定

Gonadal adipose tissue from 5 healthy adult male Wistar rats was obtained after its euthanasia with an IP injection of 0.1 g of sodium thiopental. The adipose tissue samples were minced with sterile scissors and digested in a 0.075% collagenase solution (Sigma-Aldrich, USA). After centrifugation, the isolated cells were cultured under 37°C and 5% CO₂in plastic culture flasks with Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM-low glucose, Invitrogen, USA) containing 10% inactivated fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 100 units/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin antibiotic solution (Gibco, Carlsbad, MO, USA). Culture medium was changed three times a week, and cells were trypsinized and reseeded when they reached 80% of confluence. At the 4^th根据国际细胞治疗学会共识定义的标准，细胞被鉴定为间充质干细胞:标准条件下粘附塑料，对特异性表面标记物如CD29、CD44、CD90和CD105阳性;消极CD45;以及在适当的培养基和刺激下向间充质系分化的能力。

细胞在传代4-6根据流式细胞术分析（在FACSCanto™，BD Biosciences公司，USA）中使用。为了这个目的，ASC被标记用针对CD31，CD29，和CD90异硫氰酸酯（FITC-）缀合的抗体;藻红蛋白缀合的抗CD34，CD44，和CD105抗体（PE-）;PE-CY5.5-缀合的抗体对CD45;和FITC-或PE缀合的IgG非特异性（eBioscience公司，圣地亚哥，USA）。这些分析的结果表示为补充图1，详见补充资料部分。与此同时，我们也评估了ASC在体外条件下向包括成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞在内的间充质细胞系分化的潜力。5 .在培养基中补充10-8 M/L地塞米松(Sigma)诱导成骨分化μg/mL抗坏血酸2-磷酸(Sigma)， 10mm /Lβ-glycerolphosphate(σ)。为了证实钙沉积的存在，培养物用茜素红S染色(Nuclear, Sao Paulo, SP, Brazil)。为诱导成软骨分化，在补充10 ng/mL转化生长因子- (TGF-)的DMEM中培养ASC。β1 (Sigma)， 50 nM抗坏血酸2-磷酸(Sigma)， 6.25 mg/mL胰岛素。为确认细胞分化，用pH值2.5的阿利新蓝染色。在DMEM中加入5诱导ASC发生脂肪分化μg/mL insulin, 10-6 M dexamethasone, 0.5 μM异丁基甲基黄嘌呤，50μ吲哚美辛。然后用油红O染色细胞，以确认细胞空泡中存在脂滴(补充图)2)。对于ASC的进一步表征，细胞的免疫荧光测定法在4培养^th通过进行。为此，我们使用了针对CD19、CD44、CD90、CD146 (Millipore, EUA)、CD73和CD45 (Santa Cruz Biotechnology, USA)的特异性一抗，以及荧光染料偶联的Alexa 488、594和546二抗(Life Technologies)。细胞核用DAPI反染(4)6-diamidino-2-phenylindole表达载体)。数字1显示了这些结果。

2.4。腹膜组织形态学及免疫组化分析

在研究结束时，在30天的随访后，通过IP注射致命剂量的硫喷妥钠对动物实施安乐死。打开腹腔，采集PM的血液和组织标本。血液标本离心，血清尿素浓度测定使用一种商业比色试剂盒(Labtest，巴西)。从离注射点较远的前腹壁取PM样品，仔细解剖，立即冷冻在液氮中，并保存在-70℃用于聚合酶链反应(PCR)和多重分析。附加切片在Duboscq-Brazil溶液中固定45分钟，然后在缓冲的4%甲醛溶液中固定。

PF在第(3)节中进行评价μm)被马松三色染色。每只大鼠至少拍摄10张200倍放大的数字图像，其厚度(μm)所有显微照片的测量。然后计算每只大鼠的平均腹膜厚度[5]。在这个过程中，我们使用了数字化图像和图像分析软件(image - pro Plus software 7.0, Media Cybernetics Inc.， Bethesda, USA)。

免疫组化研究中，PM切片与以下特异性抗体孵育:抗cd68克隆ED1 (serum tec, Oxford, UK)，以检测巨噬细胞;抗cd3 (Abcam, Cambridge, MA, USA)，用于检测t细胞;和反α-SMA (Sigma，美国)，用于检测肌成纤维细胞。反应采用lsabap体系(Dako，美国)，用耐晒红染料(Sigma，美国)揭示。定量分析腹膜中ED1和抗cd3阳性细胞，采用盲法，在200倍镜下定量分析，表达为细胞/mm²。的α使用Image-Pro Plus 7.0软件(Media Cybernetics, Inc.， Bethesda, USA)计算相对于整个腹膜区域的-SMA染色面积(%)。

2.5。PM样本中纤维化生物标志物的基因表达

采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析部分主要纤维相关因子的基因表达，如III型胶原、TGF-β,纤连蛋白。为此，我们从PM冷冻样本中获取总RNA，并严格按照制造商的说明使用商业试剂盒(美国Promega)在cDNA上进行转换。qPCR使用StepOnePlus Real-Time PCR系统(Thermo Fisher, USA)进行，循环程序如下:95℃10 min, 95℃变性15 s, 60℃复合退火20 s, 72℃延长10 s，共40个循环。

2.6。促炎细胞因子的基因和蛋白表达

IL-1等细胞因子的基因表达β肿瘤坏死因子-α，采用RT-qPCR方法评估IL-6。此外，这些炎症介质的蛋白浓度在PM样品中通过多重细胞因子分析进行评估，使用商用试剂盒(MILLIPLEX-EMD Millipore, Billerica, EUA)，并按照制造商的说明进行评估。在Bio-Plex悬浮基质系统上进行分析，使用Bio-Plex管理器4.0版本软件(Life Science, Hercules, USA)分析数据。结果以pg/mg蛋白表达。

2.7。统计分析

数据以 ,所有统计分析均使用GraphPad Prism软件5.0 (GraphPad, San Diego, USA)进行。根据Newman-Keuls公式对不同实验组进行单因素方差分析和两两比较，而不进行配对试验被用于比较每个实验组的不同的时间点。值等于或小于0.05为显著性。

3.结果

3.1。ASC输液改善身体消瘦和CKD + PF大鼠反转高血压

在试验开始、CKD或/和PF诱导前，研究中使用的所有动物的体重、收缩压和血清尿素浓度都相似。正如预期的那样，对照组和PF组在整个研究过程中都表现出了正的体重增加。此外，这些动物直到随访30天才出现高血压或尿素潴留。另一方面，CKD模型的动物(是否联合PF)在分析期间体重明显下降，并伴有高血压和尿毒症。如表所示1和补充图3.在CKD+PF+ASC组动物中，ASC治疗可以防止体重在第15天到30天之间的减轻，并逆转高血压。

3.2。ASC治疗防治PF的发展在提交给CKD + PF大鼠

PF在不同群体的动物建立由马松染色PM样品的组织学分析评估。每个实验组的说明性显微照片显示出严重的PM增厚和同时在PF和CKD + PF组胶原积累（图图2（a）)。对这些组织学发现的量化表明，PF和CKD+PF动物表现出比对照组或CKD大鼠大三倍的PM ( ）如图所示2 (b)。在CKD+PF+ASC动物中，ASC处理显著抑制了PF的发展，其PM厚度与对照组或CKD组相似。

3.3。ASC输注可通过减少CKD+PF大鼠腹膜肌成纤维细胞的数量和调节ECM合成相关基因的表达来预防PF

免疫组化检测α-SMA是肌成纤维细胞的生物标志物，它是一种ECM产生细胞，与纤维形成密切相关。我们在每个实验组动物的PM样本中进行了实验。如图所示3(一个)和补充图4，基于腺嘌呤超载提交CKD模型的动物在数量上呈现出百分比的增加α-SMA在PM中，与控制组相比。与我们之前的组织学发现相一致的是，接受PF实验模型的组(PF和CKD+PF)均表现出大量的腹膜αsma积累。值得注意的是，ASC治疗明显地防止了of的升高α-SMA百分比在CKD + PF + ASC动物。

通过对PM样本的RT-qPCR分析来评估一些主要促纤维化基因的表达，也得到了类似的结果。CKD+PF联合实验模型未处理动物PM标本中TGF-明显过表达β、III型胶原和纤连蛋白，与对照组比较。如图所示3 (b)- - - - - -3（d）。ASC治疗可显著降低TGF-过表达β与III型胶原和规格化纤维连接蛋白的表达。

3.4。给予ASC可减轻腹膜炎症

为了评估局部白细胞招募情况，采用免疫组织化学方法评估腹腔巨噬细胞(ED1+细胞)和t细胞(CD3+细胞)浸润情况。说明性的缩微照片用图表表示4(一)和4(b)，并以柱状图表示这些参数的量化4(c)和4(d)。

如图所示4(c) PM样品中检测到的巨噬细胞数量在对照组、CKD组和PF组动物之间没有差异。然而，CKD+PF联合模型促进巨噬细胞对PM的浸润明显增加，与对照组、CKD和PF组相比具有统计学意义( )。ASC灌注完全阻止了CKD+PF+ASC组动物PM巨噬细胞的浸润。

腹膜t细胞和巨噬细胞在对照组、CKD和PF组之间没有差异，而在CKD+PF组中显著增加。巨噬细胞定量数据显示，在CKD+PF+ASC组动物PM标本中，ASC处理显著降低了t细胞的浸润(图)4(d))。

此外，我们分析了以下炎症介质IL-1的基因和蛋白表达β肿瘤坏死因子-α和IL6在各实验组动物的腹膜中，如图所示5。

CKD+PF模型促进IL-1基因和蛋白表达显著增加β，最后一组CKD和PF组也有增加。ASC动物IL-1基因和蛋白表达正常β与对照组相比(图)图5（a）和5 (b))。肿瘤坏死因子-α在提交CDK+PF联合模型的动物PM样本中，TNF-蛋白水平过表达α(经多重分析在PM样本中评估)在CKD、PF和CKD+PF组中显著增加。TNF-基因和蛋白的表达α与ASC（图处理的CKD + PF动物显著降低5 (c)和5 (d))。因此，CKD+PF组小鼠腹腔内IL6基因和蛋白表达明显升高，并经ASC灌注完全正常化(图)5 (e)和5 (f))。

4.讨论

腹膜的长期接触膜逐渐bioincompatible PD的解决方案促进局部炎症、间皮的细胞,增殖myofibroblasts,胶原蛋白沉积,submesothelial增厚,导致PF,超滤能力和丧失,最终失败的透析模式(5,7,13]。在本研究中，静脉给药ASC可以阻止尿毒症大鼠GC诱导的PF的进展。ASC治疗也减少了肌成纤维细胞浸润，并减弱了未治疗动物中上调的促纤维化和促炎基因的表达。这些发现与之前在实验PF模型中研究干细胞抗纤维化作用的报道一致[14,15]。与之前的研究不同的是，在我们的实验中，我们使用了尿毒症动物，ASC通过静脉路径给予。

如前所述，本研究采用的尿毒症CKD与PF相关的联合实验模型更类似于长期PD的终末期肾脏疾病患者的临床和病理生理特征。CKD+PF组除了受到CKD的直接影响，如体重减轻、全身性高血压、BUN增加外，还表现出明显的PM增厚，表现为皮皮下胶原和胶原积累α-SMA伴随腹膜炎症，表现为间皮亚巨噬细胞和t细胞浸润，与只采用PF模型的动物相比，有统计学意义上的升高，且无相关性CKD。与PF组相比，CKD+PF组腹膜局部炎症和纤维化相关基因的过表达明显增加，说明晚期尿毒症加重了这些动物腹膜炎症的发展[10]。

纤维增厚和过表达αα-SMA，肌成纤维细胞的标记，通过在PM GC注射诱导由ASC处理减弱。ASC政府还封锁了纤维化因子的上调，值得注意的是，TGF-ββ纤连蛋白。与我们的研究结果相似，Ueno等人证明，人的MSC可以防止非尿毒症动物中GC诱导的PF。此外，人腹膜间充质细胞与人间充质干细胞共培养可显著降低TGF-β和纤连蛋白mRNA表达水平与车载处理细胞的水平比较[14]。由于TGF-βß信号通路在PF中起关键作用，本研究观察到的ASC抗纤维化作用可能是由TGF-介导的β抑制。

PD患者全身炎症和腹膜液中较高的细胞因子先于PF并包覆腹膜硬化[16]。ASC除抑制抗纤维化通路外，对腹膜也有较强的抗炎作用。在联合模型中，ASC处理的动物不存在白细胞(如巨噬细胞和t细胞)的亚间皮浸润。与我们的研究结果一致的是，Wang等人在急性腹膜粘连大鼠模型中使用骨髓来源的SC，发现腹腔内注射间充质干细胞可以抑制PM和TNF-的白细胞浸润α通过旁分泌机制表达[17]。因此，TNF-的抑制α在我们的研究中，ASC的产生可以解释它的有益作用。

ASC输注也显著降低了腹膜IL-1基因和蛋白的表达β肿瘤坏死因子-α与未处理CKD+PF的大鼠相比，asc处理的CKD+PF动物中IL-6的变化。这些发现证实了先前关于msc诱导的抗炎和免疫调节作用的报道。Aggarwal等人证明，当与间充质干细胞共培养时，纯化的人类免疫细胞亚群的细胞因子分泌谱改变为更抗炎和免疫耐受的表型。根据本研究，在MSC刺激下，树突状细胞TNF-降低α和IL-10的释放，而Th1淋巴细胞降低IFN-γIL-4的表达和增加[18]。

MSC发挥其有益作用的可能机制有很多。MSC迁移到受损组织并分化为修复细胞的能力最初被认为是发生的。然而，已经认识到MSC分泌的旁分泌因子可能是诱导组织保护和恢复的主要机制。Wang等研究表明，在刮痧致腹膜损伤的大鼠的尾静脉静脉注射MSC后，这些细胞在肺、肝和脾脏中积累。尽管骨髓间充质干细胞静脉输注具有保护作用，但腹膜损伤后未见干细胞。这些数据表明，MSC输注的主要生物学效应可能更多地归因于这些细胞释放的抗炎和免疫调节因子，而不是它们本身原位分化(17]。

值得注意的是，我们发现ASC治疗对血压有意想不到的效果。CKD组和CKD+PF组尿毒症大鼠出现高血压，而CKD+PF+ASC组的血压与对照组相似。但在肾血管性高血压的实验模型中，MSC控制了血压并抑制了肾内血管紧张素系统[19]。

5.结论

总之，我们已经证明，在cg诱导的尿毒症大鼠模型中，ASC治疗抑制了PF的进展。ASC抑制PD诱导的腹膜膜修饰的不同重要机制，如TGF-的激活β途径、肌成纤维细胞增殖和炎症。我们的结果是有趣的，并加强了干细胞治疗PF治疗的前景。然而，在这一实验发现转化为临床应用之前，还需要进一步的研究。

数据可用性

在这项研究中产生的或分析所有的数据都包括在此发表的文章和补充信息的文件英寸

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

我们真诚感谢路易莎Justini德弗雷塔斯，阿曼达G.皮雷，菲利普M. O.席尔瓦和席尔瓦Cleonice为他们出色的技术支持。这项工作是由巴西国家局研究与发展（的CNPq）支持不授予。461785 / 2014-5。

补充材料

补充材料图1：通过免疫荧光的间充质干细胞表面标记物的细胞的表征。ASC为阳性CD44，CD90，CD146和CD73阴性和CD19和CD45。补充材料图2：在研究中使用的脂肪来源的间充质细胞（ASC）的表征。Wistar大鼠在的ASC通路P0（A），P4（B），ASC的能力的分析，以分化成脂肪形成（C），软骨形成（d），并且在10倍放大倍率的成骨谱系（E）。补充材料图3：在主底稿文件的表1中所示的数据的代表线图。体重（BW）（A），收缩期血压（BP）（B），和尿素氮的比较分析（BUN）水平（C）所示，在不同的组在01天，15和30补充材料图4：免疫组化显微镜照片说明性用于α不同组腹膜标本的-SMA (x 200)。(补充材料)

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