IL-1增强作用β- 通过COX-2-PGE治疗肠缺血再灌注损伤修复的脂肪染色衍生的MSCs（ADMSC）₂信令

抽象的

脂肪衍生的间充质干细胞（ADMSCs）已被用于治疗组织损伤，并且反应增强其治疗效果。本研究旨在调查IL-1的活化ADMSCs的治疗效果β对小肠缺血-再灌注(IR)损伤的影响，并探讨其可能机制。用IL-1预处理ADMSCsβ在体外，和的ADMSCs的活化是通过评估α.-SMA和COX-2的表达和分泌功能。活化的ADMSCs移植到IR-肠受伤在小鼠模型中，和治疗效果进行评价。此外，发掘潜在的机制，COX-2表达沉默探讨其激活的ADMSCs治疗肠道缺血再灌注损伤的作用。When ADMSCs were pretreated with 50 ng/ml IL-1β24小时，表达α.-SMA和COX-2的上调显著，和PGE的分泌物₂、SDF-1和VEGF升高。当COX-2被沉默时，IL-1的作用β治疗被废除。用IL-1激活ADMSCsβCOX-2沉默可显著抑制炎症和凋亡，促进小鼠肠道IR损伤的愈合。RNA测序结果表明，与IR损伤组相比，激活ADMSCs可诱导mRNA表达的改变，并抑制NF-的激活κ..B-P65、MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT通路的诱导，而沉默COX-2则会削弱激活的ADMSCs对IR损伤诱导的这些通路的抑制作用。这些数据提示IL-1β预处理增强对肠道IR损伤的ADMSCs通过激活ADMSC COX-2-PGE修复的治疗效果₂信号轴和通过抑制NF-κ..B-P65、MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT通路在肠道ir损伤组织中的作用。

1.介绍

肠道缺血和再灌注（IR）是一个常见的临床问题，仍然是危重病患者中死亡的主要原因之一。肠红外损伤是各种疾病的病理过程，如优越的肠系膜动脉（SMA）栓塞，肠移植，辐射肠病和败血症[1-3.］.有报道称，肠道IR过程中黏膜屏障损伤明显，导致肠道功能障碍，如细菌移位、营养吸收减少等。最重要的是，肠道IR导致多种促炎细胞因子的释放[4]，导致多个器官衰竭及死亡[5］.因此，改善肠红外损伤和增强红外损伤的修复对于减少危重疾病患者的死亡率至关重要。

脂肪源性间充质干细胞(ADMSCs)可分化为多种基质系，包括心肌细胞、骨和肌肉细胞[6］.ADMSCs是一种很有前景的治疗多种炎症和自身免疫性疾病的途径，包括心力衰竭、脊髓损伤、败血症和肠道IR损伤[7-11.］.一方面，ADMSC可以分化为骨细胞以修复骨折[12.];在另一方面，的ADMSCs分泌许多细胞因子以增强组织再生，抑制炎症反应，和减轻脓毒病和器官损伤的严重程度[7那13.］.我们前期的研究证实ADMSCs通过促进组织再生和抑制炎症，可以促进胃穿孔愈合[14.］.这些证据表明，ADMSCs有可能治疗以过度细胞凋亡和炎症为特征的肠道IR损伤。

值得注意的是，据报道，白细胞介素-1β(il - 1β）预处理可以增强ADMSCS治疗组织损伤的免疫调节作用，其特征在于主要炎症反应[15.-18.］.先前的研究证实，IL-1β显著增强MSC的效力减弱的发展和诱发的结肠炎葡聚糖钠sulphate-（DSS-）的严重程度，并且这些效应部分地由增加的免疫介导的能力和增强的迁移能力[15.］.luo等人。报道了IL-1的是预处理β和转化生长因子 -β(TGF -β)诱导MSCs中P38 MAPK和SMAD3活化，显著改善血管内皮生长因子(VEGF)的分泌，减轻急性缺血引起的心肌损伤[16.］.这些研究结果表明，炎症因素的预处理，如IL-1β，可能是提高ADMSCs治疗肠IR损伤疗效的有效途径。

在本研究中，我们证明了IL-1β预处理激活的ADMSS，由增强的ADSCs副静脉函数和Cox-2-PGE的激活反映₂信号轴。il - 1β- 通过减少细胞凋亡和抑制炎症，激活的ADMSCs显着提高了小鼠模型中肠红外损伤的修复效果。关于机制，活化ADMSCs调节与“嗜中性粒细胞趋化性”相关的许多基因的表达，“炎症反应”，“炎症反应”，“趋于”和“趋化性”和“防御反应”并抑制NF-的激活κ..B-P65、MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT通路在ir损伤的肠道中的作用。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

人类ACMSCS购自Cyagen Biosciences（Soochow）。根据先前报告的议定书，从C57BL / 6小鼠中获得，培养和扩增，从C57BL / 6小鼠中获得并扩增。19.］.将细胞维持在补充有10％胎牛血清，100个单位/ ml青霉素和100mg / ml链霉菌素的DMEM（Gibco，USA）中。从小鼠分离的ADMSCS用于2-10代以进行后续实验。所有动物实验程序都被安徽医科大学实验室伦理委员会批准（LLSC20150028）。

２.２.流式细胞术与分化

利用流式细胞术鉴定ADMSC表型，并根据之前报道的方案鉴定细胞表面标志物CD29 (ab21845)、CD90 (ab124527)和CD45 (ab197730) [14.］.根据说明书，使用分化试剂盒(Invitrogen, Life Technologies)在ADMSCs中诱导成脂和成骨分化。

２.３.稳定细胞的建立

慢病毒短发夹RNA COX-2载体(shCOX-2)和对照载体(shNC)设计并购自中国苏州GenePharma公司。为了产生慢病毒，shRNA载体与包膜(VSVG)和包装(Delta 8.9)质粒共转染到HEK293T细胞中，如前面所述[20.］.ADMSC在8的存在下感染 μ.G / ml含丙烯。感染48小时后，用2.0选择细胞 μ.g / ml嘌呤霉素(σ)。real-time PCR和western blot分析证实了敲除效果。

２.４.细胞治疗

培养至80%汇合后，用IL-1预处理ADMSC、ADMSCs/shNC或ADMSCs/COX-2细胞β(SRP3083, Sigma)在指示的浓度和时间点。探讨COX-2-PGE的作用₂信号轴，ADMSCS用IL-1预处理β, 50μ.M NS398（COX-2特异性抑制剂，S8433，SELLECK），5 μ.中号PGE₂（P0409，SIGMA）或这些因素的组合，如所示。

2.5。细胞增殖

总共 ADMSC细胞用或不用IL-1处理的β，并用CCK8试剂盒检测细胞增殖情况。

2.6。移民

采用0.8μ.m Transwell系统。简而言之，总共 含或不含IL-1的ADMSC细胞βwere seeded into the upper chamber and cultured for 24 hrs; migrated cells were stained with crystal violet.

2.7。免疫印迹分析

使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）的ripa缓冲液从细胞或肠组织中提取总蛋白质。等量的总蛋白质（20 μ.g)通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上。用5%脱脂乳孵育30分钟后，用以下一抗在4°C孵育24小时:anti-p25(18742-1-AP, Proteintech Group)， anti-P65 (#3033, Cell Signaling Technology, USA)， anti-P65 (#8242, Cell Signaling Technology, USA)， anti-phospho-ERK1/2 (#4370, Cell Signaling Technology, USA)， anti-ERK1/2 (#4695, Cell Signaling Technology, USA)，anti-phospho-AKT (#9275, Cell Signaling Technology，美国)和anti-AKT (#9272, Cell Signaling Technology，美国)。用这些膜孵育β-Actin抗体（＃5125，细胞信号传导技术，USA）作为内部控制，并且使用ECL套件可视化蛋白质带。

2.8。免疫荧光染色

根据使用下列一抗先前公开的方案进行免疫荧光染色：抗COX-2（ab15191，Abcam公司）和抗α.sma (ab5694 Abcam)。

2.9。ELISA试验

PGE的浓度₂（ab133021，Abcam公司），SDF-1（ab100637，Abcam公司），VEGF（ab100663，Abcam公司），IL-10（ab100549，Abcam公司），和TGF-β根据制造商的协议使用商业ELISA试剂盒测量培养基中的1（AB100647，ABCAM）。

2.10。总RNA提取和实时RT-PCR

使用总RNA纯化试剂盒(QIAGEN)，按照制造商的方案从小鼠肠道组织中分离总RNA。采用cDNA合成试剂盒(Takara, Japan)逆转录合成cDNA。采用PrimeScript®RT试剂试剂盒(Takara，日本)，在Applied Biosystems公司7500 Real-time PCR系统上进行实时聚合酶链反应(PCR)。数据用2-^ΔδCt方法，和β-Actin被用作内部控制。用于实时RT-PCR的引物列于补充表中1。

2.11。动物模型

这项研究是根据安徽医科大学实验动物的护理和使用的指导方针进行。肠IR损伤模型，根据修改方案产生[4］.简单地说，实验前，体重在20 - 25 g之间的C57BL/6小鼠被自由取水禁食12小时。麻醉方式为腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(100μ.L在每只鼠标上)。皮肤用1%碘伏消毒后，作腹部垂直切口。对SMA进行鉴定并剪切1小时。在释放钳夹后，细胞(ADMSCs, IL-1β- 预期的ADMSCS，IL-1β-预处理ADMSCs/shNC，或IL-1β-预处理ADMSCs/shCOX-2μ.磷酸盐缓冲盐水（PBS）的升在10个不同位点被局部注射到缺血肠段的粘膜下层。在假手术组，小鼠进行剖腹术无肠IR损伤和IR组中，600 μ.l的PBS代替细胞局部注射。

进行了两组动物实验。首先，探究IL-1是否存在β- 预期的ADMSCs加速肠红外损伤愈合，使用了以下四组C57BL / 6小鼠：（1）假组，（2）IR组，（3）ADMSC组，其中IR治疗的小鼠得到了总共的 ADMSCs， (4) IL-1β-预处理ADMSC组，接受ir处理小鼠 il - 1β-预处理的ADMSCs (50 ng/ml IL-1刺激ADMSCs)β移植前24小时）。其次，探索COX-2是否在IL-1的影响中发挥着关键作用β-预处理的ADMSCs治疗肠道IR损伤，采用以下两组小鼠:(5)IL-1β-预处理ADMSC/shNC组，其中 il - 1β使用-预处理的ADMSCs/shNC， (6) IL-1β-pretreated admscs / shcox-2组 il - 1β- 使用 - 预期的ACMSCS / SHCOX-2。关闭腹壁，使小鼠用标准护理和监测恢复。每组使用六只小鼠。

小鼠在手术后2天人道地杀死，分散肠道段并储存在4％多聚甲醛中，分别用于组织学分析和-80℃，分别用于蛋白质印迹分析和RNA提取。

2.12。组织学分析

石蜡包埋的肠组织切成4块μ.m厚片苏木精和伊红染色。每个样本中随机选择5个区域进行病理分析，由两名对治疗方法不知情的独立病理学家进行分析。Chiu等报道的组织学量表用于评估肠道IR损伤的严重程度[21.］.

2.13。髓过氧化酶(MPO)活动

根据制造商的说明，使用髓过氧化物酶活性测定试剂盒(ab105136, Abcam)测定MPO活性。

2.14。凋亡

采用TUNEL检测试剂盒(ab66110, Abcam)根据制造商的方案检测凋亡细胞。每个样本中随机选择5个字段(200×规格)，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)进行量化。

2.15。信使rna序列

简而言之，从IL-1中提取总RNAβ-预处理ADMSCs和IR组( 根据制造商的协议，使用TRIzol试剂(Invitrogen, CA, USA)。使用Bioanalyzer 2100和RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA)分析总RNA的数量和纯度 那分别。大约10μ.g总RNA用于分离poly (A)-mRNA与poly- t寡聚附着磁珠(Invitrogen，美国)。纯化后，在高温下将mRNA片段成小块。然后，按照mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina, San Diego, USA)的协议，对剪切的RNA片段进行逆转录，创建最终的cDNA文库。然后，我们根据供应商推荐的方案，在Illumina Hiseq (4000lc Sciences, USA)上进行了配对端测序。每个样本中获得的映射读取都是使用StringTie组装的。然后，将从样本中获得的所有转录组合并，使用Perl脚本重建一个全面的转录组。最终的转录组生成后，使用StringTie和Ballgown评估所有转录本的表达水平。使用StringTie通过计算外显子模型每千碱基每百万映射reads (FPKM)的片段来确定mrna的表达水平。选择差异表达的mrna为 或者和一个值<0.05在Ballgown R包装中。MRNA表达测序和数据处理由Chance，China，中国杭州川川生物科技进行。

2.16。GO富集和KEGG通路分析

基因富集本体(GO)分析(http://www.geneontology.org)，探讨两组差异表达mrna的功能，将不同功能分为生物过程、细胞成分和分子功能三类。一个值< 0.05表示去调控表达基因中GO term显著富集。

途径分析集中于差异表达的MRNA在“生物过程”类别的去分析中，并根据基因和基因组的京都百科全书进行（Kegg，https://www.genome.jp/kegg)．这是因为在“生物过程”类别解除管制的mRNA是IR损伤的治疗更重要的与IL-1β进行预处理ADMSCs。一个值<0.05建议用于与IL-1处理的肠IR损伤的途径的作用显著β进行预处理ADMSCs。

2.17。统计分析

所有数据都呈现为 （SD），每个实验至少重复三次。学生们两组比较采用单因素方差分析Bonferroni检验，多组比较采用单因素方差分析Bonferroni检验。所有的统计检验都有两尾 显示统计学意义。所有的统计分析使用IBM SPSS v. 22进行。

3.结果

3.1。分化和的ADMSCs的特点

ADMSCS纺锤形成形并诱导分化成脂肪细胞和成骨细胞（补充图。得了)．此外，流式细胞分析显示，ADMSCs表达高水平的CD29和CD90，低水平的CD45，这与我们之前的研究一致(补充图)。1 d-f)．

3.2。il - 1β通过Cox-2-PGE激活ACMSCS₂信令

表达水平α.不同浓度的IL-1处理人ADMSC后，激活ADMSC的生物标志物-SMA和COX-2表达上调β(0、20、50或100 ng/ml)持续12小时。重要的是，50 ng/ml IL-1β最多诱导COX-2表达，因此选择该浓度用于进一步实验（图1（a）)．然后用50ng / ml IL-1处理人类ACMSCsβ不同时间(0、6、12、24小时)，表达水平α.-sma和Cox-2以时间依赖的方式上调（图1 (b)）;免疫荧光染色证实了这一点α.IL-1浓度为50 ng/ml时-SMA和COX-2表达增加β治疗24小时(图1 (c)和1 (d))．IL-1的作用β在小鼠的ADMSCs（补充图进一步证实。2 a - b)．另外，为了证明IL-1β治疗增强ADMSC秘书功能，PGE的因素₂，SDF-1，VEGF，IL-10和TGF-β1测量。更多的铂族元素₂那SDF-1, and VEGF were secreted from ADMSCs treated with 50 ng/ml IL-1β24小时（数字1 (e)-1 (g)和补充图。3模拟)．有报道称炎症是ADMSCs细胞衰老和衰老的决定性原因，衰老的ADMSCs还分泌一种称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)的蛋白，实现免疫调节、促进组织发育等多种功能[22.那23.］.我们发现IL-1β活化的ADMSCs比较的ADMSCs时显示出降低的增殖和迁移。此外，P21和P25，参与细胞衰老生物标志物，在IL-1被上调β-Activated ADMSCS（补充图。3E-G.)．总的来说，这些结果提示IL-1β预处理可以诱导SASP并有效地在体外激活ADMSCS。

３．３．抑制COX-2表达可抑制IL-1的作用β在ADMSC激活

在单独应用shCOX-2或NS-398 (COX-2特异性抑制剂)的ADMSCs中或随后使用IL-1刺激的细胞中，COX-2的表达被特异性抑制β(图2(一个)，补充4得了)．Cox-2沉默减少了α.sma表达(图2 (b))， PGE分泌减少₂，使用IL-1处理的ADMSC中的SDF-1和VEGFβ(数据2 (c)-2 (e)，补充3d)．有趣的是,外生铂族元素₂当IL-1出现时，SDF-1和VEGF的分泌得到改善β- 用NS398治疗 - 预期的ADMSCS（图2 (d)和2 (e))．这些发现表明，IL-1β诱导ADMSC活化依赖于COX-2-PGE₂信号在体外。

3.4。激活的ADMSS通过COX-2-PGE增强肠红外损伤的愈合₂在体内信号传导

采用ADMSCs或IL-1激活的ADMSCs构建小鼠肠道IR损伤模型β预处理局部注射。组织学检查显示，IR组肠道绒毛被破坏，固有层可见大量炎症细胞。ADMSC组肠道损伤较小，绒毛破坏轻微，炎症细胞浸润程度较低。有趣的是，激活的ADMSCs进一步增强了肠IR损伤后的损伤修复。当COX-2表达被沉默时，激活的ADMSCs的作用被削弱(图)3(一个))．邱的分数被用来评估IR损伤，如图3 (b)和3 (c)。

3．5．细胞凋亡和炎症

与IR组相比，ADMSC治疗降低了上皮细胞的凋亡，IL-1增强了ADSCs的治疗效果β激活。当被沉默COX-2的表达，活化的ADMSCs的效果受到损害（图4(一)和4 (b))．

检测MPO活性以评估各组中性粒细胞浸润情况。结果显示，与ADMSC和IR组相比，激活的ADMSCs的肠道炎症水平最低，抑制COX-2表达削弱了激活的ADMSCs缓解肠道炎症的能力(图)4 (c)和4 (d))．炎症因子IL-6和TNF-的表达α.和预期的一样，活化ADMSC组的IL-6和TNF-α.(数据5(一个)和5（b）)和COX-2抑制消除的影响(图5（c）和5（d）)．这些数据表明，与IL-1激活β改善ADMSCs对肠红外损伤的治疗效果，COX-2发挥了激活ACMSCs治疗IR损伤的关键作用。

3.6。mrna的差异表达

通过mRNA测序研究IR组与活化ADMSC组肠道mRNA表达差异。与IR组相比，活化ADMSC组共有907个mrna表达下调(407个上调，500个下调)(图)6（a）)．层次聚类显示活化ADMSC组与IR组间前100个未调控mrna(图)6（b）)．

为了验证mRNA测序的结果，我们选择了2个凋亡相关的(Apaf1和S100a9)和5个免疫应答相关的(CXCL11、CXCL2、Tnfrsf22、CXCR2和CXCR4) mRNA进行实时RT-PCR检测。结果显示，激活ADMSC组中7种mRNA的表达水平均低于IR组，这与mRNA测序结果一致(图)6（c）和6（d）)．

3.7。GO生物功能富集分析

通过氧化石墨烯富集分析，探讨活化的ADMSCs促进肠道IR损伤愈合的机制。差异表达的mrna被分为“生物过程”、“细胞成分”或“分子功能”(图)7（a）)，而未调控的mrna参与了多种生物学功能，如“中性粒细胞趋化”、“炎症反应”、“趋化”和“防御反应”(图)7（b）），所有这些都与肠红外损伤中的修复过程密切相关。

3.8。KEGG途径分析

因为“生物过程”（包括“炎症反应”，“中性粒细胞趋化”和“趋​​化性”）与用活化ADMSC处理的IR损伤的愈合过程密切相关，基于涉及“生物学的令人讨要的MRNA进行Kegg途径分析。进程进入富集分析“。上调总共253mRNA，而263 mRNA被下调，并且Kegg途径分析表明，这些MRNA参与了几种信号途径，包括“TNF信令通路”，“MAPK信号通路”，“PI3K-AKT信号通路”。，和“nf-κ..B信号通路”(图7（c）)．如Western印迹分析所证明的，IR组的磷酸-P65，磷酸-ERK和磷酸-AKT的表达水平明显高于假手术组，并且在激活的ADMSC组中显着降低（图7（d）)．

3.9。抑制活化的ADMSCs中COX-2表达对凋亡-免疫相关基因表达及信号通路的影响

如图所示6（c）和6（d）七点的mRNA（细胞凋亡相关的基因：APAF1和S100A9;免疫相关基因：CXCL11，CXCL2，Tnfrsf22，CXCR2和CXCR4）在活化ADMSC组中比在IR组低水平表达。考虑到COX-2是用于激活的ADMSCs的生物学功能的关键，这是值得调查这些mRNA的表达时，COX-2被沉默。如所预期的，这些mRNA物在与IR组相比活化ADMSC组显著较低水平表达;然而，当被抑制COX-2的表达，活化的ADMSCs的效果受到损害（图7 (f)和7 (g))．

如上所示，激活的ADMSCs压抑的NF-κ..B-P65，MAPK-ERK1 / 2，和PI3K-AKT途径在IR-受伤肠。然后，我们进一步评估COX-2抑制对这些信号通路的影响。所证实通过Western印迹，的P65，ERK1 / 2和AKT磷酸化水平在活化的ADMSCs显著低于IR组中，和COX-2沉默取消了在肠IR-受伤这些途径活化的ADMSCs的效果组织（图7 (e))．

4。讨论

由于它们在许多严重疾病（如肠红外损伤）中的治疗效果，MSCs受到了不断的关注，这是无法有效治疗的。由于其简单的可用性，脂肪组织被认为是MSCs的重要来源，骨髓也是如此。许多研究强调了MSCs在炎症环境中激活MSC的重要性，以治疗器官损伤[18.那24.-26.］.gonzalez-rey等。报道，由于没有炎性细胞因子释放，在DSS结肠炎中未观察到MSCs的保护作用，这是提出诱导MSC活化的诱发MSC激活，当模型诱导之前将MSCS注入正常肠道时[27.］.然而，当将细胞施入炎性肠细胞时，MSCs增强了DSS诱导的结肠炎的愈合[27.那28.］.另一项研究报告了类似的结果，即IFN-γ.-激活的MSCs而非非激活的MSCs对dss诱导的结肠炎有效[29.］.这些数据表明炎症因子在体内或体外激活MSCs是非常重要的。在本研究中，我们评估了IL-1的作用β对体外ADMSC活化及IL-1治疗效果的影响β-激活的ADMSCs对体内肠IR损伤的影响。此外，我们还关注COX-2-PGE的作用₂IL-1的信号轴β- 由于Cox-2-PGE，所强化的ADMSC激活₂通过对巨噬细胞和T细胞施加显着的免疫调节作用，信号传导可以有效地将炎症环境转化为抗炎状态[30.那31.，这一过程对肠道IR损伤的愈合至关重要。我们的研究结果表明COX-2-PGE₂信令对于IL-1至关重要β要激活的ADMSCs。当COX-2的表达被抑制，IL-1的效果β上ADMSC激活被废除，和活化的ADMSCs的治疗效果在肠IR损伤（受损图8)．

我们的研究中提出了一些重要的发现。首先，我们证明了IL-1的潜在机制β激活ADMSCS，在以前的研究中尚未完全调查。我们的结果表明，通过激活Cox-2-PGE₂信令，IL-1β显著诱导ADMSCs分泌一定量的PGE₂， VEGF和SDF-1。然而，抑制COX-2的表达消除了IL-1的作用β外源PGE可挽救ADMSC的活化₂治疗。这一机制也被报道用于其他炎症因子，包括TNF-α.和interleukin-17A24.那26.，提示COX-2-PGE₂信号为IL-1关键β诱导激活ADMSC。

我们研究的第二重要发现是，我们评估了ADMSS（包括ADMSCS，活化ADMSCS和活化ADMSCS / SHCOX-2）对小鼠肠红外损伤的愈合的治疗效果。到目前为止，没有研究评估活化ADMSC与IL-1的治疗效果β修复肠道缺血再灌注损伤，与机制都没有完全理解。在本研究中，活化的ADMSCs是最有效的，用于治疗IR损伤的，通过IR损伤的最低严重性和细胞凋亡和炎症的最低水平反射，而活化的ADMSCs / shCOX-2中显示的最坏功效。李等人。报告说的MSC显著保护，以防止肝IR损伤的大鼠和用肝酶的血清水平降低相关联的和降低的中性粒细胞浸润和凋亡相关基因的表达[32.］.另一项研究报告说，TNF-的预处理α., il - 1β，一氧化氮增强了MSCs旁分泌功能，预处理MSCs获得的条件培养基降低了辐射诱导的肠道损伤的炎症反应，增强了上皮细胞增殖[33.］.Bai等人进行的一项研究。进一步证明IL-17A-预处理的MSCS改善IR诱导的急性肾损伤，减少肾炎，并增加肾脏中的Tregs的百分比，同时使用Celecoxib阻断Cox-2逆转IL-17A-Premroped MSC的益处，为COX-2表示关键作用[24.］.通过下调IL-6和TNF-的表达，我们发现活化的ADMSCs显著降低MPO活性、炎症和上皮细胞凋亡α.及肠内TUNEL染色。正如预期的那样，当COX-2表达被抑制时，活化的ADMSCs的益处被削弱。总的来说，我们的结果，以及之前的研究，表明IL-1预处理β通过激活细胞COX-2-PGE，增强了MSCs的治疗效果不仅肠IR损伤，而且在其他急性器官损伤中₂信号。

我们研究的第三个重要的观察是，我们用基因测序，以探索通过激活的ADMSCs可能会增强小鼠模型肠缺血再灌注损伤愈合的潜在机制。在这项研究中，我们发现，该基因的表达谱与激活的ADMSCs和IR组治疗组之间完全不同。差异表达的mRNA的GO分析表明，落入中性粒细胞趋，炎症反应，和趋化因子活性的类别的过程参与肠IR损伤的与活化的ADMSCs处理的组中的愈合。中性粒细胞募集的抑制已被证明是一种重要的方式为MSCs向肝改善IR损伤[32.]，而抑制炎症反应已被证明对MSCs治疗脓毒症诱导的器官损伤的能力至关重要[7，与我们的发现一致。此外，KEGG通路分析表明，包括NF-在内的一些通路κ..B-P65通路、MAPK-ERK通路、PI3K-AKT通路、PPAR通路可能参与活化ADMSCs修复肠道IR损伤。Western blot分析进一步证实了肠内ir诱导的NF-激活κ..B、MAPK-ERK和PI3K-AKT通路，而活化ADMSC处理显著抑制了这些通路的激活。Li等报道MSCs通过抑制脂多糖诱导的TLR2和TLR4表达上调和抑制NF-来改善急性肺损伤κ..B-P65磷酸化和炎症反应[34.］.此外，下调MAPK-ERK1 / 2磷酸化是诱导巨噬细胞抗炎活性的证明机制[35.]，这在IR损伤和败血症的愈合中起重要作用[36.-38.］.最后,抑制COX-2-PGE₂在激活的ADMSCs中，信号通路消除了它们的作用，包括抑制NF-的激活κ..小肠IR损伤对B-P65、MAPK-ERK1/2、PI3K-AKT通路的影响。

有这种研究，应该承认一些限制。首先，我们假设IL-1β通过旁阳碱活性增强ACMSCs的治疗效果，而不是通过影响分化。因此，我们没有检测移植ADMSCs的细胞命名，因为之前的研究报告说明ADMSCS有效地分化成间充质谱系而不是上皮细胞[39.那40］.其次，尽管活化ADMSCs与IL-1的治疗效果β已经在小鼠模型中得到证实，但在这种治疗可以临床应用之前，仍有一些问题需要解决，包括移植的ADMSCs的植入不良和潜在的肿瘤发生[41.]应在未来的研究中完全评估这些问题。

5.结论

总之，在这个研究中提出的结果表明，IL-1β通过COX-2-PGE激活ADMSCS₂并通过抑制炎症和凋亡增强ADMSCs对肠道IR损伤的治疗作用。此外，我们发现激活的ADMSCs与IL-1治疗β导致肠IR损伤中mRNA表达的深刻改变，并揭示了一些生物学过程，包括中性粒细胞趋化、炎症反应和趋化因子活性的参与。NF -κ..通过在肠红外损伤组织中的活化ADMSC治疗抑制了IR损伤激活的B-P65，MAPK-ERK1 / 2和PI3K-AKT途径。当Cox-2-PGE₂ADMSCs信号传导受到抑制，激活的ADMSCs治疗效果受损(图)8)．进一步的工作应专注于ACMSCS和探索给药，时序和合适的递送方法在肠红外损伤中的临床应用。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

致谢

该项目由中国国家自然科学基金（81501601）和中国安徽省自然科学基金（1608085QH198）资助。

补充材料

补充图1：人的ADMSCs的鉴定。（A）的ADMSCs显示纺锤状。（B，C）的ADMSCs可以被诱导分化成脂肪细胞和成骨细胞。（d-F）流式细胞术显示高表达的CD29和CD90的是的ADMSCs，而低表达CD45。补充图2：IL-1βCOX-2和α.-sma以剂量和时间依赖的方式（a，b）。补充图3：（a，b）IL-1β以剂量和时间依赖性的方式刺激ADMSCs的PGE2分泌。(C, D) 50 ng/ml IL-1预处理β没有诱导IL-10和TGF的差异分泌 -β1在ADMSCS（NS没有统计学意义，学生的测试）。补充图4：（A，B）蛋白质印迹和实时RT-PCR来评估在的ADMSCs COX-2表达的沉默shRNA的慢病毒的效果。COX-2使用NS298（COX-2抑制剂）的（C，d）抑制抑制IL-1βCOX-2诱导的表达和α.在ADMSCs sma。补充表1:real-time RT-PCR引物序列(5 -> 3. )．（补充材料）

参考文献

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