MSCs有助于Ly6C的转化^高的单核细胞进入Ly6C^低AMI下的子集

抽象

背景. Ly6C^高的单核细胞是堆积在梗死心肌中的炎性细胞，以及Ly6C^低单核细胞被认为具有修复性和抑制心肌重构的作用。NR4A1是在动脉粥样硬化发生过程中调节单核细胞炎症表型的新靶点。目标。我们的目的是调查是否间充质干可以促进的Ly6C的异质性^高的单核细胞分化为Ly6C^低这种调节是否与核受体NR4A1有关。方法. Ly6C^高/低单核细胞首次与间充质干细胞共培养。C57BL / 6^CX3CR1型-/-用小鼠和C57BL/6野生型小鼠建立AMI模型，并进一步比较两组的生存功能。Ly6C^高/低C57BL/6在循环和MI组织中的单核细胞^CX3CR1型-/-在第1天和第3天用流式细胞术检测是否有MSC移植的AMI小鼠。Western blot检测NR4A1的表达。TUNEL试剂盒检测第3天和第7天梗死边缘区心肌细胞凋亡情况。CD31免疫组化检测心肌梗死第7天和第21天心肌血管生成情况。结果。我们首先证明了的Ly6C的百分比^低单核细胞与MSCs共培养3d后，单核细胞明显增多( vs。 ， )。NR4A1在的Ly6C表达^高/低单核细胞也显著当时升高（ vs。 ， )。继AMI，循环的Ly6C的百分比^低单核细胞C57BL / 6^CX3CR1型-/-小鼠比在C57BL / 6野生型小鼠中显著降低（ vs。 ， )。C57BL存活率为6^CX3CR1型-/-小鼠（25％）比被显著降低该C57BL / 6野生型小鼠（56.3％）的后AMI（ ， )。骨髓间充质干细胞移植后，我们观察到Ly6C显著增加^低在循环中的单核细胞( vs。 ， ）在我的心里( vs。 ， ）C57BL / 6^CX3CR1型-/-老鼠。Western blot分析进一步显示C57BL/6心肌细胞NR4A1的表达水平^CX3CR1型-/-间充质干细胞移植( vs。 ， )。我们还发现TUNEL显著降低⁺心脏细胞( vs。 ， ）与相比，具有低表达水平的小鼠NR4A1的高表达水平的小鼠。同时，我们还确定了小鼠与NR4A1的高表达水平的梗塞区毛细血管密度增加（ vs。 ， ）相比于用AMI后21天表达水平低的小鼠。结论。MSCs可以控制Ly6C的异质性^高的单核细胞分化为Ly6C^低单核细胞和AMI后进一步减轻炎症。其机制可能是，干细胞有助于NR4A1中的Ly6C表达增加^高/低单核细胞。

1.简介

抑制AMI后心肌重构仍是一个重大挑战[1，2]。干细胞移植到AMI后受伤的心脏仍然被认为可以减少初始损伤，促进心脏再生潜能的激活，更好地将再生组织整合到器官中。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)因其独特的免疫调节和旁分泌功能特性，长期以来被用作AMI术后移植的最佳干细胞[3-五]。间充质干细胞（MSC）表现出与各种免疫细胞，包括单核细胞和巨噬细胞，其被认为能调节组织修复过程中的免疫微和用于组织再生提供了良好的“土壤”复杂的相互作用。间充质干采用特定表型抑制或促进，这取决于它们所在的炎症微环境的免疫反应。对MSCs的免疫调节能力，目前的研究主要集中在MSC和炎症性单核细胞之间的相互作用6，7]。我们之前的研究已经证明了Ly6C的低部署^高的AMI后的单核细胞可以提高MSC移植的和选择性改善心肌重塑的有效性[8]。

对Ly6C生理病理分布的最新认识^高/低急性心肌梗死后的单核细胞为炎症治疗提供了基础[9，10]。致炎的Ly6C^高的单核细胞在急性心肌梗死后的最初几天占优势，促进梗死组织和坏死碎片的消化，而修复性Ly6C^低单核细胞在接下来几天的炎症消退过程中占主导地位，被认为具有动脉粥样硬化保护作用[11]。近年来，间充质干细胞对单核细胞的作用越来越明显。然而，MSCs是否能从炎性Ly6C重新编程单核细胞^高的抗炎Ly6C的表型^低表现型尚未确定。组织内的间充质干细胞是否能诱导单核细胞迁移并将其转化为调节表型也存在争议。

虽然MSC已被发现，以促进修复，修复的机制尚未清楚的解释。在应对心脏损伤理解免疫炎症最新进展推动的急性心肌梗死的有效治疗方法的探索。相比于C57BL / 6小鼠，C57BL / 6^CX3CR1型-/-我们在实验中引入了小白鼠。C57BL / 6^CX3CR1型-/-小鼠缺乏CX3CR1 [临界基因12，13]主要带动了Ly6C的就业^低单核细胞在脾和骨髓循环和梗塞心肌中AMI时。其结果是，使用C57BL / 6^CX3CR1型-/-小鼠的Ly6C的相对低的电平^低单核细胞，我们可以有效地测试Ly6C的模式^高的单核细胞转化为Ly6C^低单核细胞是否有间充质干细胞。同时，NR4A1被认为是Ly6C的关键监管者^低单核细胞。因此，我们研究的主要目的是探讨MSCs的免疫调节功能是否与Ly6C的异质性相关^高的单核细胞分化为Ly6C^低单核细胞及其核受体NR4A1在这一过程中的作用。

2.材料和方法

2.1。MSC准备和标签

小鼠衍生的MSC（来自C57BL / 6野生型小鼠）中制备如先前所描述[14]。首先用PBS (HyClone)冲洗6周龄小鼠股骨和胫骨，收集骨髓细胞。1000 rpm/min离心5 min后，洗涤3次，重悬于添加10%胎牛血清(DMEM, Gibco)的最低必要培养基中，密度为 细胞/厘米²。在第3天去除非贴壁细胞。如前所述，通过流式细胞术(Becton Dickinson Inc.， Franklin Lakes, NJ, USA)通过表面标记物的存在来选择和识别细胞[15]（阳性的Sca-1，CD105，和CD90和CD45阴性，CD34，和CD31）。3^{理查德·道金斯}细胞传代用于后续实验。

2.2。单核细胞和共培养的分离

首先，6周龄的C57BL / 6小鼠被处死：如下获得的单核细胞。腹部的皮肤然后拉开腹部左侧肌肤，令腹部膜完好，直到脾脏切除打开。Single-cell suspensions were obtained from the spleen by digestion with a cocktail of 450 U/ml collagenase II, 125 U/ml collagenase IV, and 60 U/ml hyaluronidase (Sigma-Aldrich) for 30 min at 37°C with shaking. After filtration through a 200-mesh screen and centrifugation at 400 g, the cells were positively selected using CD11b by flow cytometry (Thermo Fisher Scientific, CN). The purified cells were cultured in RPMI medium 1640 supplemented with 10% FCS in 6-well plates. The monocytes used for the experiments were from the 3^{理查德·道金斯}通道。Transwell钱伯斯(8.0μ采用m孔径，Millipore)检测上述单核细胞和间充质干细胞之间的相互作用(共培养24-72 h)。

2.3条。小鼠护理与AMI模型

本研究的所有动物实验均获得了东南大学动物保护与使用委员会(IACUC)的批准(20180828003)。所遵循的所有程序均符合动物实验(机构和国家)负责委员会的伦理标准，并符合1975年修订的《赫尔辛基宣言》。所有对小鼠的操作都符合美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)和IACUC的指南。C57BL / 6和C57BL / 6^CX3CR1型-/-小鼠(购自北京生物细胞原有限公司)喂食常规饲料，放置于专用房间(25℃-28℃)。

AMI小鼠左前降支的直接结扎引起。Male or female (paired) mice (6–8 weeks old) weighing 20–25 g were used in the experiment. After being anesthetized (0.1% pentobarbital sodium (50 mg/kg)) and under ventilator-assisted breathing (110 breaths/minute; Harvard Apparatus), approximately 1 cm of the wound layer was cut along the 3–4 intercostal space of the left chest. After separation of the pericardium, the left side branch of the coronary artery was ligated with an 8–0 nylon suture below the left auricular level. ST elevation at three unipolar limb leads (left upper limb and two lower limbs) was considered to be a successful AMI model.

2.4条。流式细胞仪分析和Western印迹

红细胞裂解后用梯度密度离心分离单核细胞。PBS(4℃)洗涤2次后，以10的浓度重悬⁶细胞/毫升。然后将单细胞悬液与FITC-rat抗小鼠CD11b和PE-rat抗小鼠Ly6C孵育(BD Biosciences)。CD11b⁺的Ly6C^高的使用流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific, CN)进一步鉴定单核细胞。简单地说，CD11b单核细胞以a侧分散的方式门控;随后是Ly6C亚群^高的和Ly6C^低单核细胞通过的Ly6C的在它们的表面表达模式来区分。

单核细胞或心肌梗塞与PBS洗两次,细胞溶解在裂解缓冲(10更易与l Tris-HCl, pH值7.4,含1% Triton x - 100, 100更易/ l氯化钠,20 l更易与焦磷酸钠,2更易/ l原钒酸钠,2更易/ l EDTA,鸡尾酒和1%的蛋白酶抑制剂(σ)),和离心机在12000 g 30分钟在4°C。使用蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific, USA)测定蛋白浓度，将样品与sds -变性样品缓冲液混合，用10% SDS-PAGE凝胶分离。蛋白质通过电泳转移到PVDF膜上。膜被阻断，在4℃的摇摆平台上孵育过夜，同时带有针对NR4A1 (Santa Cruz Biotechnology)和GAPDH的抗体(1:10 00;康宸生物股份有限公司(中国)然后将膜与hrp偶联的二抗孵育1小时，并使用分子成像仪ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad)暴露。使用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)分析蛋白条带的相对强度。

2.5。免疫染色

动物在急性心肌梗塞后的特定日子被献祭。根据已建立的方法，将组织固定在福尔马林中，并包埋在石蜡块中。这些固定的心脏被连续切开μ从顶点到刚刚冠状动脉结扎部位以下的m级。After antigen retrieval, the specimens were incubated with 1% normal blocking serum in PBS for 60 min to suppress the nonspecific binding of IgG. The slides were then incubated for 30-60 min with each mouse antibody or fluorescent reagent. A TUNEL kit (R&D Systems) was used to identify the nuclei of the apoptotic cardiac myocytes in the infarct border zone on days 3 and 7. CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1/CD31, BD Biosciences) was used for immunohistochemistry to measure vessel density at day 3 and day 21. Microscopy (Olympus BX61) was used as necessary to obtain images of the immunostaining results.

2.6。统计分析

实验采用SPSS 23.0软件进行数据分析和组间比较。依赖于数据的表达和分布，独立 -检验（正态分布数据和连续数据）和卡方检验或费舍尔精确检验（分类变量数据）。采用Kaplan-Meier生存曲线比较两组小鼠的无事件生存率。实验中的所有结果都被认为在统计学上有显著性值≤0.05。

3.结果

3.1。Ly6C转换^高的到的Ly6C^低单核细胞共培养时有或无的MSC

间充质干早就被称为干细胞具有免疫调节功能。的Ly6C^高/低单核细胞首次与间充质干细胞在transwell室共培养。我们先做了Ly6C的比例^低有间充质干细胞和无间充质干细胞培养的两组单核细胞具有可比性(第1天)( vs。 ， )。正如所料，3天以后，我们发现的Ly6C的大幅增加^低该组中与MSC共培养被（ vs。 ， )。而相应的对照组中未发现间充质干细胞( vs。 ， ）（数字图1（a）)。同时，NR4A1在这些Ly6C中的表达水平^高/低然后测试单核细胞。与Ly6C的趋势相似^低单核细胞与骨髓间充质干细胞共培养3天后，NR4A1的表达水平显著升高( vs。 ， ）但在没有MSCs的组中没有( vs。 ， ）（数字图1（b）)。

3.2。循环的Ly6C模式^高/低骨髓间充质干细胞改变AMI小鼠单核细胞

为了进一步确定的Ly6C MSCs的免疫调节功能^高/低体内单核细胞，C57BL/6^CX3CR1型-/-老鼠 （ ）被引入并进行AMI。我们首先证实的Ly6C的较低水平^低与C57BL/6野生型AMI小鼠( ）（ vs。 ， ）（数字2(一个))。如所预期的，当的MSC施用于AMI心脏C57BL / 6中的心肌^CX3CR1型-/-在小鼠体内，我们检测到循环中的Ly6C显著增加^低第3天的单核细胞( vs。 ， ）与C57BL/6相比^CX3CR1型-/-无骨髓间充质干细胞移植的小鼠( vs。 ， ）（数字2 (b))。

众所周知，浸润在AMI心肌中的炎症单核细胞对心肌重塑至关重要，因此我们接下来要确定Ly6C的模式^高/低在C57BL / 6的梗塞心肌的单核细胞^CX3CR1型-/-是否有MSC移植的小鼠。结果进一步证实了Ly6C的显著升高^低第3天AMI心脏MSC灌注后单核细胞( vs。 ， ）与未给予基质干细胞的对照组相比( vs。 ， ）（数字2 (c))。在C57BL / 6的MI心中NR4A1的表达水平^CX3CR1型-/-小鼠进一步测试;类似的Ly6C的表达模式^低单核细胞如图所示，NR4A1在C57BL/6中的表达水平^CX3CR1型-/-间充质干细胞移植第3天AMI小鼠心脏明显升高( vs。 ， ）与未输血组比较( vs。 ， ）（数字2 (d))。

3.3。C57BL / 6^CX3CR1型-/-AMI后的小鼠表现出减少的生存函数

为了进一步确定的Ly6C数量^低单核细胞影响小鼠AMI后的生存，C57BL/6首先比较了小鼠30天的生存功能^CX3CR1型-/-小鼠和C57BL / 6野生型小鼠（ (每组)有或没有MSC移植。结果表明，C57BL/6的存活率较高^CX3CR1型-/-小鼠（25％）比被显著降低C57BL / 6野生型小鼠（56.3％）在没有输注MSC AMI后的该（ ， ）（数字3(一个)），其直接指示的Ly6C的重要性^低单核细胞在预后。然而，骨髓间充质干细胞移植( 在各组中)，我们发现C57BL/6的存活率^CX3CR1型-/-小鼠（43.8％）和C57BL / 6野生型小鼠（62.5％）是可比较的（ ， ）（数字3 (b))。虽然结果可能与一个非常小的样本量，它们直接表明，干细胞促进单核细胞表型转化在这个过程中起到了非常重要的作用。

3.4。急性心肌梗死心肌细胞NR4A1水平升高时细胞凋亡减少

在这里，我们证明了间充质干细胞有助于循环Ly6C的转变^高的单核细胞转化为Ly6C^低单核细胞，它总是伴随着NR4A1的表达水平增加。接下来，我们想减少心肌重构的潜在机制是否与NR4A1。基于免疫印迹在AMI心脏C57BL / 6的标识NR4A1的不同表达水平^CX3CR1型-/-MSC输血后小鼠（NR4A1 / ）我们首先在第3天AMI后发现心肌纤维裂解和减少在低级别NR4A1基的明显的趋势，通过Masson染色（ vs。 ， ）（数字图4（a）），虽然有关于此时的左心室壁的厚度没有显著差异（数据未显示）。在这种情况下，我们接下来检测心肌细胞在这些条件下的细胞凋亡（ 在每组)。结果证实，双方在第3天（ vs。 ， ）及在第七天( vs。 ， ）项TUNEL⁺与低表达组相比，高表达组心肌细胞明显减少(图)4（b）)。

3.5条。在急性心肌梗死（AMI）心脏NR4A1水平升高时，血管生成增加

发现C57BL/6心肌梗死心肌细胞凋亡减少^CX3CR1型-/-NR4A1表达水平升高的小鼠，下一步我们打算测试NR4A1水平升高是否有助于AMI后的新生血管形成。检测cd31阳性内皮细胞在第3天和第21天的表达( 在每组)。免疫组化分析证实cd31阳性的内皮细胞在第3天具有可比性( vs。 ， 国家统计局。然而，我们进一步发现升高NR4A1组的CD31阳性内皮细胞在第21天显著增加( vs。 ， ）（数字五（一）），这表明NR4A1对心肌梗死后心肌修复了非常积极的作用。

4。讨论

研究逐渐证实v特别是Ly6C为单核细胞^高的亚群及其衍生的炎症介质是导致心肌梗死后心肌细胞坏死和重构进展的重要因素。另一方面，Ly6C^低促进炎症消退的亚群在心肌梗死后下一阶段清除坏死细胞碎片和维持血管壁稳定具有重要作用。因此，尽早控制炎性细胞的平衡和浸润，促进炎性介质的清除和消退，有可能减轻心肌梗死后心肌重构，改善预后。由于其优越的生物学特性如前所述[16，17，间充质干细胞作为一种基于细胞的心脏修复疗法已被广泛研究。在这里，我们发现了MSCs通过转化Ly6C改善心肌梗死预后的新特征^高的单核细胞转化为Ly6C^低单核细胞以及该改善的基本机制。

通过使用共培养模型和C57BL / 6^CX3CR1型-/-实验小鼠Ly6C的积累和分布^高/低(1)骨髓间充质干细胞是参与Ly6C分化的免疫调节细胞^高的-phenotype单核细胞到的Ly6C^低-phenotype单核细胞;（2）的Ly6C的相对和极低的水平^低-phonotype单核细胞存在于C57BL / 6的循环^CX3CR1型-/-即使AMI后小鼠;（3）MSC的全身移植下，显着增加的Ly6C的比例^低-phonotype在C57BL / 6中观察到的单核细胞^CX3CR1型-/-流式细胞仪分析证实小鼠；和（4）Ly6C表达增加^低以下MSC移植单核细胞总是伴随着增加NR4A1的表达水平。AMI三天后心肌细胞和毛细血管在三周增加再生的细胞凋亡减少进一步表明，核受体NR4A1可能在单核细胞表型转化的过程中发挥重要作用。

的Ly6C^低单核细胞，也称为巡逻单核细胞，作为净化剂和血管壁进行监视巡逻。以前的报告已经表明的Ly6C^低来自脾脏的单核细胞浸润缺血心脏作为免疫反应的第二阶段(在Ly6C之后)^高的单核细胞浸润）和促进炎症减少。的CX3CL1 / CX3CR1轴已知是的Ly6C的募集和浸润的关键调节^低单核细胞在缺血性心脏，作为巡逻单核细胞表达CX3CR1高得多的水平。有研究表明，CX3CR1删除减少的Ly6C的巡逻和数量^低单核细胞 [18]。

因此，在本研究中，共培养的MSC和单核细胞后，我们进一步检测的Ly6C的异质^高的和Ly6C^低使用C57BL / 6单核细胞在体内^CX3CR1型-/-Ly6C水平相对较低的小鼠^低单核细胞相比，C57BL / 6野生型小鼠。此外，我们证实C57BL / 6的存活率^CX3CR1型-/-与C57BL/6野生型小鼠相比，急性心肌梗死小鼠的心肌强度明显降低。因此，只有在这种情况下，我们才能通过MSCs实现最真实的单核细胞表型转化。随后，我们进一步证实了MSC移植显著增加Ly6C表达的假说^低单核细胞和减少的C57BL / 6的死亡率^CX3CR1型-/-AMI后的老鼠。当然，在这个过程中，我们观察到C57BL/6循环中巡逻单核细胞的水平相对较低(但不是零)^CX3CR1型-/-这可能是因为除了CX3CR1之外，单核细胞中的CCR5表达至少部分负责巡逻单核细胞的招募，即使是在低水平[19-21]。

底层的MSCs如何控制的Ly6C的异质性的机制^高的单核细胞分化为Ly6C^低单核细胞，一直是一直缺乏解释的一个关键问题。最近的研究已经确定NR4A1作为一个关键分子信号是用于驱动的​​Ly6C的子集的分化关键^低[22，23]。研究人员此前已经表明，删除一个Nr4a1 superenhancer子域可以消融Ly6C^低单核细胞生产，这充分表明孤儿核受体NR4A1具有抑制炎症活动的能力，并参与巡逻的单核细胞的调节[24]. 因此，我们接下来确定Ly6C是否具有异质性^高的单核细胞分化成Ly6C亚群^低与核受体NR4A1有关;我们的结果表明NR4A1表达水平的增加模式与Ly6C相似^低单核细胞。根据以往的研究[25，26]和我们的研究，我们认为，这种关系的原因是，核受体NR4A1有助于单核细胞的表型转化。

我们前期研究已初步证明MSC移植可抑制心肌重构[11]。然而，虽然生长因子更高分泌物被鉴定为潜在的机制，其他因素也可能参与。NR4A1的抗炎性质表明，单核细胞调节通过的MSC的过程中，它可能是被称为解决炎症的保护反应。因此，我们接下来根据在MI心脏NR4A1的不同表达水平检测心肌细胞的AMI后的细胞凋亡和新血管形成MSC移植下。结果进一步证实了TUNEL⁺在高NR4A1表达水平时，心肌细胞明显减少，CD31阳性内皮细胞数量也显著增加。综上所述，这两个结果都表明NR4A1/Nur77是一个新的炎症调节靶点，对抑制心肌重构也很重要。

5结论

通过使用共培养模型和C57BL / 6^CX3CR1型-/-实验小鼠Ly6C的积累和分布^高/低急性心肌梗死后单核细胞和4nRlyc表达的变化^高/低本研究表明MSCs可以控制Ly6C的异质性^高的单核细胞分化为Ly6C^低单核细胞。通过进一步根据NR4A1表达的以下AMI水平分组的小鼠中，我们证明了基本机制，通过它的MSC可能有助于NR4A1在的Ly6C表达增加^高/低单核细胞。NR4A1在msc驱动的单核细胞表型转化过程中表现出了良好的抗炎作用。

缩写

AMI:	急性心肌梗塞
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
CCR5：	CC-趋化因子受体5
CX3CL1:	Fractalkine
CX3CR1：	趋化因子(C-X3-C基序)受体1
小姐:	心肌梗死
msc:	间充质干细胞
NR4A1:	核受体亚家族4 A组成员
TUNEL：	末端转移酶介导的缺口末端标记。

数据可用性

支持这一研究结果的数据可直接从合理要求通讯作者。

伦理审批

所有的程序都遵循根据动物实验（研究机构和国家）负责委员会的道德标准，并于1975年修订后的赫尔辛基宣言（伦理许可号：20180828003）。

的利益冲突

作者在此声明，没有竞争的利益存在。

致谢

笔者想感谢实验室成员的贡献。这项工作是由中国国家自然科学基金（编号81670326）的支持下，青年医学人才江苏省的项目（编号QNRC2016814），以及科学和南京的科技项目（201803076号）。

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