Mouse-derived msc(从C57BL / 6野生型小鼠)准备如前所述[ 14]。6周大鼠的股骨和胫骨第一次刷新PBS (HyClone)收集骨髓细胞。在1000转/分钟离心后5分钟,这些细胞被洗3次,然后resuspended基本中补充10%的边后卫(DMEM Gibco)的密度 5 × 10 6 细胞/厘米²。在第三天不依从细胞被移除。细胞被选择和确定的表面标记通过流式细胞术(Inc .)正欲富兰克林湖,新泽西,美国)如前所述[ 15](阳性本来CD105, CD90 CD45和消极,CD34,和CD31)。3^{理查德·道金斯}通过细胞用于后续实验。

单核细胞获得如下:第一,6周大C57BL / 6小鼠被牺牲了。腹部的皮肤被肢解皮肤然后打开左边的腹部,让腹部膜完整,直到脾脏切除。单细胞悬浮体被消化从脾获得鸡尾酒的450 U /毫升胶原酶II, 125 U /毫升胶原酶IV, 60 U /毫升透明质酸酶(Sigma-Aldrich) 30分钟在37°C用颤抖的。通过200 -筛网过滤,离心后在400 g,这些细胞被积极使用CD11b来选择通过流式细胞术(热费希尔科学、CN)。1640年在RPMI培养基培养纯化细胞补充10% FCS 6-well板块。单核细胞用于实验的3^{理查德·道金斯}通道。Transwell钱伯斯(8.0 μ米孔隙大小、微孔)被用来研究单核细胞之间的相互作用和msc获得高于(coculture 24 - 72 h)。

本研究所有动物实验中执行机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)东南大学(20180828003)。随后的过程都是按照道德标准负责动物实验委员会(机构和国家)和赫尔辛基宣言在1975年修订。所有程序在老鼠身上进行符合国家卫生研究院和IACUC指南。C57BL / 6和C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}老鼠(购自北京Biocytogen有限公司)被喂以普通饮食和放置在一个专门的房间(25°C-28°C)。

AMI直接引起的小鼠结扎左冠状动脉前降的。男性或女性(配对)小鼠(6 - 8周大)重20 - 25 g被用于实验。被麻醉后(0.1%戊巴比妥钠(50毫克/公斤)),在ventilator-assisted呼吸(呼吸110次/分钟;哈佛装置),大约1厘米的伤口层下调3 - 4肋间隙的左胸。心包的分离后,左侧冠状动脉结扎,下面有一个8 - 0尼龙缝线左侧耳的水平。ST段三个单极肢领导(左上肢和两下肢)被认为是一个成功的AMI模型。

单核细胞是由梯度密度离心分离后红细胞溶解。与PBS洗两次后(4°C),这些细胞被resuspended浓度的10⁶细胞/毫升。单细胞悬浮体被孵化与FITC-rat anti-mouse CD11b和PE-rat anti-mouse Ly6C (BD生物科学)。CD11b⁺Ly6C^高单核细胞进一步确定使用流式细胞分析仪(热费希尔科学、CN)。简而言之,CD11b单核细胞被封闭在一个散射;随后,Ly6C的亚种群^高和Ly6C^低单核细胞是杰出Ly6C的表面表达模式。

单核细胞或心肌梗塞与PBS洗两次,细胞溶解在裂解缓冲(10更易与l Tris-HCl, pH值7.4,含1% Triton x - 100, 100更易/ l氯化钠,20 l更易与焦磷酸钠,2更易/ l原钒酸钠,2更易/ l EDTA,鸡尾酒和1%的蛋白酶抑制剂(σ)),和离心机在12000 g 30分钟在4°C。蛋白质浓度测定使用分析工具包(热科学、美国),和样本与SDS-denaturing混合样品缓冲和10% sds - page凝胶分离。蛋白质被电泳转移到PVDF膜。膜被和孵化一夜之间摇摆平台上在4°C抗体NR4A1(圣克鲁斯生物技术)和GAPDH (1: 1000;康晨生物有限公司,中国)。膜被孵化与HRP-conjugated二级抗体1 h和暴露使用分子成像仪ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad)。分析了蛋白质的相对强度乐队使用Image-Pro + 6.0(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。

这些动物牺牲AMI后在特定的日子里。组织在福尔马林固定和嵌入在石蜡块根据建立协议。固定的心被连续削减8 μ米从顶点水平在冠状动脉结扎的网站。抗原检索后,血清标本与1%正常孵化阻塞在PBS 60分钟抑制免疫球蛋白的非特异性结合。幻灯片是培养30 - 60分钟每只小鼠抗体或荧光试剂。TUNEL工具包(研发系统)是用来确定凋亡心肌细胞的细胞核在梗死边界区天3和7。CD31(血小板内皮细胞粘附molecule-1 PECAM-1 / CD31、BD生物科学)是用于免疫组织化学测量血管密度在3天21。显微镜(奥林巴斯BX61)被用作免疫染色的图像获得结果的必要条件。

SPSS 23.0被用于数据分析和对比组的实验。根据数据的表达和分布,一个独立的 t 以及(正态分布数据和连续数据)和卡方测试或确切概率法(分类变量数据)。用于比较风平浪静kaplan - meier生存曲线两组老鼠的生存。所有的结果在实验中被认为是双面的统计学意义 p 值≤0.05。

msc一直被称为干细胞和免疫调节功能。Ly6C^高/低单核细胞第一次与msc cocultured transwell室。我们第一次做Ly6C的比例^低单核细胞在两组比较(1天)培养时,没有msc ( 3.69 % ± 0.74 % vs。 4.20 % ± 1.03 % , p = 0.32 )。正如所料,3天之后,我们发现了一个Ly6C的增加^低在集团与msc cocultured ( 12.8 % ± 3.77 % vs。 3.69 % ± 0.74 % , p < 0.001 )。和没有显著差异显示在相应的对照组没有msc ( 4.41 % ± 1.22 % vs。 4.20 % ± 1.03 % , p = 0.83 )(图 1(一))。当时,在这些Ly6C NR4A1的表达水平^高/低单核细胞被测试。类似于Ly6C的趋势^低单核细胞的表达水平NR4A1显著增加coculture msc(3天后 1.81 ± 0.46 vs。 0.43 ± 0.09 , p < 0.001 组中),但不是没有msc ( 0.65 ± 0.33 vs。 0.77 ± 0.25 , p = 0.249 )(图 1 (b))。

为了进一步确定Ly6C msc的免疫调节功能^高/低单核细胞体内,C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}老鼠( n = 12 )被引入和接受AMI。我们第一次证实了Ly6C水平相对较低^低在循环中单核细胞相比,第三天细胞的比例在C57BL / 6 AMI野生型小鼠( n = 12 )( 4.36 % ± 1.27 % vs。 12.17 % ± 3.81 % , p < 0.001 )(图 2(一个))。正如所料,msc管理时的心肌AMI心C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}老鼠,我们检测到一个循环Ly6C大大增加^低单核细胞在第三天( 16.7 % ± 3.67 % vs。 3.22 % ± 0.44 % , p < 0.001 )与C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}没有MSC移植的小鼠 7.10 % ± 1.55 % vs。 3.66 % ± 0.61 % , p = 0.091 )(图 2 (b))。

众所周知,炎症单核细胞,渗透在AMI的心肌心肌重塑的心是最关键的,我们接下来着手确定Ly6C的模式^高/低单核细胞在心肌梗塞C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}老鼠有或没有MSC移植。结果进一步证实了一个伟大的Ly6C增加^低单核细胞在AMI心MSC输液后在第三天( 3.31 % ± 0.69 % vs。 0.42 % ± 0.21 % , p < 0.001 控制不了msc(相比) 0.72 % ± 0.29 % vs。 0.38 % ± 0.14 % , p = 0.244 )(图 2 (c))。表达水平的NR4A1 MI C57BL / 6的心^{CX3CR1 - / -}老鼠进一步测试;类似于Ly6C的表达模式^低上面的单核细胞,NR4A1在C57BL / 6的表达水平^{CX3CR1 - / -}AMI老鼠心脏显著增加在第三天MSC移植 0.39 ± 0.10 vs。 0.11 ± 0.04 , p < 0.001 )相比,该集团没有MSC输血( 0.09 ± 0.05 vs。 0.17 ± 0.07 , p = 0.079 )(图 2 (d))。

为了进一步确定Ly6C的数量^低单核细胞影响AMI后老鼠的生存,生存函数在30天内首次C57BL / 6相比^{CX3CR1 - / -}老鼠和C57BL / 6野生型小鼠( n = 16 在每组)有或没有MSC移植。结果表明,C57BL / 6的存活率^{CX3CR1 - / -}老鼠(25%)显著低于C57BL / 6野生型小鼠(56.3%)没有MSC注入AMI后( χ 2 = 4.343 , p = 0.037 )(图 3(一个)),直接表明Ly6C的重要性^低单核细胞在预后。然而,当msc移植( n = 16 在每组),我们发现存活率C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}老鼠(43.8%)和C57BL / 6野生型小鼠(62.5%)是相似的( χ 2 = 1.089 , p = 0.297 )(图 3 (b))。尽管结果可能与一个非常小的样本容量,他们直接表明,msc促进单核细胞表型转变在这一过程中发挥了非常重要的作用。

在这里,我们表明,msc为循环Ly6C的过渡^高单核细胞进入Ly6C^低单核细胞,它总是伴随着NR4A1的表达水平增加。我们接下来想知道潜在的机制,减少心肌重塑NR4A1有关。基于免疫印迹发现的不同表达水平的NR4A1在AMI心C57BL / 6^{CX3CR1 - / -}老鼠在MSC输血(NR4A1 / GAPDH ≥ 0.2 ),我们首先发现了一个明显的心肌纤维溶解和下降趋势低级NR4A1集团通过马森染色在AMI后第三天( 36 % ± 7.5 % vs。 50 % ± 11 % , p < 0.001 )(图 4(一)),尽管没有显著差异有关的左心室壁厚度(数据未显示)。在这种情况下,我们下一个检测心脏细胞的凋亡在这些条件下( n = 12 在每组)。结果证实,在第三天( 9.66 % ± 2.04 % vs。 13.54 % ± 3.01 % , p < 0.001 在第七天)和( 15.45 % ± 4.42 % vs。 22.78 % ± 6.40 % , p < 0.001 ),项TUNEL⁺心脏细胞在high-NR4A1表达水平显著降低心相比低水平组(图 4 (b))。

发现减少心肌细胞凋亡的MI C57BL / 6的心^{CX3CR1 - / -}NR4A1小鼠表达水平升高,我们接下来打算测试NR4A1水平是否过高会导致AMI后新血管形成。CD31-positive内皮细胞的表达在第三天发现21天( n = 6 在每组)。包含IHC分析证实,CD31-positive内皮细胞是可比的第三天( 0.041 ± 0.010 vs。 0.034 ± 0.009 , P = NS。然而,我们还发现,CD31-positive NR4A1升高组内皮细胞大大增加在21天( 0.193 ± 0.036 vs。 0.075 ± 0.019 , p < 0.001 )(图 5(一)),它表示一个非常积极的角色NR4A1在心肌梗死后心肌修复。