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干细胞国际
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干细胞国际/2020年/文章

研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 2016809 | https://doi.org/10.1155/2020/2016809

赵惠民毛,安迪,远古时期,郎朗Lei, Houxuan李, ”琥珀酸补充了“Pseudohypoxia”条件促进增殖、迁移和牙周韧带细胞的骨生成”,干细胞国际, 卷。2020年, 文章的ID2016809, 14 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/2016809

琥珀酸补充了“Pseudohypoxia”条件促进增殖、迁移和牙周韧带细胞的骨生成

毛家,1,2 我杨,1,2 远古时期赵,1 朗雷,1 和 Houxuan李1

1南京口腔医院、南京大学医学院、南京,210008年,中国

2——南京口腔医院口腔中心实验室,南京大学医学院,南京,210008,中国

学术编辑器:杰斯弗里斯
收到了 2019年11月18日
修改后的 2020年2月01
接受 2020年2月25日
发表 2020年3月10

文摘

大多数的间充质干细胞存在于低氧张力的利基。如CoCl Iron-chelating代理2和去铁胺用于模拟缺氧,促进细胞生长。本研究的目的是探讨是否琥珀酸的补充,一种自然的代谢物三羧酸(TCA)循环,可以模拟缺氧条件促进人牙周韧带细胞(hPDLCs)。培养hPDLCs在缺氧条件促进细胞增殖,迁移和成骨分化;此外,缺氧改变细胞代谢氧化磷酸化和糖酵解与琥珀酸的积累在细胞溶质及其释放到上层的文化。琥珀酸补充增强hPDLC扩散、迁移和骨生成与降低琥珀酸脱氢酶(SDH)表达和活动,以及增加己糖激酶2 (HK2)和6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2 6-biphosphatase 3 (PFKFB3),建议从氧化磷酸化,糖酵解代谢重编程在正常氧条件。细胞培养提拔的琥珀酸补充细胞内琥珀酸积累而稳定缺氧诱导因子- 1α(HIF-1α),导致pseudohypoxia状态。此外,我们表明,低氧诱导增殖是G-protein-coupled受体91 - (GPR91)的依赖,而外生succinate-elicited扩散涉及GPR91-dependent GPR91-independent通路。总之,hPDLCs琥珀酸补充改变细胞代谢,诱导pseudohypoxia条件,增强扩散、迁移,骨间充质干细胞在体外。

1。介绍

牙周炎是一种炎症性疾病显著损失的牙周韧带干细胞和支持组织(1]。尽管长期努力重建牙周引导组织再生组织,引导骨再生和应用釉质基质衍生品、牙周再生对牙周病医师(仍然是具有挑战性的2]。干细胞再生方法,特别是应用人类牙周韧带细胞(hPDLCs),吸引了很多临床感兴趣3]。最近,在临床研究中,移植自体hPDLCs bovine-derived骨矿物质改善预后的牙周过去不少缺陷(4]。这些干细胞再生很大程度上取决于干细胞的体外扩张,这是尤其重要的老年牙周炎患者(5]。

通常,nonproliferated和未分化的干细胞生长在一个低氧(氧气不足21%)。氧张力在骨髓是1 - 6%6),而正常的牙周膜氧张力范围从2.9%到5.7% (7]。血氧饱和度水平是决定干细胞生物活性的一个主要因素。缺氧促进细胞生长和迁移,帮助维持细胞具备干细胞(8,9]。缺氧的影响主要是由低氧诱导因子(hif) (10),dna结合转录因子和绑定到受缺氧元素(人力资源)的目标基因的启动子和增强剂(10]。在正常氧条件,HIF-1α核易位是持续减少prolyl羟化酶2 - (PHD2)介导的羟基化(11]。

缺氧状态下可以实现和维护利用低氧室;然而,变化的气体媒体(95% N2和5%的公司2)长期细胞培养成本和耗时。因此,如氯化钴(CoCl hypoxia-mimicking代理2)和去铁胺(柴油)在干细胞的扩张(12];然而,这个代理的细胞毒性(仍然是一个问题8]。处于缺氧状态,细胞代谢的变化从氧化磷酸化(OxPhos)糖酵解生成三磷酸腺苷(ATP)和代谢的中间体(13]。积累柠檬酸、琥珀酸中间体的三羧酸循环(柠檬酸),通常可以观察到在缺氧细胞培养的,生物活性的关键限速酶,异柠檬酸脱氢酶(IDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH),可以抑制缺氧状态和HIF-1α稳定(14]。

琥珀酸生产的线粒体基质可以导出到细胞溶质通过dicarboxylate SLC25A10载体(15),而高浓度的胞质稳定HIF-1琥珀酸α,从而促进HIF-1α阿端依赖基因甚至2浓度高的胞质(16]。此外,琥珀酸在细胞质中可以释放到细胞外空间和作为代谢信号。琥珀酸91年5月与G-protein-coupled受体结合(GPR91),也称为琥珀酸受体1 (SUCNR1),并引发一连串的生物事件(13]。在巨噬细胞,琥珀酸活化可能极化巨噬细胞为促炎的亚型(M1巨噬细胞)16]。此外,琥珀酸可提高移植后的干细胞激活琥珀酸受体(17]。然而,琥珀酸是否可以用来模拟pseudohypoxia状态细胞溶质,促进干细胞增殖从未被报告过。在我们目前的研究中,我们首次发现琥珀酸水平升高在hPDLCs培养在缺氧和外生琥珀酸可以利用模拟hPDLCs缺氧状态和重新编码细胞代谢。

2。材料和方法

2.1。隔离和hPDLCs的识别

hPDLCs分离,并使用外植体培养技术。短暂,牙齿是来自前磨牙的主题(平均年龄:13岁)需要矫正治疗,从每个参与者获得知情同意。自由人民党的组织是头皮从根表面的三分之一,在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(美国Gibco DMEM)含10% 胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1%青霉素和链霉素在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2。媒介改变了3天后,长大在大约80%融合细胞通道。细胞在第三到第五章节被用于这项研究。

2.2。流式细胞术

hPDLCs被确定通过流式细胞术使用抗体CD11b, CD90、CD45、CD29。hPDLCs ( ,第三段)被放置在1.5毫升埃普多夫管和PBS洗两次。接下来,异硫氰酸荧光素(FITC)共轭或藻红蛋白——(PE)共轭anti-CD11b anti-CD90, anti-CD45, anti-CD29抗体被添加到hPDLC样品和孵化在室温下在黑暗中30分钟。细胞的百分比积极沾CD11b, CD90、CD45、CD29评估fluorescence-activated细胞排序。

2.3。缺氧/琥珀酸治疗

细胞被镀在10厘米。细胞培养在正常氧条件或缺氧条件(1%氧气)在低氧室(美国热科学)。如果氧张力超过所需的水平,氮气是自动注入系统代替多余的氧气。琥珀酸补充集团琥珀酸钠氢六水合物(美国Sigma-Aldrich)添加到指定浓度的培养基(1、5或25毫米)。抑制HIF-1α活动,hPDLCs HIF-1使用α特殊技能抑制剂湾87 - 2243(5海里;美国莱克)3 h。

2.4。细胞增殖实验

hPDLCs被播种密度 /到96孔板和培养24小时。琥珀酸测定的影响或缺氧hPDLCs的扩散,细胞琥珀酸处理(0、1、5、25毫米)24 h, 48 h, 72 h和96 h或缺氧(1%啊2为24小时)。细胞增殖与细胞计数评估Kit-8 (CCK-8) (Dojindo、日本)。在CCK-8分析中,CCK-8添加2 h在37°C和吸光度测定使用450纳米波长的标。

2.5。愈合迁移分析

hPDLCs镀和增长 细胞/在6-well盘子准备五个直线在24 h。然后,抓机械地执行了20μL移液枪垂直于基地的五行。细胞培养的另一个24小时琥珀酸(0、1、5、25毫米)或缺氧(1%啊2)处理和可视化与倒置显微镜(日本尼康)。

2.6。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色

hPDLCs被播种在24-well板的密度 细胞/好,孵化成骨的媒介,这是补充50毫克/毫升抗坏血酸,100海里地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐为7天。媒介是改变每48 h。细胞被用磷酸盐溶液(美国Gibco PBS) 3倍和4%的多聚甲醛固定剂处理30分钟。然后,盘子又洗了PBS和孵化在室温下使用BCIP /电视台碱性磷酸酶颜色开发工具包(Beyotime,中国)30分钟相应比例的解决方案根据制造商的指示。

钙沉积被茜素红S染色检测。hPDLCs培养在 细胞/在12-well文化板块的21天成骨的媒介。细胞被冲洗两次与PBS和固定在10%甲醛10分钟。细胞被洗,染色茜素红S(美国Sigma-Aldrich)在室温下20分钟。用去离子水清洗多余染料被轻轻直到背景变得明朗。

2.7。测定琥珀酸浓度和琥珀酸脱氢酶活性

细胞外和细胞内琥珀酸浓度测量与琥珀酸比色测定试剂盒(Megazyme,爱尔兰)根据制造商的指示。简单地说,条件中收集和处理显示代理。测量细胞内琥珀酸和琥珀酸脱氢酶活性,细胞与冻融循环处理,收集细胞溶解产物。然后,细胞溶菌作用的解决方案是离心机在每分钟1500发2分钟去除碎片。琥珀酸脱氢酶活性检测与琥珀酸脱氢酶酶联免疫试剂盒(JinYibai,中国)根据制造商的协议。

2.8。逆转录聚合酶链反应和实时PCR

hPDLCs被播种在6-well板的密度 细胞缺氧/好,处理条件(1%啊2琥珀酸)或(0,1,5更易/ L) 4 h。的总RNA提取RNeasy +迷你包(Tiangen,中国)。逆转录反应了1μg使用互补脱氧核糖核酸合成的RNA设备(Vazyme,中国)。然后,cDNA与引物混合(GenScript,中国)和最大值®SYBR绿/火箭qPCR大师混合(热费希尔科学)根据制造商的协议并受实时PCR ViiA™7实时PCR系统(美国热费希尔科学)。β肌动蛋白作为内部参考基因,和数据分析 方法。结果显示为目标基因的相对表达比参考基因。引物的序列是列在表中1。
基因 正向引物(5 到3 ) 反向引物(5 到3 )
CCND1 CAATGACCCCGCACGATTTC CATGGAGGGCGGATTGGAA
CCNB1 AACTTTCGCCTGAGCCTATTTT TTGGTCTGACTGCTTGCTCTT
CCND3 TACCCGCCATCCATGATCG AGGCAGTCCACTTCAGTGC
P21 TGTCCGTCAGAACCCATGC AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC
OCN GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG GATGTGGTCAGCCAACTCGT
高山 GACCCTTGACCCCCACAAT GCTCGTACTGCATGTCCCCT
RUNX2 GGAGTGGACGAGGCAAGAGTTT AGCTTCTGTCTGTGCCTTCTGG
COL-1 AGAACAGCGTGGCCT TCCGGTGTGACTCGT
HK2 GAGCCACCACTCACCCTACT CCAGGCATTCGGCAATGTG
PFKFB3 TTGGCGTCCCCACAAAAGT AGTTGTAGGAGCTGTACTGCTT
SDHa CAGCATGTGTTACCAAGCTGT GGTGTCGTAGAAATGCCACCT
SDHb ACCTTCCGAAGATCATGCAGA GTGCAAGCTAGAGTGTTGCCT
GPR91 GGAGACCCCAACTACAACCTC AGCAACCTGCCTATTCCTCTG
β肌动蛋白 GTGGGGCGCCCCAGGCACCA CGGTTGGCCTTGGGGTTCAGGGGGG
表1
核苷酸序列的引物用于实时PCR。
2.9。免疫印迹分析

显示治疗后,收集细胞细胞溶解•瑞帕在冰上裂解缓冲了15分钟。蛋白质含量是由布拉德福德的方法。接下来,蛋白质样本添加加载缓冲区(GenScript,中国)和在95°C加热10分钟后等量的蛋白质分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和被转移到聚偏二氟乙烯膜。膜被封锁在TBST缓冲5% BSA(150毫米氯化钠,50 mM Tris-HCl, 0.5%渐变20 (pH值7.6))在室温下2 h和孵化主要抗体在4°C 16 h和二次抗体(美国热费希尔科学)在室温下2 h。最后,膜被暴露于一个ECL试剂(不合格品生物技术,中国)检测信号。照片拍摄使用Tanon 6200发光成像工作站(Tanon,中国)。

2.10。慢病毒Vector-Mediated GPR91 hPDLCs击倒

在hPDLCs击倒GPR91的表达,细胞转染24 h GPR91成分(25海里;GenePharma,中国)或争夺成分(25海里;GenePharma,中国)作为一个消极的控制与Envirus™(Engreen生物系统)根据制造商的协议。培养基是完全培养基24 h后所取代。至少72 h转染后细胞被用于后续的测试。在这项研究中使用的成分的序列如下:控制成分(shNC) 5 - - - - - -GGAGTTATGCCAATGGAAACT-3 ,GPR91基因成分,5 - - - - - -GGAGTTATGCCAATGGAAACT-3 。

2.11。统计分析

以上数据表示为 。所有使用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。一个未配对 - - - - - -测试或单向方差分析是用来评估两组之间的差异统计学意义;SNK事后测试组中查出了显著差异进行了一次。 被设置为统计显著性水平。所有的统计图表与GraphPad棱镜产生7 (GraphPad软件有限公司、美国)。

3所示。结果

3.1。缺氧促进hPDLC扩散、迁移和骨生成

首先,表达分开牙周韧带细胞的表面标记流式细胞术,表明牙周韧带细胞不表达造血的表面标记(CD11b和CD45),而不到40%的细胞表现出间充质干细胞(MSC)表面标记(CD90、CD29)(图1(一));因此,我们作为人类牙周韧带细胞分离细胞特征(hPDLCs)。

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图1
缺氧促进增殖、迁移和在hPDLCs成骨分化。分开牙周韧带细胞通过流式细胞术,表现出积极的表达msc (a)的标志。hPDLCs培养normoxia和缺氧可视化使用显微镜在24小时(b)。hPDLCs扩散被CCK8试验评估在24小时(c),细胞cycle-related基因的转录是由qPCR 4 h (d)。Scratch-healing模型用于确定在24小时hPDLC迁移能力,和愈合/受伤面积比计算( )(e),高山染色进行细胞培养的成骨的介质后7天(f)。osteogenesis-related基因的mRNA分析了24小时qPCR ( )(g),蛋白质表达的高山,RUNX2,并在72 h Col-1化验了免疫印迹;这些墨迹是代表三个独立实验(h)。 ,相对于控制; ,相对于控制。

检查假设外生hPDLCs琥珀酸能促进生物活性,我们首先探讨缺氧调节在hPDLC扩散的影响,移民和成骨分化。hPDLCs培养处于缺氧状态时的1%224 h,在显微镜下他们的扩散是显著提高(图1 (b)),也被证实在CCK-8分析(图1 (c))。此外,mRNA转录CCND1、CCNB1 CCND3, P21,分子与细胞周期有关,所有增加(图一致1 (d))。然后,我们测量hPDLC迁移自愈能力通过引入迁移测试。通过测量愈合/受伤区域的比例,我们观察到的值是显著增加缺氧组normoxia组相比,表明缺氧促进细胞迁移能力(图1 (e))。最后,以确定缺氧hPDLCs的成骨能力的影响,采用碱性磷酸酶(ALP)染色试验。我们发现更多的ALP-positive细胞培养后观察细胞缺氧(图7天1 (f))。缺氧的影响在使用qPCR hPDLC成骨分化进一步评估,表明缺氧治疗增强骨钙蛋白的转录(OCN)和高山,成骨细胞分化(图的两个重要标记1 (g));此外,成骨培养基中培养hPDLCs缺氧增强高山的蛋白表达,RUNX2, collage-1 (COL-1)(图1 (h))。

3.2。缺氧增强琥珀酸积累和稳定HIF-1α

在缺氧,HIF-1α负责各种基因的诱导,包括糖酵解和骨生成18]。首先,利用比色测定来研究细胞内琥珀酸的水平,我们观察到在早在2 h,琥珀酸和琥珀酸积累的细胞溶质hypoxia-treated细胞可以不断发现观察时间点(图2(一个))。此外,基因参与OxPhos和糖酵解与增加转录是由缺氧改变己糖激酶2 (HK2) 6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2 6-biphosphatase 3 (PFKB3)和琥珀酸脱氢酶(SDH)(图2 (b))。此外,蛋白质含量HK2和PFKB3 SDH减弱时升高(图2 (c))。此外,我们还发现缺氧治疗后SDH活性的变化,我们观察到SDH活性抑制缺氧(图下2 (d))。琥珀酸氧化成延胡索酸酯代谢,SDH和SDH活性受损可能导致琥珀酸积累(13]。我们还研究了蚀变PHD2 HIF-1α水平,发现PHD2 HIF-1时减少α在hypoxia-treated升高细胞(图2 (e))。

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图2
缺氧文化增强细胞内琥珀酸积累和稳定HIF-1α。水平的细胞内琥珀酸琥珀酸在细胞溶解产物被检测到的比色测定(a),己糖激酶2 (HK2) 6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2 6-biphosphatase 3 (PFKFB3)和琥珀酸脱氢酶(SDH)转录4 h qPCR测定( )(b),蛋白表达检测到免疫印迹在24 h (c), SDH活动6 h被ELISA (d)测量。PHD2和HIF-1的蛋白质含量α测量通路通过免疫印迹2 h (e),墨迹代表3个独立的测试。 ,相对于控制; ,相对于控制。
3.3。琥珀酸补充引起胞内Pseudohypoxia条件促进hPDLCs扩散

高水平的细胞溶质中琥珀酸可以降低博士活动产物抑制和促进HIF-1α稳定(19]。然后,我们探讨是否琥珀酸补充剂可能会促进细胞增殖和诱导PHD2退化和HIF-1α稳定,被定义为“pseudohypoxia”[14]。hPDLCs服用0 1 5,琥珀酸和25毫米的24 h, 48 h, h, 72和96 h。1和5毫米的琥珀酸增加干细胞增殖在显微镜(图3(一个))和CCK-8分析,而扩散(图25毫米减少3 (b))。同样,细胞周期和增殖基因、CCND1 CCNB1, CCND3, P21,调节后(图4 h(琥珀酸治疗3 (c))。此外,琥珀酸5毫米增加干细胞移植在伤口划模型中,在25毫米没有改变愈合过程(图3 (d))。

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图3
外生琥珀酸促进增殖、迁移和在hPDLCs骨生成。hPDLCs服用0 1 5或琥珀酸的25毫米。相差显微镜下观察细胞增殖在24 h (a)。CCK-8试验是用来量化细胞生长的细胞cycle-related基因转录(b)。4 h被qPCR检测(c) Scratch-healing模型。利用分析细胞迁移在24 h (d)。成骨分化是评估使用高山染色后7天内和茜素红S染色后21天(e, f)。osteogenesis-related基因水平hPDLCs分析qPCR在24小时( )(g),蛋白表达检测到免疫印迹在72 h (h)。屁股代表3个独立的测试。 ,相对于控制; ,相对于控制。

此外,hPDLCs培养在succinate-supplemented(0、1、5、25毫米),7天内成骨的媒介,高山和茜素红染色利用琥珀酸补充剂的成骨的能力进行评估。ALP-positive细胞琥珀酸和钙沉积增加5毫米,这表明琥珀酸能促进hPDLC成骨分化(数字3 (e)和3 (f))。此外,琥珀酸治疗5毫米24 h提高mRNA水平的OCN,高山,RUNX2, COL-1(图3 (g)琥珀酸),补充促进了高山的蛋白表达,RUNX2, COL-1(图3 (h))。

琥珀酸可以释放到细胞外空间从细胞质中,琥珀酸也可能进入胞液。然后我们决定水平的细胞内和细胞外琥珀酸和琥珀酸治疗hPDLCs后。琥珀酸浓度细胞溶质爬在早期阶段的琥珀酸刺激,达到6 h,然后拒绝之后(图4(一))。相比之下,琥珀酸浓度在细胞外空间下降随着时间的推移succinate-treated细胞(图4 (b))。符合细胞溶质中琥珀酸升高,HIF-1的蛋白质水平α增加,而博士的水平降低(图4 (c))。然后,glycolysis-related基因的变化进行了分析。HK2和PFKFB3都升高与琥珀酸补充(数字4 (d)和4 (e))。此外,观察到SDH转录升高4 h,而SDH蛋白质水平降低succinate-supplemented hPDLCs(数字4 (d)和4 (e))。此外,减少SDH酶活性被发现在5毫米succinate-treated细胞(图4 (f))。因此,我们目前的数据表明,外生琥珀酸可以被转移到细胞溶质,诱导博士抑制,导致和HIF-1 pseudohypoxia条件α稳定。因此,这种HIF-1α琥珀酸途径激活关键在supplement-induced干细胞增殖。

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图4
琥珀酸琥珀酸补充引起胞内积累,pseudohypoxia条件和糖酵解。细胞溶解产物和细胞外的细胞内琥珀酸琥珀酸在上层清液进行了评估( )(a, b), PHD2和HIF-1的变化α琥珀酸治疗后2小时被免疫印迹(c)测定。基因的信使rna和蛋白质参与OxPhos和糖酵解分析由qPCR 4 h和24小时通过免疫印迹,分别(d, e)。SDH活性以ELISA 6 h后刺激( )(f)。屁股代表3个独立的测试。 ,相对于控制; 相对于控制。
3.4。HIF-1α激活负责hPDLCs扩散在缺氧和琥珀酸的补充

为了进一步描述是否HIF-1α激活触发器hPDLCs扩散,我们利用湾87 - 2243,HIF-1的抑制剂α,抑制HIF-1α途径激活。3 h后湾87 - 2243预处理,缺氧和琥珀酸刺激未能诱导HK2的表达,PFKFB3, SDH(图5(一个))。持续、缺氧和琥珀酸治疗无法诱导细胞的表达没有HIF-1 cycle-related基因α(图5 (b))。综上所述,我们的研究结果表明,缺氧和succinate-induced HIF-1α稳定增加糖酵解和hPDLCs扩散。

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图5
阻塞HIF-1α受影响的基因参与糖酵解和扩散hPDLCs在缺氧孵化和琥珀酸的补充。hPDLCs的先决条件是块HIF-1湾87 - 2243α3 h。代谢的变化和细胞cycle-related基因4 h后缺氧/琥珀酸治疗被qPCR测量( )(a, b)。 ,相对于控制; ,相对于控制。
3.5。琥珀酸作为一个细胞外介质信号通过GPR91-Dependent GPR91-Independent途径

如图所示在我们的研究中,琥珀酸可以穿过细胞膜,即。,在胞质。此外,琥珀酸可以绑定到琥珀酸受体,也称为GPR91,功能作为自分泌和旁分泌传感器调节细胞信号转导20.,21]。之前确认的角色GPR91缺氧,我们探讨了细胞外琥珀酸浓度下的缺氧。因此,我们发现琥珀酸浓度在细胞外环境hypoxia-treated hPDLCs高6 h和价值并非不同于normoxia控制24 h后(图6(一))。GPR91 4 h后调节缺氧/琥珀酸(5毫米)治疗(数字6 (b)和6 (c))。这些结果表明,琥珀酸内生和外生琥珀酸都可以激活GPR91。

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图6
琥珀酸补充触发GPR91-dependent GPR91-independent通路。细胞外琥珀酸浓度在上层清液中检测出hypoxia-cultured细胞(a)。分析了GPR91的表达qPCR和免疫印迹4 h和24 h,分别(b, c)。慢病毒为基础的基因干扰是利用击倒GPR91 (d),基因转录是由qPCR 4 h (e)。 ,相对于控制; ,相对于控制。

探索GPR91在缺氧/ succinate-induced干细胞增殖,我们利用lentivirus-mediated GPR91击倒。hPDLCs与GPR91转染核或小干扰rna(图争夺6 (d))。代谢相关基因的表达和细胞cycle-related基因GPR91击倒的缺氧治疗组明显降低(图6 (e)),这表明低氧诱导代谢变化和扩散增强与琥珀酸GPR91通过自分泌通路的激活。然而,琥珀酸supplement-induced glycolysis-related改变和细胞cycle-involved基因不受GPR91击倒,这表明高层外生琥珀酸可以绕过GPR91,直接穿过细胞膜GPR91-independent通路(图产生生物效应6 (e))。

4所示。讨论

保持自我更新能力和分化能力是至关重要的扩张和成功使用干细胞在临床实践(22]。在这项研究中,我们发现hypoxia-promoted hPDLC增殖和迁移是由琥珀酸积累和HIF-1α途径激活。此外,第一次,我们发现琥珀酸补充增强扩散通过创建一个pseudohypoxia PHD2抑制和HIF-1状态α稳定,我们发现低氧诱导扩散增强GPR91-dependent succinate-elicited扩散GPR91-independent时。

类似于先前的报道(17琥珀酸),代谢反应取决于其浓度。高浓度的琥珀酸补充仍减少细胞生存能力,和这样的抑制作用可能与以下机制:琥珀酸积累在细胞溶质和线粒体可能激活半胱天冬酶3或半胱天冬酶7凋亡通路(23];琥珀酸可以抑制2-oxoglutarate-dependent组蛋白和DNA demethylase酶,导致表观遗传沉默(24];此外,蛋白质succination小说稳定的转译后的改性途径,也可能改变蛋白质动力学(25];此外,细胞内琥珀酸积累丰富的代ROS的线粒体可能导致大分子损伤,包括DNA、蛋白质和细胞器损伤(26]。

PHD2是nonheme含铁分子,其活动依赖α酮戊二酸/ 2-oxoglutarate。PHD2一贯羟化HIF-1α脯氨酸残基402年和564年在胞质,从而抑制其核易位。羟化HIF-1α链接到冯Hippel-Lindau蛋白质(pVHL), E3泛素连接酶,导致HIF-1退化α蛋白酶体。螯合铁2 +在这个由CoCl蛋白质2和去铁胺否定PHD2正常活动;然而,由于铁是必不可少的许多含铁蛋白质,螯合铁2 +可能有多个副作用(27]。利用分子氧PHD2-mediated羟基化反应;一个原子转移到脯氨酸残基,另一个是利用氧化α酮戊二酸为琥珀酸的释放有限公司2(28,29日]。这两个α酮戊二酸和琥珀酸柠檬酸循环中间体(19]。在我们目前的研究中,琥珀酸的补充细胞溶质可以穿过细胞膜,导致细胞质中的琥珀酸水平升高;琥珀酸积累PHD2活动和减少α酮戊二酸的氧化产物抑制(30.]。基于hypoxia-PHD-HIF-1之间的内在关系α首次和低氧代谢变化,我们建议可以用来引出HIF-1琥珀酸补充α途径激活。

进一步揭开琥珀酸积累在细胞溶质的作用,我们观察到抑制HIF-1α湾影响细胞周期和glycolysis-related基因在缺氧和琥珀酸的补充下,表明HIF-1α介导缺氧和hPDLCs succinate-accelerated扩散。然而,柠檬酸循环代谢不同缺氧和琥珀酸的补充。琥珀酸柠檬酸循环,由SDH(转换为延胡索酸酯19利用时尚和NAD)+代数余子式(31日]。因此,琥珀酸积累可以提高SDH表达式由基质和活动的刺激。相比之下,缺氧本身会抑制SDH活性导致琥珀酸积累(13]。我们的数据表明,琥珀酸作为细胞内信使,诱导基因表达的改变通过抑制PHD2 hPDLCs活动HIF-1稳定α,创建一个pseudohypoxia的状态。

msc的行为是非常受到养分有效性的影响,培养利基和代谢状态(26]。无氧糖酵解在缺氧条件下具备干细胞帮助维持msc虽然OxPhos可能增加成骨分化的32]。抑制了SDH活性和增强HK2以及PFKB3蛋白表达表明,琥珀酸补充糖酵解代谢从OxPhos转向。这种代谢变化可能有助于保持液晶具备干细胞体外。此外,具备干细胞是新陈代谢调制nutrient-sensing通路,如哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)、腺苷5 - - - - - -一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)和sirtuins蛋白(SIRT) [33]。当然,msc驻留在一个利基缺氧和缺乏足够的血液供应。我们当前的琥珀酸补充改变正常的营养平衡和可用性,因为琥珀酸可能被代谢成延胡索酸酯生成三磷酸腺苷和转向“GABA分流”的燃料谷氨酰胺通路(34]。这种代谢变化需要进一步证实了seahorse-based生物能量学试验和大规模spectrometry-based代谢组学。还需要进一步的研究来阐明琥珀酸补充剂是否可能改善PDLFs体外具备干细胞或妥协。

在我们目前的研究中,琥珀酸补充增强扩散在正常文化和促进骨的成骨的媒介,这是类似于hPDLCs缺氧状态下(35]。虽然很大一部分关于msc的文献表明,缺氧环境有利于细胞扩张和具备干细胞成骨分化的影响仍然是争论,与降低(32,36)和增强(37- - - - - -39成骨分化被报告。这样的争论关于这个重要的问题可能与不同的文化系统,如供体物种,细胞类型(胚胎、造血和组织特定的干细胞),严重缺氧,感应的方法(32,40]。在我们的研究中,琥珀酸补充可能被氧化成延胡索酸酯产生ATP或转向“GABA分流”燃料谷氨酰胺通路(34),从而保持活跃的高增殖所需的糖酵解pseudohypoxic状态在骨的早期阶段,提高骨基质蛋白质生物合成在后期。由于代谢状态,即。,OxPhos or anaerobic glycolysis, is closely related to proliferation and osteogenesis [32),生物能量学试验会对琥珀酸补充剂中代谢调节hPDLCs以及其他msc。此外,HIF-1互动α切口和核转录因子-κB通路在骨生成琥珀酸补充期间需要进一步研究。

细胞外的琥珀酸可能绑定到特定的受体GPR91,外代谢信号传送至胞质和核41]。GPR91琥珀酸活化,导致大量的钙和信号通过增殖蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C (PKC)通路,导致分泌的增加和生产活性氧(34),促进炎症反应和促进细胞增殖42]。在我们目前的研究中,我们观察到高浓度的琥珀酸在hPDLCs细胞溶质和文化上层清液,上调GPR91表达式。击倒GPR91减少hypoxia-mediated扩散,表明低氧诱导增殖依赖于GPR91。

琥珀酸之间自由移动线粒体和细胞溶质通过二羧酸转运蛋白在线粒体内膜和压敏电阻器阴离子通道(VDAC /孔蛋白)在线粒体外膜19]。它已经表明,细胞外的琥珀酸可以运输到胞质和线粒体的等离子体膜结合Na+端依赖二羧酸转运NaDC3 (SLC13A3基因)43]。因此,琥珀酸(5毫米)的补充可能促进NaDC3-mediated胞内运输,导致不断堆积在细胞质和线粒体琥珀酸,琥珀酸,清楚地解释了补充PDLFs在当下研究的促进细胞增殖。这样跨膜运动由NaDC3表示,琥珀酸supplement-enhanced扩散的主要机制是其进入胞液稳定HIF-1α,这是不同于GPR91-dependent通路在缺氧条件下。

琥珀酸的补充是类似于琥珀酸代谢在缺血再灌注模型,和琥珀酸升高可能上调SDH转录substrate-enzyme互动(44),导致增强的SDH转录如图4 (d)。如图4(一)琥珀酸,细胞内水平达到6 h;这种高浓度的细胞内琥珀酸可能显著影响其蛋白表达和活动由几个可能的机制:琥珀酸可能稳定HIF-1α模拟低氧状态,触发低氧C-to-U编码RNA编辑(45],miRNA-mediated表观遗传调控也可能导致转录修改(46];此外,广泛的ROS生成由反向电子传递(RET)在线粒体琥珀酸氧化过程中复杂我可能严重影响减少NAD的可用性+SIRT3和改变活动,影响SDH NAD-dependent脱乙酰酶酶活性(47];此外,在线粒体琥珀酸积累可能会增加itaconate水平,进一步抑制SDH活性(46]。

总之,我们观察到缺氧促进hPDLC增殖,迁移,并通过细胞内成骨分化succinate-induced HIF-1α稳定和细胞外succinate-caused GPR91激活。此外,外源琥珀酸可以作为模拟信号,导致“pseudohypoxia”条件增强hPDLCs扩散。我们目前的研究发现琥珀酸,柠檬酸循环的代谢物,可以利用糖酵解正常条件下氧燃料。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有金融和非金融的利益冲突。

确认

本研究由国家自然科学基金支持的中国(81670996)、南京医学科学技术发展基金会(QRX17025 QRX17081)和江苏省自然科学基金(BK20171122)。

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