hPDLCs分离,并使用外植体培养技术。短暂,牙齿是来自前磨牙的主题(平均年龄:13岁)需要矫正治疗,从每个参与者获得知情同意。自由人民党的组织是头皮从根表面的三分之一,在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(美国Gibco DMEM)含10% v / v 胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1%青霉素和链霉素在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。媒介改变了3天后,长大在大约80%融合细胞通道。细胞在第三到第五章节被用于这项研究。

hPDLCs被确定通过流式细胞术使用抗体CD11b, CD90、CD45、CD29。hPDLCs ( 2。5 × 10 5 / 毫升 第三段)被放置在1.5毫升埃普多夫管和PBS洗两次。接下来,异硫氰酸荧光素(FITC)共轭或藻红蛋白——(PE)共轭anti-CD11b anti-CD90, anti-CD45, anti-CD29抗体被添加到hPDLC样品和孵化在室温下在黑暗中30分钟。细胞的百分比积极沾CD11b, CD90、CD45、CD29评估fluorescence-activated细胞排序。

1 × 10 6 细胞被镀在10厘米。细胞培养在正常氧条件或缺氧条件(1%氧气)在低氧室(美国热科学)。如果氧张力超过所需的水平,氮气是自动注入系统代替多余的氧气。琥珀酸补充集团琥珀酸钠氢六水合物(美国Sigma-Aldrich)添加到指定浓度的培养基(1、5或25毫米)。抑制HIF-1 α活动,hPDLCs HIF-1使用 α特殊技能抑制剂湾87 - 2243(5海里;美国莱克)3 h。

hPDLCs被播种密度 2 × 10 3 细胞 /到96孔板和培养24小时。琥珀酸测定的影响或缺氧hPDLCs的扩散,细胞琥珀酸处理(0、1、5、25毫米)24 h, 48 h, 72 h和96 h或缺氧(1%啊₂为24小时)。细胞增殖与细胞计数评估Kit-8 (CCK-8) (Dojindo、日本)。在CCK-8分析中,CCK-8添加2 h在37°C和吸光度测定使用450纳米波长的标。

hPDLCs镀和增长 3 × 10 5 细胞/在6-well盘子准备五个直线在24 h。然后,抓机械地执行了20 μL移液枪垂直于基地的五行。细胞培养的另一个24小时琥珀酸(0、1、5、25毫米)或缺氧(1%啊₂)处理和可视化与倒置显微镜(日本尼康)。

hPDLCs被播种在24-well板的密度 2。5 × 10 4 细胞/好,孵化成骨的媒介,这是补充50毫克/毫升抗坏血酸,100海里地塞米松,10毫米 β甘油磷酸盐为7天。媒介是改变每48 h。细胞被用磷酸盐溶液(美国Gibco PBS) 3倍和4%的多聚甲醛固定剂处理30分钟。然后,盘子又洗了PBS和孵化在室温下使用BCIP /电视台碱性磷酸酶颜色开发工具包(Beyotime,中国)30分钟相应比例的解决方案根据制造商的指示。

钙沉积被茜素红S染色检测。hPDLCs培养在 5 × 10 4 细胞/在12-well文化板块的21天成骨的媒介。细胞被冲洗两次与PBS和固定在10%甲醛10分钟。细胞被洗,染色茜素红S(美国Sigma-Aldrich)在室温下20分钟。用去离子水清洗多余染料被轻轻直到背景变得明朗。

细胞外和细胞内琥珀酸浓度测量与琥珀酸比色测定试剂盒(Megazyme,爱尔兰)根据制造商的指示。简单地说,条件中收集和处理显示代理。测量细胞内琥珀酸和琥珀酸脱氢酶活性,细胞与冻融循环处理,收集细胞溶解产物。然后,细胞溶菌作用的解决方案是离心机在每分钟1500发2分钟去除碎片。琥珀酸脱氢酶活性检测与琥珀酸脱氢酶酶联免疫试剂盒(JinYibai,中国)根据制造商的协议。

hPDLCs被播种在6-well板的密度 3 × 10 5 细胞缺氧/好,处理条件(1%啊₂琥珀酸)或(0,1,5更易/ L) 4 h。的总RNA提取RNeasy +迷你包(Tiangen,中国)。逆转录反应了1 μg使用互补脱氧核糖核酸合成的RNA设备(Vazyme,中国)。然后,cDNA与引物混合(GenScript,中国)和最大值®SYBR绿/火箭qPCR大师混合(热费希尔科学)根据制造商的协议并受实时PCR ViiA™7实时PCR系统(美国热费希尔科学)。 β肌动蛋白作为内部参考基因,和数据分析 2 − Δ Δ Ct 方法。结果显示为目标基因的相对表达比参考基因。引物的序列是列在表中 1。

显示治疗后,收集细胞细胞溶解•瑞帕在冰上裂解缓冲了15分钟。蛋白质含量是由布拉德福德的方法。接下来,蛋白质样本添加加载缓冲区(GenScript,中国)和在95°C加热10分钟后等量的蛋白质分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和被转移到聚偏二氟乙烯膜。膜被封锁在TBST缓冲5% BSA(150毫米氯化钠,50 mM Tris-HCl, 0.5%渐变20 (pH值7.6))在室温下2 h和孵化主要抗体在4°C 16 h和二次抗体(美国热费希尔科学)在室温下2 h。最后,膜被暴露于一个ECL试剂(不合格品生物技术,中国)检测信号。照片拍摄使用Tanon 6200发光成像工作站(Tanon,中国)。

在hPDLCs击倒GPR91的表达,细胞转染24 h GPR91成分(25海里;GenePharma,中国)或争夺成分(25海里;GenePharma,中国)作为一个消极的控制与Envirus™(Engreen生物系统)根据制造商的协议。培养基是完全培养基24 h后所取代。至少72 h转染后细胞被用于后续的测试。在这项研究中使用的成分的序列如下:控制成分(shNC) 5 ′ -GGAGTTATGCCAATGGAAACT-3 ′ GPR91基因成分,5 ′ -GGAGTTATGCCAATGGAAACT-3 ′ 。

以上数据表示为 意味着 ± 标准 偏差 。所有使用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。一个未配对 t 以及或单向方差分析被用来评估两组之间的差异统计学意义;SNK事后测试组中查出了显著差异进行了一次。 p < 0.05 被设置为统计显著性水平。所有的统计图表与GraphPad棱镜产生7 (GraphPad软件有限公司、美国)。

首先,表达分开牙周韧带细胞的表面标记流式细胞术,表明牙周韧带细胞不表达造血的表面标记(CD11b和CD45),而不到40%的细胞表现出间充质干细胞(MSC)表面标记(CD90、CD29)(图 1(一));因此,我们作为人类牙周韧带细胞分离细胞特征(hPDLCs)。

检查假设外生hPDLCs琥珀酸能促进生物活性,我们首先探讨缺氧调节在hPDLC扩散的影响,移民和成骨分化。hPDLCs培养处于缺氧状态时的1%₂24 h,在显微镜下他们的扩散是显著提高(图 1 (b)),也被证实在CCK-8分析(图 1 (c))。此外,mRNA转录CCND1、CCNB1 CCND3, P21,分子与细胞周期有关,所有增加(图一致 1 (d))。然后,我们测量hPDLC迁移自愈能力通过引入迁移测试。通过测量愈合/受伤区域的比例,我们观察到的值是显著增加缺氧组normoxia组相比,表明缺氧促进细胞迁移能力(图 1 (e))。最后,以确定缺氧hPDLCs的成骨能力的影响,采用碱性磷酸酶(ALP)染色试验。我们发现更多的ALP-positive细胞培养后观察细胞缺氧(图7天 1 (f))。缺氧的影响在使用qPCR hPDLC成骨分化进一步评估,表明缺氧治疗增强骨钙蛋白的转录(OCN)和高山,成骨细胞分化(图的两个重要标记 1 (g));此外,成骨培养基中培养hPDLCs缺氧增强高山的蛋白表达,RUNX2, collage-1 (COL-1)(图 1 (h))。

在缺氧,HIF-1 α负责各种基因的诱导,包括糖酵解和骨生成 18]。首先,利用比色测定来研究细胞内琥珀酸的水平,我们观察到在早在2 h,琥珀酸和琥珀酸积累的细胞溶质hypoxia-treated细胞可以不断发现观察时间点(图 2(一个))。此外,基因参与OxPhos和糖酵解与增加转录是由缺氧改变己糖激酶2 (HK2) 6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2 6-biphosphatase 3 (PFKB3)和琥珀酸脱氢酶(SDH)(图 2 (b))。此外,蛋白质含量HK2和PFKB3 SDH减弱时升高(图 2 (c))。此外,我们还发现缺氧治疗后SDH活性的变化,我们观察到SDH活性抑制缺氧(图下 2 (d))。琥珀酸氧化成延胡索酸酯代谢,SDH和SDH活性受损可能导致琥珀酸积累( 13]。我们还研究了蚀变PHD2 HIF-1 α水平,发现PHD2 HIF-1时减少 α在hypoxia-treated升高细胞(图 2 (e))。

高水平的细胞溶质中琥珀酸可以降低博士活动产物抑制和促进HIF-1 α稳定( 19]。然后,我们探讨是否琥珀酸补充剂可能会促进细胞增殖和诱导PHD2退化和HIF-1 α稳定,被定义为“pseudohypoxia”[ 14]。hPDLCs服用0 1 5,琥珀酸和25毫米的24 h, 48 h, h, 72和96 h。1和5毫米的琥珀酸增加干细胞增殖在显微镜(图 3(一个))和CCK-8分析,而扩散(图25毫米减少 3 (b))。同样,细胞周期和增殖基因、CCND1 CCNB1, CCND3, P21,调节后(图4 h(琥珀酸治疗 3 (c))。此外,琥珀酸5毫米增加干细胞移植在伤口划模型中,在25毫米没有改变愈合过程(图 3 (d))。

此外,hPDLCs培养在succinate-supplemented(0、1、5、25毫米),7天内成骨的媒介,高山和茜素红染色利用琥珀酸补充剂的成骨的能力进行评估。ALP-positive细胞琥珀酸和钙沉积增加5毫米,这表明琥珀酸能促进hPDLC成骨分化(数字 3 (e)和 3 (f))。此外,琥珀酸治疗5毫米24 h提高mRNA水平的OCN,高山,RUNX2, COL-1(图 3 (g)琥珀酸),补充促进了高山的蛋白表达,RUNX2, COL-1(图 3 (h))。

琥珀酸可以释放到细胞外空间从细胞质中,琥珀酸也可能进入胞液。然后我们决定水平的细胞内和细胞外琥珀酸和琥珀酸治疗hPDLCs后。琥珀酸浓度细胞溶质爬在早期阶段的琥珀酸刺激,达到6 h,然后拒绝之后(图 4(一))。相比之下,琥珀酸浓度在细胞外空间下降随着时间的推移succinate-treated细胞(图 4 (b))。符合细胞溶质中琥珀酸升高,HIF-1的蛋白质水平 α增加,而博士的水平降低(图 4 (c))。然后,glycolysis-related基因的变化进行了分析。HK2和PFKFB3都升高与琥珀酸补充(数字 4 (d)和 4 (e))。此外,观察到SDH转录升高4 h,而SDH蛋白质水平降低succinate-supplemented hPDLCs(数字 4 (d)和 4 (e))。此外,减少SDH酶活性被发现在5毫米succinate-treated细胞(图 4 (f))。因此,我们目前的数据表明,外生琥珀酸可以被转移到细胞溶质,诱导博士抑制,导致和HIF-1 pseudohypoxia条件 α稳定。因此,这种HIF-1 α琥珀酸途径激活关键在supplement-induced干细胞增殖。

为了进一步描述是否HIF-1 α激活触发器hPDLCs扩散,我们利用湾87 - 2243,HIF-1的抑制剂 α,抑制HIF-1 α途径激活。3 h后湾87 - 2243预处理,缺氧和琥珀酸刺激未能诱导HK2的表达,PFKFB3, SDH(图 5(一个))。持续、缺氧和琥珀酸治疗无法诱导细胞的表达没有HIF-1 cycle-related基因 α(图 5 (b))。综上所述,我们的研究结果表明,缺氧和succinate-induced HIF-1 α稳定增加糖酵解和hPDLCs扩散。

如图所示在我们的研究中,琥珀酸可以穿过细胞膜,即。,在胞质。此外,琥珀酸可以绑定到琥珀酸受体,也称为GPR91,功能作为自分泌和旁分泌传感器调节细胞信号转导 20., 21]。之前确认的角色GPR91缺氧,我们探讨了细胞外琥珀酸浓度下的缺氧。因此,我们发现琥珀酸浓度在细胞外环境hypoxia-treated hPDLCs高6 h和价值并非不同于normoxia控制24 h后(图 6(一))。GPR91 4 h后调节缺氧/琥珀酸(5毫米)治疗(数字 6 (b)和 6 (c))。这些结果表明,琥珀酸内生和外生琥珀酸都可以激活GPR91。

探索GPR91在缺氧/ succinate-induced干细胞增殖,我们利用lentivirus-mediated GPR91击倒。hPDLCs与GPR91转染核或小干扰rna(图争夺 6 (d))。代谢相关基因的表达和细胞cycle-related基因GPR91击倒的缺氧治疗组明显降低(图 6 (e)),这表明低氧诱导代谢变化和扩散增强与琥珀酸GPR91通过自分泌通路的激活。然而,琥珀酸supplement-induced glycolysis-related改变和细胞cycle-involved基因不受GPR91击倒,这表明高层外生琥珀酸可以绕过GPR91,直接穿过细胞膜GPR91-independent通路(图产生生物效应 6 (e))。