P物质心梗后上调小眼相关转录因子，GATA4管理的，和c-Kit的扩展⁺细胞

摘要

微邻苯二甲酸相关转录因子(microphthalmi -associated transcription factor, MITF)是一种基本的螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链式转录因子，通过结合靶基因启动子区域的E box元件来调控基因表达。虽然在心肌细胞和心脏中观察到高水平的MITF，但心肌梗死(MI)后MITF的作用尚不清楚。我们研究了P物质(SP)/神经激肽-1受体(NK)之间的关系₁雄性Sprague-Dawley大鼠(8周)随机分为缺血/再灌注损伤(I/R)和SP注射(5 nmol/kg, SP+I/R)两组。7天结束时，左心室(LV;LV^{7 daysi / R},LV^{7daysSP + I / R}和梗死相关区域(IA;IA^{7 daysi / R},^{7daysSP + I / R}）从心脏收集。免疫荧光染色表明，LV^{7daysSP + I / R}有更多的c-Kit人群⁺GATA4^高显著上调MITF、c-Kit和GATA4。的c-Kit⁺外植来源细胞(EDCs)来源于IA^{7daysSP + I / R}比EDCs的IA迁移更广泛^{7 daysi / R}。免疫荧光染色、western blot和qRT-PCR检测结果显示，sp处理后的c-Kit检测结果为阳性⁺细胞显示c-Kit、GATA4和MITF高表达。FTY720 (MITF抑制剂)，RP67580 (NK)₁或均抑制c-Kit的迁移和增殖⁺SP细胞增加，抑制c-Kit、GATA4和MITF的上调。总的来说，我们认为MITF可能是sp介导的c-Kit的潜在调节因子⁺通过c-Kit和GATA4进行mi后细胞扩增。

1.介绍

心脏衰竭（HF）预计将成长为一个重要的临床和公共卫生挑战。HF响应于高血压和从冠状动脉疾病心肌梗死，因此引起左心室（LV）重塑[发生1，2]。尽管心脏生长、心肌肥厚和左室重构的机制尚不清楚，但它们之间复杂的相互作用可能涉及内源性常驻c-Kit⁺细胞和心肌细胞因直接损伤而丢失[3-五]。例如，内皮素-1，血管紧张素II，利钠肽，和/或α1,β-肾上腺素能激动剂可能在心脏重构中发挥重要的调节作用[4]。心脏转录因子（如GATA4，Nkx2.5的，TBX5，和MEF2）和染色质重塑酶也参与成人心脏的应力调节[五，6]。因此，更准确地了解梗死后左室重构中转录调控的分子机制将有助于开发新的心力衰竭治疗策略。

微邻苯二甲酸相关转录因子(Microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是一种螺旋-环-螺旋碱性亮氨酸拉链dna结合蛋白，被认为是一种主转录因子，已在各种类型的细胞中检测到，如黑素细胞、肥大细胞和破骨细胞[7-10]。就心脏而言，MITF-H，心脏特异性亚型，在心肌细胞中大量表达，在肥厚反应中很重要[7-10]。MITF-mutated老鼠(MITF^{CE / CE}与野生型小鼠相比，缺少MITF Zip域的ce/ce突变小鼠心脏重量/体重比、收缩功能和心输出量显著降低[7]。之前的研究表明MITF通过靶向miR-541调节心脏肥厚[10]。根据这些研究，MITF对于心脏生长和肥厚反应至关重要，尽管最近发现的与MITF相关的基因和信号通路很少[7-10]。

神经肽物质P (SP)是速激肽神经肽家族的十一肽成员[11-14]。研究发现SP通过神经激肽-1受体(NK)在许多生物过程中起神经调节作用₁R）[11-14]。之前的研究描述了SP/NK的重要作用₁R在心血管系统中的作用[11-14]。有几项研究指出SP对心肌缺血/再灌注损伤(I/R)具有保护作用[11-14]。然而，SP / NK的作用₁之后我的心脏修复过程[R信号/ R仍不清楚。我们以前的研究表明，SP防止I / R通过调节干细胞动员[12]。本研究探讨了外源性SP如何影响I/R后受损LV的愈合。为此，我们分析了使用或不使用SP治疗的I/R大鼠左室和梗死相关区域(IA)心脏干细胞特异性基因表达及相关因素。

2。材料和方法

2.1。材料

SP (6.7μg/kg/0.1 ml) and FTY720 (a sphingosine 1-phosphate receptor agonist that inhibits the expression of MITF) [15均购自Sigma公司(美国密苏里州圣路易斯)。RP67580 (RP，选择性非肽速激肽NK)₁R antagonist, 1 mg/kg) was obtained from R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Phospho-MITF (ser180) antibody, Hoechst 33342, and DAPI were purchased from Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA). AccuPower® RocketScript™ Cycle RT PreMix (dN12) and AccuPower® ProFi Taq PCR PreMix were purchased from Bioneer (Daejeon, Korea). SYBR® Green Mix was obtained from Applied Biosystems (Lincoln, CA, USA). Antibodies specific for c-Kit (sc5535), NK₁R (sc15323)、MITF (sc56725)和actin (sc47778)来自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)。识别GATA4 (ab86371)的抗体和Alexa Fluor®二抗购自Abcam(英国剑桥)。另一种c-Kit特异性抗体(phosphor Tyr568/Tyr570)来自GeneTex (Isleworth, UK)。Phospho-Akt(4060)和Akt购自Cell Signaling Technology公司(Beverly, USA)。

2.2。动物模型和体外植向外生长培养试验

所有实验均以8周龄雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠为实验对象，根据庆熙医疗中心机构动物护理与伦理委员会(KHMC-IACUC:2015-028)进行。将SD大鼠随机分为2组( 每个):注射5 nmol/kg SP (SP+I/R) I/R和I/R。冠状动脉左前降支闭塞40min，再灌注7天，给予SP和不给予SP^{7 daysi / R},LV^{7daysSP + I / R})从心脏中采集样本。IA组织切成1 ~ 2毫米的碎片，用Ca洗涤^{2 +}/毫克^{2 +}-free PBS, and digested three times for 10 min with 0.2% trypsin and 0.1% collagenase at 37°C. IA fragments were incubated with complete medium (CM; Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% ES cell grade FBS, 5% horse serum, 10 ng/ml LIF, 1% penicillin-streptomycin, fungizone, and gentamicin) at 37°C in a 5% CO₂孵化器。2周后，贴壁细胞，其迁移出并包围的外植体中，通过免疫荧光染色（IFS）与c-kit抗体进行分析。有c-kit⁺细胞通过磁激活细胞分选（MACS）系统（Dynal公司Biotech公司，奥斯陆，挪威）纯化。植源性细胞（EDCs) were suspended in trypsin, incubated with a rabbit anti-c-Kit antibody (1 : 100), and separated using immunomagnetic microbeads (Dynal Biotech). c-Kit⁺细胞在5％CO 1个月与CM培养在37℃下₂孵化器。

2.3。的c-Kit⁺细胞增殖实验

有c-kit⁺细胞增殖测定采用EZ-Cytox细胞活力测定试剂盒(DoGEN，首尔，韩国)[16]。有c-kit⁺细胞用FTY720预处理（5 μ或RP67580 (20)μg/ml) or both for 2 h. After SP treatment for 7 days, the cultured medium was removed. Cells were stained with EZ-Cytox solution for 1 h. Absorbance was determined at 490 nm using an ELISA reader (EMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2.4。的c-Kit⁺细胞迁移分析

细胞迁移实验使用0.8μ米孔径和24孔transwell迁移室涂覆有IV型胶原蛋白（10 μ克/毫升）如先前所述[16]。 的c-Kit⁺细胞接种到上transwell培养室，培养基中不含FTY720或RP67580或两者都不含。然后，将腔室插入含有600个孔板的24孔板的每口井中μl培养基中添加或不添加指定浓度的SP，同时存在或不存在FTY720 (5)μ或RP67580 (20)μ克/毫升）或两者。The chambers were then incubated for 24 h at 37°C in a 5% CO₂孵化器。迁移到细胞膜外侧的细胞用结晶紫染色液染色。在590 nm处用ELISA阅读器(EMax;分子装置，美国加州森尼维尔)。

2.5。定量反转录PCR (qRT-PCR)

使用AccuPower®RocketScript™Cycle RT PreMix (dN12) (Bioneer, Daejeon, Korea)合成cDNA。使用SYBR®Green Mix和适当的引物(应用生物系统)进行qRT-PCR检测，并在StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统)上运行。所有数据的相关基因表达均使用ΔCt法与归一化相对于RPL-32如先前所述[16]。使用的引物如下所示：c-Kit的（正向：AGACGTACAGATCCAGAATG，反向：TGCTCTTTGCTGTTACCTT）;GATA4（正向：ACCCTGCGAGACACCCCAAT，反向：GTAGAGGCCACAGGCGTTGC）;MITF（正向：CATCACGCATCTTGCTACGC，反向：TGCATGAACTGGGCTGCCTG）;和RPL-32（正向：TGTCAAGGAGCTGGAAGTGC，反向：AGGCACACAAGCCATCTATTCA）。

2.6。IFS和共焦显微镜

用4%多聚甲醛(PFA)固定，石蜡包埋，切片切成7块μm厚切片，如前所述，用标准IFS方法染色[10，17]。检测SP处理后c-Kit或MITF的表达⁺cells were treated with SP (10 nM). After SP treatment for 1 day, the cultured medium was removed. After fixing in 4% PFA at 4°C for 15 min, cells were washed with PBS, permeabilized with 5% BSA and 0.1% Triton X-100, and incubated with primary antibodies. After nuclear DAPI and Hoechst staining, immunostained cells were imaged using an inverted Zeiss Axio Observer Z1 confocal microscope with 405, 458, 488, 514, 561, and 633 nm laser lines. All images were selected with sample identities blinded, and at least 20 random images were obtained from each well or group.

2.7。免疫印迹分析

使用TissueLyser II (Qiagen)打乱冷冻样品，然后加入含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的冰冻PRP-PREP蛋白提取液(内含子生物技术公司，首尔，韩国)，并用不锈钢微珠匀浆(Qiagen, CA，美国)。使用BCA试剂盒(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)评估蛋白浓度。相同数量的蛋白质(80μ克）从每个样品上样到10％至12％SDS凝胶，并转移到PVDF膜（默克，MA，USA）。The membranes were blocked for 2 h at room temperature with 5% nonfat dry milk in PBS containing 0.1% Tween-20 and incubated with primary antibodies (1 : 1000 and 1 : 500, respectively) overnight at 4°C. After washing three times, the membranes were incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (1 : 5000) at RT for 2 h and visualized with a chemiluminescence substrate.

2.8。统计分析

学生的-统计分析采用检验(两组之间的比较)或单因素方差分析(ANOVA)(三组或更多组之间的比较)，然后进行Tukey事后检验。SPSS软件版本。17.0 (SPSS, Chicago, IL)。的值 被认为是显著的。数据表示为 (SE)。 ， ，和 与相应的控制。所有误差条代表的三个或更多的生物学重复的标准偏差。

3.结果

3.1。SP增加了内源性常驻c-Kit⁺GATA^高I/ r损伤的LV细胞上调c-Kit、GATA4和MITF

SP促进c-Kit扩展的机制⁺心肌梗死后的细胞[14]进行分析^{7 daysi / R}和LV^{7daysSP + I / R}使用与c-Kit和GATA4抗体IFS。共聚焦图像显示的c-Kit的增加⁺GATA4⁺-表达的细胞在LV^{7daysSP + I / R}LV相比^{7 daysi / R}（数字1)。c-Kit和GATA4的表达对c-Kit的生长和迁移具有重要的促进作用⁺细胞 [17]。此外，一些关于I/ r损伤心脏的研究表明c-Kit的数量⁺细胞增加由于压力负荷所致心肌肥大[17]。有代表性的共焦图像显示MITF和GATA4或c-Kit在LV共表达^{7 daysi / R}和LV^{7daysSP + I / R}指示由SP治疗MITF表达高水平（图2和3)。MITF在导致心脏生长和心脏肥厚反应的途径中发挥关键作用(6-10)。然而，对于心肌梗死后MITF的分子机制知之甚少₁R信号导致内源性常驻c-Kit的激活⁺GATA4⁺细胞，的c-Kit，GATA4，和MITF的表达可能参与。为了检验这一点，我们分开式IA^{7 daysi / R}和IA^{7daysSP + I / R}从LV^{7 daysi / R}和LV^{7daysSP + I / R}。在mRNA和蛋白水平的c-Kit，MITF，和GATA4的表达水平通过qRT-PCR和Western印迹分析来测量。这些分析揭示在的c-Kit，GATA4，和在LV MITF表达显著增加^{7daysSP + I / R}LV相比^{7 daysi / R}（数字4)。特别是LV中的GATA表达式^{7daysSP + I / R}在mRNA水平显着增加（图4 (c))。这些结果为SP的分子途径可能诱导内源性常驻c-Kit扩增提供了证据⁺GATA4^高与c-Kit、GATA4和MITF表达相关的-表达细胞。

3.2。MITF在sp促进c-Kit的增殖和迁移中起重要作用⁺GATA^高细胞

如果SP / NK₁ř信令正调节内源性驻地的c-Kit⁺细胞1A至的c-Kit，GATA4，和MITF，然后更多的c-Kit⁺从IA细胞^{7daysSP + I / R}可能会比来自IA的移民^{7 daysi / R}。为了验证这一点，IA^{7 daysi / R}和IA^{7daysSP + I / R}使用一种培养基培养碎片体外外植体测定产物。扩大了c - kit⁺共聚焦显微镜对细胞进行了表征。共焦图像和FACS分析显示c-Kit迁移⁺从IA细胞^{7daysSP + I / R}内分泌干​​扰物是不是从IA显著较高^{7 daysi / R}在没有或存在额外的SP处理时(图)五)。为了确定SP是否影响MITF和GATA4的在的c-Kit表达⁺细胞，我们纯化的c-Kit⁺从IA细胞^{7 daysi / R}使用c-Kit抗体的MACS方法进行EDCs。纯化c - kit⁺在指定的时间点用SP处理细胞。如图所示6(一),SP-treated c - kit⁺cells markedly activated the phosphorylation of Akt at 10 min and enhanced the phosphorylation of c-Kit and MITF at 8 h. The expression of c-Kit, GATA4, and MITF induced by SP subsequently increased at 8 h (Figure6(一))。qRT-PCR显示MITF在16 h表达升高(图)6 (b))。共聚焦图像进一步证实MITF的位置和表达与c-Kit或GATA4表达有相当程度的重叠(图)6 (c)-6 (e))。接下来，我们使用RP67589和FTY720进一步验证是否的c-Kit的扩张⁺细胞是至少部分地由于SP / NK₁ř信令和MITF表达。单独和组合这些抑制剂的抑制显著细胞增殖和迁移通过SP诱导的增强（图7(一)和7 (b))。此外，这些抑制剂单独或共同抑制了sp处理的c-Kit中c-Kit、GATA4和MITF的上调⁺细胞mRNA和蛋白水平(图7 (c)， 图。S1和无花果。S2)。因此，这些观察表明SP/NK₁R signaling-accelerated c - kit⁺细胞扩增可能与c-Kit、GATA4和MITF表达有关。

4.讨论

在本研究中，我们发现了大量的c-Kit⁺GATA4^高细胞IA^{7 daysi / R}后SP处理。MITF和GATA4的在IA的蛋白和mRNA水平的表达^{7daysSP + I / R}和SP-treated c - kit⁺细胞数量显著增加。尽管MITF和GATA4在心脏修复中的具体作用尚未得到验证，但已有多项研究提出MITF和GATA4之间的功能联系可能影响c-Kit⁺心梗后的细胞。先前的研究已报道，MITF通过结合至在心脏肥大的GATA4启动子E盒，从局部缺血响应应力转录促进GATA4的表达[9]。MITF也可以直接交互与c-Kit信号，表示不仅在颅神经嵴衍生物和肥大细胞，而且在心肌细胞[18]。例如，之前的一项研究明确表明，c-Kit使用两种c-Kit重组酶系统识别心脏神经嵴(CNC)起源的心脏祖细胞^{CreERT2 / +}和的Wnt1-FLPE重组酶驱动小鼠系[18]。有c-kit⁺CNC衍生的的c-Kit的心肌细胞^{CreERT2 / +}谱系追踪是在心房和心室心肌细胞广泛，以及在心包，心内膜，心外膜和细胞[18]。有趣的是，MITF在c-Kit中表达⁺CNCs及其心肌细胞衍生物[18]。

GATA4的是，已经证明在mRNA和由心肌细胞的适应性反应蛋白水平的能力，以激活BCL2，有助于改善心肌细胞的存活[锌指转录因子19]。在另一项研究中，转基因小鼠中过表达的GATA4上调了心脏中Bcl2的水平，增加了冠状动脉流量储备，并通过促进血管生成因子如VEGF提高了心脏收缩力[20.]。此外，先前的一项研究产生了高表达GATA4的D3小鼠胚胎干细胞系[21]。该细胞系增强心肌细胞生成在鉴别胚状体和升高的内源性心脏分化基因的表达[21]。在另一项研究中，研究人员创建了c-Kit⁺细胞用慢病毒编码四种不同的心肌转录因子-GATA4，MEF3C，NKX2.5，和TBX5单独或彼此[组合22]。在过表达gata4的c-Kit中未发现内皮细胞标志物的诱导⁺细胞 [22]。

最近，Piero Anversa博士研究了c-Kit⁺心脏干细胞，已经缩回。此外，内源性作用的c-Kit细胞还存在心脏干细胞的疑问。事实上，急性心肌梗死的机制与控制心肌梗死的创面修复反应的机制非常不同，因此认为P物质促进心肌梗死后心脏再生的假设是完全没有根据的。尽管我们证明了SP诱导的c-Kit、MITF和GATA4的表达与常驻c-Kit相关⁺本研究的重点不是c-Kit，而是c-Kit中SP信号的表达⁺细胞。值得注意的是，IA之间的c-Kit、MITF或GATA4细胞分布存在差异^{7 daysi / R}和IA^{7daysSP + I / R}组。c-Kit的分布⁺，MITF⁺和GATA4⁺IA中的细胞^{7 daysi / R}组相对好整个梗塞分布，而的c-Kit的最高浓度⁺，MITF⁺和GATA4⁺IA中的细胞^{7daysSP + I / R}组更集中，位于血管结构周围的环DAPI⁺细胞。如图所示7 (d)，我们的研究结果并没有建立sp介导的c-Kit、GATA4和MITF激活与c-Kit扩增之间的因果关系⁺GATA4^高MITF⁺细胞在后I / R心肌。然而，我们已经清楚地LV之间心脏特异性标志物的综合分析表明，^{7 daysi / R}和LV^{7daysSP + I / R}该SP，通过GATA4和MITF表达，可以提高的c-Kit的膨胀⁺GATA4^高细胞。总的来说，我们的结果表明MITF可能在连接c-Kit上发挥转录调节作用⁺GATA4^高细胞和sp介导的c-Kit⁺细胞扩增后MI。

缩写

数控:	心脏神经嵴
edc:	植源性细胞
心力衰竭:	心脏衰竭
IA:	梗死相关领域
我/ R:	缺血/再灌注损伤
LV：	左心室
小姐:	心肌梗死
MITF：	Microphthalmia-associated转录因子
NK1接待员:	Neurokinin-1受体
定量RT-PCR：	定量逆转录聚合酶链反应
SP:	P物质。

数据可用性

(1)所有用于支持本研究结果的数据均包含在本文内。(2)所有用于支持本研究结果的数据均包含在补充信息文件中。(3)所有用于支持本研究结果的数据均可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

两位作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

YM郑某，程XW，和W金构思，设计，改进，并纠正了文章的风格;YM郑某进行的实验和写文章。

致谢

我们感谢Diacorda Amosapa对英语语言的出色编辑。我们感谢赵汉娜、李景惠和李苍蕾参与动物工作。本研究由韩国国家研究基金(2012M3A9C6050507、2016R1A6A3A11933448、2017R1A6A03015562、2018R1A2B6009316)资助。

补充材料

图S1: FTY720和RP67580抑制剂对有无SP的c-Kit细胞的影响。(A) RT-PCR分析SP刺激的c-Kit中靶向基因的相对mRNA水平⁺用一种或两种抑制剂预处理细胞。RPL32是装载控制。(B) NK的密度图₁R，MITF，GATA4，和c-Kit基因。图S2：FTY720和RP67580抑制MITF，GATA4，和c-Kit蛋白在SP处理的c-Kit表达⁺细胞。NK的密度图₁R、MITF、GATA4和c-Kit蛋白的western blot分析结果为sp刺激的c-Kit⁺用一种或两种抑制剂预处理细胞。 或 与相应的控制使用单向方差分析(ANOVA)，随后Tukey的事后检验。（补充材料）

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