SP (6.7 μ克/公斤/ 0.1毫升)和FTY720(鞘氨醇1-phosphate受体激动剂,抑制MITF)的表达( 15)购买从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。RP67580 (RP,选择性nonpeptide速激肽NK₁R拮抗剂,1毫克/公斤)是获得研发系统公司(明尼阿波利斯,美国)。Phospho-MITF (ser180)抗体,赫斯特33342年,DAPI买来热费希尔科学(美国罗克福德,IL)。AccuPower®RocketScript™周期RT预混料(dN12)和AccuPower®ProFi Taq PCR预混料买来Bioneer(大田、韩国)。SYBR®绿色混合获得应用生物系统公司(美国林肯,CA)。抗体特定c - kit (sc5535), NK₁R (sc15323) MITF (sc56725)和肌动蛋白(sc47778)获得圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)。抗体识别GATA4 (ab86371)和Alexa萤石®二级抗体买来Abcam(英国剑桥)。另一个抗体特定c - kit(磷Tyr568 / Tyr570)是获得GeneTex(英国)艾尔沃斯。Phospho-Akt(4060年代)和Akt是购买从细胞信号技术(美国贝弗利)。

所有的实验八周大的男性Sprague-Dawley (SD)大鼠进行的动物保健和机构伦理委员会庆熙医疗中心(KHMC-IACUC: 2015 - 028)。SD大鼠随机分为两组( n = 22 每个):I / R和I / R 5 nmol /公斤SP注入(SP + I / R)。左前降枝冠状动脉闭塞了40分钟之后7天再灌注和SP。老鼠安乐死,LV (LV^{7 daysi / R},LV^{7 dayssp + I / R})来源于心脏样本收集。IA组织切成1到2毫米的片段,用Ca^{2 +}/毫克^{2 +}无PBS和消化三次10分钟0.2%胰蛋白酶和0.1%胶原酶在37°C。IA碎片孵化了完全培养基(CM;杜尔贝科修改鹰中补充10% ES细胞级的边后卫,马血清,5% 10 ng / ml的生活,penicillin-streptomycin 1%,二性霉素b和庆大霉素)在37°C公司5%₂孵化器。2周后,附加的细胞,这种细胞迁移出来,包围了外植体,分析了通过免疫荧光染色和c - kit (IFS)抗体。c - kit的⁺细胞被magnet-activated纯化细胞排序(mac)系统(Dynal生物技术,奥斯陆,挪威)。Explant-derived细胞悬浮在胰蛋白酶(edc),孵化与一只兔子anti-c-Kit抗体(1:100),并使用immunomagnetic分离微(Dynal生物技术)。c - kit⁺细胞培养与CM 1月37°C公司5%₂孵化器。

c - kit的⁺细胞增殖试验是评估使用EZ-Cytox细胞生存能力分析工具包(DoGEN,首尔,韩国) 16]。c - kit的⁺细胞用FTY720预处理(5 μ米)或RP67580 (20 μ为2 h g / ml)或两个。SP治疗7天后,培养介质被移除。细胞被沾EZ-Cytox解决方案1 h。吸光度是决定在490 nm使用ELISA阅读器(EMax;分子器件、美国加州桑尼维尔)。

细胞迁移实验使用0.8执行 μ米孔隙大小和24-well transwell迁移钱伯斯涂以IV型胶原蛋白(10 μg / ml)如前所述 16]。 1 × 10 4 c - kit⁺细胞被播种到上层transwell室包含介质没有FTY720或RP67580或两者兼而有之。然后,商会是插入到每个24-well板包含600 μl培养基补充有或没有显示浓度的SP FTY720(5的存在与否 μ米)或RP67580 (20 μg / ml)或两者兼而有之。钱伯斯在培养24小时37°C公司5%₂孵化器。的细胞迁移到细胞膜外的一面是沾染了结晶紫染色的解决方案。吸光度是确定在590 nm使用ELISA阅读器(EMax;分子器件、美国加州桑尼维尔)。

互补脱氧核糖核酸合成使用AccuPower®RocketScript™周期RT预混料(dN12) (Bioneer、大田、韩国)。存在进行化验SYBR®绿色混合和合适的引物(应用生物系统公司),运行在一个StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司)。相对基因表达数据得到使用 ΔCt方法标准化和RPL-32如前所述[ 16]。使用的引物如下:c - kit(转发:AGACGTACAGATCCAGAATG,相反:TGCTCTTTGCTGTTACCTT);GATA4(转发:ACCCTGCGAGACACCCCAAT,相反:GTAGAGGCCACAGGCGTTGC);MITF(转发:CATCACGCATCTTGCTACGC,相反:TGCATGAACTGGGCTGCCTG);和RPL-32(转发:TGTCAAGGAGCTGGAAGTGC,相反:AGGCACACAAGCCATCTATTCA)。

金沙集团和4%多聚甲醛固定(PFA)石蜡包埋,分为7 μ米厚的部分,和沾染了标准IFS方法如前所述 10, 17]。检测c - kit的表达或MITF SP治疗后,c - kit⁺细胞治疗与SP(10海里)。SP 1天治疗后,培养中被删除。修复后15分钟PFA在4°C为4%,细胞被洗与PBS permeabilized 5% BSA和0.1% Triton x - 100和孵化主要抗体。核DAPI和赫斯特染色后,应用细胞成像使用倒置的蔡司Axio观察者Z1共焦显微镜有405,458,488,514,561,633 nm激光线。所有图片和样本选择身份蒙蔽,至少20个随机图像得到从每个或组。

冷冻样本中断使用TissueLyser II(试剂盒),之后,一个冰冷的PRP-PREP蛋白分离的解决方案与蛋白酶抑制剂鸡尾酒(韩国首尔的基因内区生物技术有限公司)是补充道,和样本均质不锈钢珠(试剂盒、钙、美国)。蛋白质含量是由BCA试剂盒(美国热科学,罗克福德,IL)。等量的蛋白质(80 μg)从每个样本加载到10%到12% SDS凝胶和转移到PVDF膜(美国默克密理博,MA)。2 h的膜被封锁在室温下有5%的脱脂奶粉含有0.1% Tween-20 PBS和孵化主要抗体(分别为1:1000和1:500)在一夜之间在4°C。洗涤三次后,细胞膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000)为2 h RT和可视化化学发光底物。

学生的 t - - - - - -测试(用于比较两组)或单向方差分析(方差分析)(三个或更多组之间的比较)其次是图基事后测试被用于统计分析。SPSS软件版本。17.0 (SPSS,芝加哥,IL)使用。的值 P < 0.05 被认为是显著的。数据表示为 意味着 ± 标准 错误 (SE)。 ∗ P < 0.05 - - - - - - 0.01 , ∗ ∗ P < 0.01 - - - - - - 0.001 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 与相应的控制。所有误差代表三个或更多的标准偏差生物复制。

SP的机制有助于c - kit的扩张⁺在心肌梗死后细胞( 14]分析了LV^{7 daysi / R}和LV^{7 dayssp + I / R}使用IFS和c - kit GATA4抗体。共焦图像显示增加c - kit⁺GATA4⁺LV表达细胞^{7 dayssp + I / R}LV相比^{7 daysi / R}(图 1)。c - kit的表达和GATA4是重要的c - kit促进生长和迁移⁺细胞( 17]。此外,I / R-injured心的几项研究表明,c - kit的数量⁺由于压力overload-induced心脏肥大细胞增加( 17]。代表共焦图像显示的coexpression MITF GATA4或c - kit LV^{7 daysi / R}和LV^{7 dayssp + I / R},表明高水平的MITF表达式通过SP治疗(数字 2和 3)。MITF起着关键作用的途径导致心脏增长和心脏肥厚性反应(6 - 10)。然而,很少有人了解的分子机制MI后MITF。接下来,我们假设如果SP / NK₁R信号导致内源性居民c - kit的激活⁺GATA4⁺细胞,c - kit的表达、GATA4 MITF可能参与其中。要检查这一点,我们是分开^{7 daysi / R}和IA^{7 dayssp + I / R}从LV^{7 daysi / R}和LV^{7 dayssp + I / R}。表达水平的c - kit, MITF GATA4信使rna和蛋白质含量测定中存在和免疫印迹分析。这些分析显示显著增加在c - kit, GATA4, MITF LV的表达式^{7 dayssp + I / R}LV相比^{7 daysi / R}(图 4)。特别是,在LV GATA表达式^{7 dayssp + I / R}在mRNA水平显著增加(图 4 (c))。这些结果提供的证据表明,SP的分子途径可能诱导内源性居民c - kit的扩张⁺GATA4^高与c - kit表达细胞,GATA4, MITF表达式。

如果SP / NK₁R信号积极调节内源性居民c - kit⁺细胞IA通过c - kit, GATA4 MITF,然后更多的c - kit⁺细胞IA^{7 dayssp + I / R}可能比从IA迁移吗^{7 daysi / R}。为了验证这一点,IA^{7 daysi / R}和IA^{7 dayssp + I / R}使用一个片段被培养 体外外植体测定产物。扩大了c - kit⁺细胞在共焦显微镜的特征。共焦图像和流式细胞仪分析表明,c - kit迁移⁺细胞IA^{7 dayssp + I / R}edc从IA明显高于^{7 daysi / R}没有,存在额外的SP治疗(图 5)。SP是否影响MITF和GATA4 c - kit的表达⁺细胞,纯化c - kit⁺细胞IA^{7 daysi / R}使用mac方法edc与c - kit抗体。纯化c - kit⁺细胞治疗与SP在指定的时间点。如图 6(一),SP-treated c - kit⁺细胞显著激活一种蛋白激酶的磷酸化10分钟和增强c - kit的磷酸化和MITF 8 h。c - kit的表达、GATA4 MITF SP随后引起增加8 h(图 6(一))。存在显示的表达升高MITF 16 h(图 6 (b))。共焦图像进一步证实MITF相当重叠的位置和表达与c - kit或GATA4表达式(数字 6 (c)- - - - - - 6 (e))。我们接下来用RP67589和FTY720进一步验证是否c - kit的扩张⁺至少部分是由于细胞SP / NK₁R信号和MITF表达式。这些抑制剂单独和组合显著地抑制细胞增殖和迁移的提高引起的SP(数字 7(一)和 7 (b))。此外,这些抑制剂单独和共同阻止c - kit的upregulation GATA4, MITF SP-treated c - kit⁺细胞信使rna和蛋白质水平(图 7 (c),无花果。 S1和无花果。 S2)。因此,这些观察结果表明,SP / NK₁R signaling-accelerated c - kit⁺细胞扩张可能与c - kit, GATA4 MITF表达式。