氟灭酸通过拮抗PI3K/AKT信号通路抑制间充质干细胞成脂分化

抽象的

目标．氟灭酸(FFA)是非甾体抗炎药中非灭酸的代表。在本研究中，我们研究了FFA对人间充质干细胞(MSCs)成脂的影响，并探讨其可能的机制。方法．为了研究FFA对hMSCs成脂分化的影响，我们将人脂肪源性干细胞(human fat -derived stem cells, hASCs)和人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchystem cells, hBMMSCs)作为hMSCs的代表细胞，在其成脂分化过程中进行了处理在体外．FFA的影响在活的有机体内在裸鼠、去卵巢小鼠(OVX)和老年小鼠中采用异位脂肪形成试验进行评价。为探讨FFA的作用机制，采用Western blot检测PI3K/AKT信号通路的激活情况。结果．我们的结果表明，在一定浓度下，FFA可以抑制人间充质干细胞的脂肪生成在体外和在活的有机体内．机械地，FFA通过抑制PI3K / AKT途径来抑制人MSC的脂肪生成。结论．本研究表明，在组织工程和与MSCs过度成脂分化相关的疾病中，FFA可用于抑制人MSCs的脂肪生成。

1.介绍

组织工程是近年来研究的热点[1］.间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为组织工程中常用的种子细胞，具有多能分化潜能，在组织工程中发挥着重要作用[2- - - - - -6］.因此，如何调控间充质干细胞的谱系承诺成为人们关注的焦点。成脂分化是MSCs分化方向之一，具有重要的生理和病理意义[2，3.］.MSCs过度成脂分化可在多种疾病中出现，如肥胖症[7，8]及骨质疏松症[9］.因此，如何调节MSCs的脂肪发生引起了越来越多的关注。

非甾体抗炎药(NSAIDs)广泛应用于抗炎和止痛目的。非甾体抗炎药抑制抑制前列腺素合成的环氧合酶(cox) [10- - - - - -12］.非甾体抗炎药是一个大的分子群，不同成员的化学结构有很大的差异，导致它们除了具有抗炎和镇痛的特性外，还具有不同的生物效应。非甾体抗炎药根据其化学结构可分为几类;例如苯胺、乙酸、水杨酸和芬那酸[13］.几种非甾体抗炎药对间充质干细胞的增殖、粘附、扩散、迁移等生物学行为有复杂的影响，包括阿司匹林[14)消炎痛(15，16),和布洛芬。其中吲哚美辛促进间充质干细胞成脂[16］.然而，关于非那酸对hMSCs成脂分化的影响尚不清楚。

MSCs的谱系归属受到多种转录和信号因子的调控，包括AKT信号通路。AKT信号通路在细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用[17]，以及肿瘤发生[18］.AKT通路在成脂分化过程中上调[19- - - - - -21］.此外，Akt1/Akt2敲除小鼠的脂肪形成受损，Akt1和Akt2都是诱导PPAR所必需的γ［22是脂肪形成的关键调节因子。芬那酸是否通过AKT途径调控MSCs成脂尚不清楚。

在本研究中，我们调查在体外和在活的有机体内氟灭酸(FFA)对人间充质干细胞脂肪形成的影响。我们报告了一种潜在的作用机制，这为FFA在组织工程和与过度成脂分化相关的MSCs疾病中的潜在应用提供了有价值的见解。

2.方法

2．1.hASCs和hBMMSCs的培养和成脂诱导

初级hASCs和hBMMSCs从ScienCell研究实验室(San Diego, CA, USA)获得。所有的细胞在体外研究至少重复了三次，使用的是来自三种不同捐赠者的hMSCs。

DMEM的边后卫,α-MEM和100x青霉素和链霉素混合物从Gibco (Grand Island, NY, USA)获得。人ASCs和bmscs在37°C和5% CO下培养₂增殖培养基(PM)，由青霉素/链霉素组成，10% ( ）FBS和新鲜DMEM (hASCs)或αmem (hBMMSCs)。成脂培养基(AM)由DMEM或αmem包含10μM胰岛素，100 nM地塞米松，200μindomecin, 500μm3 -异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)， 10% ( ）的边后卫,青霉素和链霉素。

２.２.浓缩FFA溶液的制备

研究不同浓度FFA对hMSCs成脂的影响，确定hMSCs成脂的最佳浓度在体外，我们溶解在DMSO中的氟芬酸，得到200mM FFA的浓缩FFA溶液。

２.３.油红O染色

分别接种PM和AM培养细胞，在诱导成脂后第21天进行油红O染色。简单地说，用10%福尔马林固定细胞1小时，用60%异丙醇冲洗细胞，应用0.3%油红O工作液。然后用蒸馏水清洗细胞，在显微镜下观察并拍照。为了进行定量评价，染色细胞用100%异丙醇洗脱，并在520 nm处对空白(100%异丙醇)进行分光光度测定。

2.4。实时逆转录酶 - 聚合酶链反应

采用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取培养的hASCs和hBMMSCs的总RNA在体外．之后，使用PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, Tokyo, Japan)对cDNA进行逆转录。采用SYBR Green Master Mix(罗氏应用科学，曼海姆，德国)和ABI Prism 7500 Real-time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行实时定量PCR检测。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为参照基因。所用引物序列如表所示1．

2．5．免疫印迹分析

用PBS洗涤人ASC，并在4℃下含有1％磷酸酶抑制剂（Roche）和2％蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的放射免疫沉淀法测定（RIP）裂解缓冲剂30分钟。将细胞裂解物超声处理并在4℃下以13362g离心30分钟以获得上清液。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific）测定总蛋白质浓度。等分试样（35. μg)的总蛋白提取物经过10%的sds - page，转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore, Billerica, MA, USA)。用5%脱脂牛奶封闭膜1小时，然后用抗ppar孵育γ(Abcam, Cambridge, UK)、anti-p-PI3K、anti-PI3K、anti-p-AKT、anti-AKT或anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)在4°C下过夜。随后，在室温下用过氧化物酶标记的二抗溶液孵育膜。用ECL试剂盒(CWBIO，北京，中国)检测免疫反应蛋白条带。采用Image J软件(美国国立卫生研究院)定量密度分析蛋白条带。所有蛋白水平通过靶基因/GAPDH密度比进行定量。

2.6。在活的有机体内hMSCs植入与异位脂肪组织形成

本研究获得北京大学医学部动物护理与使用委员会批准(LA2016305)。所有实验都是在批准的指导方针下进行的。

所有小鼠均来自Vital River公司(中国北京)。小鼠在无病原体的环境中进行12小时的光/暗循环，并提供水和食物随意．

6周( ）雌性BALB/C纯合裸鼠异位脂肪组织形成。24只小鼠随机分为4组(每组6只):hASCs AM、AM+FFA组和hBMMSCs AM、AM+FFA组。人ASCs或bmmsc在AM或AM中培养25μ裸鼠接种前接种FFA 1周。然后收集细胞，用胶原蛋白海绵孵育(无锡百特生物工程研究所，中国无锡) ）在37℃下放置2小时。离心后，将复合物植入裸鼠背部皮下间隙。6周后收集植入物，用4%多聚甲醛固定。然后将每个样品切成两半进行H&E染色和Oil red O染色。

2.7。卵巢切除术和假手术

8周龄（ ）雌性C57BL6小鼠行卵巢切除术(OVX)或假手术。40只小鼠随机分为两组，每组20只，Sham组和OVX组。戊巴比妥钠(50 mg·kg⁻¹)腹腔注射全身麻醉。按照标准程序对每只小鼠进行OVX或假操作[23］.

2.8。在活的有机体内FFA注射实验

操作后，将20只假小鼠随机分为两组（每组10只小鼠）：（1）假盐水（N.S.）和（2）具有FFA的假小鼠的假小鼠。类似地，将20个OVX小鼠随机分为两组（每组10只小鼠）：（3）与N.S.的OVX小鼠。（4）具有FFA的OVX。四周后[24]，每日1次腹腔注射FFA或n.s。

年龄大鼠，12个月大( ）雌性C57BL6小鼠随机分为两组，每组10只。第1组小鼠每天给予FFA 1次;第二组小鼠给予与FFA溶液等量的N.S，每日1次。

计算在活的有机体内在我们以前的研究中建立了治疗剂量[25］.

注射后一个月，将动物人们安乐死，收集股骨骨骼，固定在10％福尔马林中，并通过H＆E染色分析。在股骨小梁区域中的近端骨骺远端0.5至1mm，以分析美国骨骼和矿物学研究（ASBMR）所设定的指导方针的脂肪细胞参数[26］.使用SPOT5.3显微镜成像软件分析H&E染色图像上的脂肪细胞数量和组织面积[27］.

2.9。统计分析

数据如下所示 (SE)。采用SPSS Statistics 20.0软件(IBM)进行统计学分析。独立的双尾学生的 -采用单因素方差分析、单因素方差分析和Tukey事后检验来确定显著性水平。的值 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.FFA抑制hASCs成脂分化在体外

油红色拍染色和量化表明12.5,25,50,100和200 μM FFA对第21天培养的HASCs adipogenic分化的抑制作用（图1(一)和1 (b))．同时，qRT-PCR结果显示:12.5、25、50、100μM FFA显着减弱了表达式PPARG(图1 (c)） 和CEBPA(图1 (d))，而FFA在200μ米没有。抑制作用随FFA浓度的增加而减弱μM FFA显示对脂肪生成分化的最强抑制作用（图1(一)- - - - - -1 (d))．1‰DMSO对hASCs成脂无显著影响在体外(支持图1(一))．

３．２．FFA抑制hBMMSCs成脂分化在体外

为了测试FFA对其他类型HMSCs的脂肪发生的影响，我们在脂肪诱导期间用FFA治疗HBMMSCs。类似于在HASC中获得的结果，油红O染色和量化显示12.5,25,50,100和200 μM FFA对第21天培养的HBMMSCs的脂肪生成分化有抑制作用（图2(一)和2(b))。此外，qRT-PCR显示FFA在12.5、25、50和100μM减弱了的表达PPARG(图2（c））和CEBPA(图2(d)第14天，而FFA在200μ米没有。随着FFA浓度的增加，抑制效果衰减。像哈尔茨一样，用25次治疗HBMMSCS μM FFA显示出对脂肪生成分化的最强的抑制作用（图2(一)-2(d))。此外，1‰DMSO的存在对hBMMSCs的脂肪形成没有显著影响在体外(支持图1 (b))．

３．３．FFA抑制hMSCs成脂分化在活的有机体内

自25岁以来 μmffa对小鼠hASCs和hBMMSCs的脂肪形成抑制效果最佳在体外, 25μ选择M FFA浓度在活的有机体内实验。用AM或AM+25治疗人ASCsμM FFA为7天，单独装入胶原蛋白海绵支架上，并植入裸鼠。六周后，收集并分析植入复合物。H＆E（图3(一个))和油红色O(图3 (b))染色显示FFA组脂滴较少。使用hBMMSCs也获得了类似的结果(图)3（c）和3（d）)．

3.4。FFA抑制OVX和老年小鼠的脂肪形成

为了进一步探讨FFA是否能抑制动物疾病模型中MSCs的脂肪形成和脂肪形成，并确定我们的结果的临床价值，我们给OVX和老龄小鼠注射FFA。雌性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，SHAM+ n.s,假+ FFA, OVX + n, OVX + FFA。他走时染色(图4（a））表明，FFA治疗在假小鼠的股骨中没有造成显着差异，而FFA治疗部分抑制了OVX小鼠的股骨骨髓中的脂肪形成。此外，脂肪细胞量减少（图4 (b))和OVX小鼠的脂肪细胞/组织面积(图4 (c))．

在老年的小鼠中，H＆E染色表明FFA治疗部分减毒股骨中的脂肪积聚（图4 (d))．具体来说，我们观察到脂肪细胞数量的减少(图)4 (e))、脂肪细胞面积/组织面积(图4 (f))，与ns组比较。

3.5。FFA通过抑制PI3K / AKT途径来抑制HASC的脂质分化

为了探讨FFA调节脂肪形成的机制，我们用25μ在PM和AM中M FFA和mRNA分析一套脂肪形成的关键调控因子。治疗25μmffa抑制靶基因的表达一种蛋白激酶，FOXO1(图5(一个)），FOXO3.(图5 (b)）， 和CEBPα(图5 (c))在PM或AM条件下培养的hASCs中。此外，7天后25μM FFA处理后，PI3K和AKT的磷酸化和总PI3K和AKT以及p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT在PM和AM条件下均下调(图)5 (d)- - - - - -5 (f)和支持图2 (a) - (d))．此外，FFA降低了PPAR的表达γ，这在AM条件下上调（图5 (d)和支持图2 (e))．由此可见，一定浓度的FFA可通过抑制AKT通路抑制脂肪形成。因此，我们将AKT信号通路激活因子IGF-1 (100 ng/mL)添加到AM中μM FFA。油红O染色和定量显示25μM FFA对HASC的脂肪发生是通过IGF-1治疗衰减的（图5 (g)和5 (h))．同时，qRT-PCR显示IGF-1上调了细胞的相对mRNA表达CEBPα和Western印迹表明IGF-1上调了PI3K和AKT，总PI3K和AKT的磷酸化，P-PI3K / PI3K和P-AKT / AKT以及PPARγ，单用FFA治疗可降低(图)5(我)- - - - - -5(左)和支持图2 (f) - (j))．

4.讨论

在本研究中，我们发现FFA同时抑制了两种hMSCs的脂肪生成在体外和在活的有机体内．随着FFA的浓度增加，抑制效果衰减，25 μM FFA显示了对脂肪发生的最佳抑制作用。机械地，FFA通过抑制AKT途径来抑制HMSCs的脂肪。这些数据表明FFA在组织工程中的潜在应用和与MSCs过度脂肪生成的疾病相关的疾病。

的在体外本研究实验表明，FFA可抑制hMSCs的脂肪生成。根据qRT-PCR结果，从25开始，随着FFA浓度的增加，FFA对脂肪生成标记物表达的抑制作用下降μM - 200μM.而油红O染色显示200μM - FFA对脂肪生成的抑制作用优于100μM FFA。这可能是因为200μM FFA也抑制hMSCs的增殖，这在我们之前的研究中已经有记载[25］.人类ASCs和hBMMSCs显示出相似的结果在体外和在活的有机体内．这可能是因为它们都是出生后的组织特异性干细胞，具有相似的基因表达谱和显示相似的特征[28］.我们发现低浓度的FFA促进hMSCs成骨[25[促进骨质发生分化时，通常抑制脂肪生成分化。我们现在的研究结果与我们之前的报告一致。这些数据表明，FFA治疗可以在介导HMSC的谱系分化中发挥作用。支持这些在体外结果表明，FFA可抑制hmsc的脂肪形成在活的有机体内．这表明FFA可能是治疗MSCs过度成脂分化相关疾病的一种潜在的治疗选择。

在几种疾病中可以看出MSCs的过度脂肪生成，例如肥胖和骨质疏松症[9，29，30.］.研究表明，老化和肥胖促进了MSCs的脂肪生成，增加了骨髓脂肪组织（垫）的积累，损害了MSCs的成骨功能[31，32］.骨髓作为骨与脂肪在同一微环境中共存的唯一组织，是研究干细胞谱系关系的极好窗口。我们观察到低浓度的FFA可以抑制OVX和衰老小鼠MAT的积累。骨质流失和骨髓中脂肪组织增多是骨老化的迹象。因此，这些数据表明，FFA治疗可能介导hMSCs的脂肪形成，并可能有助于延缓骨衰老。

非甾体抗炎药常被用于治疗骨关节炎等骨相关疾病，有研究报道非甾体抗炎药影响骨和间充质干细胞的生物学行为，包括黏附、增殖和分化。然而，除了吲哚美辛促进间充质干细胞成脂外，关于非甾体抗炎药对间充质干细胞成脂作用的研究报道甚少[16］.此外，关于非那酸对间充质干细胞分化的影响还知之甚少。FFA是非那酸的代表，历史上曾用于治疗一系列临床常见病[33，34］.FFA很容易获得，而且价格便宜。本研究为FFA作为一种新的、安全、经济的调控MSCs成脂分化和治疗与MSCs过度成脂分化相关疾病的潜在应用提供了见解。

我们的研究表明，FFA通过抑制PI3K/AKT通路抑制hMSCs成脂。AKT通路与MSCs的谱系承诺密切相关[19，21］.前期研究表明，AKT信号通路在成脂分化过程中上调[19］.我们的调查结果与以前的报告一致，我们是第一个指出FFA通过PI3K / AKT途径抑制脂肪分化。虽然FFA如何抑制HMSCs的脂肪发生分化的机制尚未完全阐明，但它至少部分地通过抑制PI3K / AKT途径介导。

尽管如此，我们的研究有几个局限性。该研究仅检查了某些浓度FFA抑制HMSCs的脂肪生成分化的信号通路。随着FFA浓度的增加，为什么抑制效应下降仍然不清楚。这可能是因为低浓度的FFA和高浓度的FFA通过不同机制影响了HMSC的脂肪生成，我们将在未来的研究中进行更深入的探索。此外，为了促进我们的研究结果的临床转化，需要进一步的探索来确定人类治疗的有效浓度。

总之，我们的结果表明FFA可以抑制hMSCs的脂肪生成在体外和在活的有机体内通过抑制PI3K/AKT通路。这些数据表明，FFA可用于调节MSCs的脂肪生成，并表明FFA是治疗与MSCs过度成脂分化相关疾病的潜在治疗选择。

5.结论

FFA抑制hMSCs的脂肪生成在体外，最佳抑制浓度为25μM FFA。治疗25μmffa还能抑制hMSCs的脂肪形成在活的有机体内．机械地，FFA通过抑制PI3K / AKT信号通路来抑制脂肪组织。这些数据表明，FFA可用于抑制组织工程中人体MSCs的脂肪生成和与MSC的过度脂肪分化相关的疾病。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者宣布没有关于本文的出版物的利益冲突。

作者的贡献

XL负责研究的概念和设计、数据的收集和/或组装、数据分析和解释，以及手稿的撰写。ZL、HL和YZ负责动物实验中数据的收集和/或组装以及数据分析和解释。DX, SW和RG负责分子生物学实验中数据的收集和/或组装和数据分析。PZ和YL负责构思和设计，资金支持，稿件撰写。由YZ负责构思设计、稿件撰写、稿件最终批核。

致谢

基金资助:国家重点研发计划项目(No. 2016YFC1102900);国家自然科学基金项目(No. 81970908和81771039);项目编号:BMU2018ME005至YL);Z181100006218037 PZ)。

补充材料

支持图1:1‰DMSO不影响hMSCs脂滴形成。支持图2:图中蛋白条带的定量分析5到清单。（补充材料）

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