2的关节内注射不同剂量的自体和同种异体骨髓和脐Cord-Derived变量间充质干细胞触发炎症反应的球节12日联合声音实验马

文摘

骨关节炎疼痛的一个重要和昂贵的原因人类和马。那匹马已被确定为一个合适的人类骨关节炎模型。再生治疗同种异体间充质干细胞(msc)是一种有前途的治疗,但这个过程仍然是讨论的安全。本研究的目的是评估同种异体关节内注射msc的安全健康关节通过比较两种不同剂量和两种不同组织来源,即骨髓和脐带血,安慰剂治疗在同一个人。我们也评估自体和同种异体细胞对骨骼的影响来源于MSC治疗。12个临床声音马受到注射4球节关节。这三个球节是一个不同的MSC类型管理,剩下的球节被注射磷酸盐作为控制。六马收到1000万细胞/联合,6其他马收到2000万细胞/关节。临床和超声监测表明,同种异体骨骨髓来源msc诱导更多的滑膜积液而脐带血液msc但没有显著差异指出滑液内的参数。管理1000万年马触发细胞炎症迹象明显多于2000万个细胞。 Mesenchymal stem cell injections induced mild to moderate local inflammatory signs compared to the placebo, with individual variability in the sensitivity to the same line of MSCs. Understanding the behavior of stem cells when injected alone is a step towards the safer use of new strategies in stem cell therapy, where the use of either MSC secretome or MSCs combined with biomaterials could enhance their viability and metabolic activity.

1。介绍

骨关节炎(OA)是一种关节疾病,其特征是软骨,软骨下骨失败,periarticular骨重塑,滑膜炎(1- - - - - -3]。它是残废的主要原因之一,降低性能和提前退休在运动马4]。这种疾病是直接和间接负责马产业的主要经济损失,使治疗治疗策略的发展感兴趣的主题。这种兴趣尤其增强马是一个合适的模型来研究人类OA。骨关节炎确实是负责大量的人类福利和经济问题(3]。尽管许多医疗方法(3)评估或使用,这些治疗的效果保持缓和(疼痛减少,减少炎症),目前还没有治疗治疗OA。同样的问题也适用于最近的手术方法,出现承诺和仍在考虑5]。

干细胞再生医学是一个有前途的战略由于缺乏自发的关节软骨的再生能力。预期效应解释为chondrogenic分化潜能的干细胞和免疫调节和旁分泌信号的影响(6,7]。同种异体msc尤其有趣,因为银行可以执行。这提供了细胞的已知的质量和数量特征可用立即治疗,而自体msc需要分离时间和扩大在文化与不确定的结果对细胞的质量。尽管他们了解相对较少在活的有机体内生物学、msc已经进行关节内注射在诊所(8),和一些商业实验室在世界各地现在可以处理各种组织为客户产生干细胞。然而,msc关节内注射后发生不良反应已经被报道在马的病人8,9],它在临床实践中并不少见的非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)管理MSC注入之前减少的风险联合耀斑,推荐(9,10]。因此重要的是不要高估MSC治疗的安全性,还有许多问题需要解决在这些细胞在临床实践中推广使用。在体外(11),在活的有机体内研究[12- - - - - -14)表明,msc的确是一般认为是immunoprivileged,但有争议的局部炎症反应后观察在活的有机体内关节内注射(15- - - - - -17和这些细胞的潜在免疫原性18- - - - - -20.]。尽管一些最近的研究评估安全的同种异体马msc (21),只有少数进行使用关节内的方法:三个关注BM-MSCs [15,17,20.),一个专注于placenta-derived msc (16),和一个描述chondrogenically诱导msc来源于外周血结合同种异体等离子体(22]。在这些研究设计,每个马只有一种类型的MSC,单一剂量的MSC测试,剂量范围从2到2500万个细胞/联合根据研究。人类研究的情况都是一样的:最近的一个评论(23)表明,目前还没有达成共识的最佳类型或剂量的msc注入关节,以确保一个安全的和潜在的有效治疗OA的病变。据我们所知,没有研究到目前为止比较在同一个人msc两种不同组织来源的安全健康的关节或比较了使用不同的剂量使用相同的协议。

本研究的目的是双重的。首先,我们试图比较安全的健康的关节内注射的两种不同的同种异体MSC组织来源使用的细胞组成的控制质量和生存能力和BM-MSCs和UCB-MSCs磷酸盐(PBS)作为车辆控制。自体和同种异体细胞的影响也是BM-MSCs评估。其次,我们将这些关节内注射的安全与1000万个细胞和2000万个细胞。

2。材料和方法

2.1。马和研究设计

12个临床声音法国标准竞赛用马归成像和马运动病理学研究的中心(CIRALE)包括在这项研究中。有7阉马和5母马,所有年龄在2到4岁。马都没有怀孕的历史,曾接受过输血在招聘之前,或有亲属关系。每个马与静态和动态评估临床评价和接受射线照相和超声检查的四个球节关节排除既存的存在关节疾病的迹象。批准的研究协议来ans / ENVA UPEC伦理委员会(许可证号码:10/06/14-8)。所有马匹收到一个注射4球节关节,即。,在掌指的和跖趾关节。一个均匀分布的不同的干细胞类型执行每个马有一个前/后球节关节注射自体BM-MSCs及其侧球节关节注射同种异体BM-MSCs和前/后球节关节注射UCB-MSCs及其侧球节关节注射同样体积的MSC传输介质(Illkirch Gibco磷酸盐,费舍尔科学SAS,法国)作为控制。每一匹马被随机分配到一个六干细胞治疗分布(见补充7)。注射执行同样的训练有素的操作员没有了解干细胞的选择分布(SJ, ACVSMR学位证书持有者)。人镇静前注射(IV管理detomidine 0.01毫克/公斤和布托啡诺0.01毫克/公斤)无菌制剂后的皮肤。推荐,以确保MSC可行性(24注射),使用横向方法在弯曲四肢之间插入了一个20量度针掌骨/跖骨髁和侧籽骨近端(补充4)。BM-MSCs均匀分布和执行UCB-MSCs左右球节和前、后球节。马被分成2组。马在组1收到2000万毫升含有msc在传输介质,而马2组收到1000万毫升含有msc在运输中。PBS是作为传输介质。一个试点研究两个健康的马之前确认好关节内注射PBS的公差没有滑膜积液和敏感关节的弯曲测试注入,以及缺乏跛为期两周的临床随访期间(使用的协议是在这项研究中使用的相同)。

2.2。细胞分离和细胞培养

胸骨骨髓来自每个12马后镇静(detomidine 0.01毫克/公斤,第四;布托啡诺0.02毫克/公斤,IV)和地方皮肤麻醉,如前所述(25- - - - - -27]。短暂,30毫升的骨髓被吸入了使用一个11 g卷活检针注射器预装载肝素。骨髓样本收集到无菌烧瓶包含40毫升的柠檬酸磷酸葡萄糖抗凝然后储存在室温下1 - 2小时内收集处理。血液从马脐带血收集24小马驹后立即生仔的静脉穿刺脐静脉使用16 g皮下注射针连接到250毫升输血收集袋(MSE3500Q Macopharma)包含35毫升的柠檬酸phosphate-dextrose-adenine,如前所述[28,29日]。脐带血样本然后储存在室温下(- 22°C)在9到62小时的收集和处理。

MSC隔离和文化进行了以同样的方式,使用相同的培养基(如前所述)在体外研究[26,27,29日]。确保安全的孤立的细胞,细菌和病毒学分析进行了针对九个病毒属,八个菌属,和两个原生动物(见补充7)由一个外部实验室根据他们的内部协议(Labeo弗兰克Duncombe、Saint-Contest、法国)。积极为疱疹病毒样本只发现BM-MSCs UCB-MSCs(71%和12.5%)[26,29日]。积极的细胞系被排除在进一步同种异体的管理。

细胞扩张了低糖杜尔贝科的修改鹰中含20%胎牛血清(FCS,表达载体的生活技术)。培养基是每周3次,改变细胞通道在80% confluency直到通道4 (P4)。在这个阶段,细胞保持每细胞系也计算在内,离心机,然后悬浮在低温贮藏中(6 - 1000万细胞/毫升)组成的90% FCS和10%二甲亚砜(Sigma-Aldrich)。冻结了使用CoolCell冷冻容器和细胞被储存在液氮直到所需的研究。

2.3。体外细胞特征

Immunophenotyping和trilineage分化进行了如前所述[26,29日)细胞上准备从相同的通道,以同样的方式与注射用于临床。简而言之,msc在P4 immunophenotyped表达水平的MHC II类和使用流式细胞仪面板的标记。以下鼠标使用单克隆抗体反:CD29-Allophycocyanin (APC) (BioLegend) CD44-Phycoerythrin (PE)(物联网),CD45-Pacific蓝色(PB) (ABd Serotec) CD73-APC (Abcam) CD90-Fluorescein异硫氰酸酯(FITC) (InvestCare) CD105-FITC (Abcam)和II型MHC-RPE (ABd Serotec)。同形像抗体被用作控制各自的老鼠。这些与马细胞单克隆抗体交叉,特异性验证了通过运行一个血液样本,含有单核细胞,血细胞计数器的积极控制。执行数据采集在贝克曼库尔特gallio流式细胞分析仪(联邦研究结构ICORE平台,卡昂大学诺曼底,法国)和分析与FlowJo软件(TreeStar)。

马msc分化成成骨的能力,在P4 chondrogenic,脂肪形成的血统是确定使用前面描述的文化和固定方法(26,29日]。短暂,成骨分化是评估利用茜素红S染色评估钙沉积,脂肪生成采用油红O染色观察脂滴,和通过使用阿尔新蓝染色观察软骨形成酸性粘多糖等多糖。在每个差异化分析,同等数量的细胞保持在MSC扩张中作为分析的控制和染色。

2.4。细胞准备注射

同种异体来源的细胞被随机选择从可用细胞系和2行BM-MSCs /群马(组1:剂量2000万;组2:剂量1000万)和2行UCB-MSCs /组。大约一个星期前内注射(UCB-MSCs BM-MSCs 7天,10天),细胞被摩擦迅速解冻,播种在5000个细胞/厘米²和培养中细胞培养中所描述的部分。注射前两三个小时,细胞分离使用胰蛋白酶/ EDTA然后悬浮在50毫升的PBS完全去除培养基,尤其是剩余胎牛血清的边后卫。细胞被计算,然后第二个离心。六批每个MSC源包含1000万个细胞/毫升的PBS准备注射组1,和6批次包含500万个细胞/毫升的PBS准备注射组2。同种异体注射,细胞系被随机分配接受马在补充(见减少2)。msc在室温下保存(- 22°C)在交通从实验室,推荐(30.]。台盼蓝排斥试验(台盼蓝溶液0.4%液体,默克公司)是用于监测细胞生存能力6小时后文化去除:混合后立即进行手工计算中包含的一小部分细胞的台盼蓝溶液的比例1:1。

2.5。临床和影像学随访

所有的马都局限于 m摊位前一天从注射到后的第二天。然后他们被发现在小牧场( 米),直到研究结束。绷带和药物治疗,以避免任何干扰炎症反应。马的心率、呼吸频率、体温和食欲监控每天两次检查不适的迹象。

每个球节临床评估0天(注射)前1天,3、7、14和28。临床评估盲目地执行相同的操作符(SJ)。首先,联合周长测量球节中间的籽骨和midmetacarpal /跖骨近端部分地区使用刮皮肤具有里程碑意义。一式三份测量和平均。其次,对数字的敏感性和关节积液弯曲测试评估使用五分制从正常到严重(0:正常,1:温和,2:温和,3:巨大的,和4:严重)。皮下水肿也评估和使用相同的五点量表得分(见表1和补充7)。每个球节和掌骨/跗骨区被拍到从正面和侧面。残废的程度分级在0到5按照残废的规模美国马从业者协会(31日]。

超声检查进行0(在注射之前),那么天1天,3、7、14和28。每个球节的背和抵押品方面进行横向和纵向扫描,使用7.5 MHz线性转换器(日立医疗系统、Saint-Priest、法国)(见补充5)。滑液积液是由相同的调查员评估盲目(SJ)和分级潜油电泵规模相同的临床评估(表2)。主要的炎性反应导致明显不适的马(即。、临床和超声 残废或≥3/5),调查人员被允许管理非甾体抗炎药来缓解疼痛和过度的炎症。这偏离了协议排除马从数据分析药物管理局开始的时间点。

2.6。滑液分析

滑液的样本(1毫升)被从每个关节0(在注射之前),那么天7天,14日和28对MSC注射使用前文所述的技术(补充4)。没有执行抽样后的第一个星期MSC注入以避免删除MSC;msc在滑液内跟踪12周(32)和一个试点研究,我们确认执行大量的msc在抽样天1和3而不是从第七天开始。大约0.3毫升的液体是放置在一个EDTA管和总有核细胞数量直接测量使用自动分析系统(Sysmex XN10, Sysmex公司(日本)(细胞/μL)。剩下的液体将被放置在一个干燥的离心管 10分钟。水相的复苏后,20μL的样本放在一个折射计(Auxilab SL Zuzi系列300年,西班牙)来确定总蛋白浓度。其余被储存在-80°C进行ELISA分析。滑液浓度的前列腺素E₂(铂族元素₂)和II型胶原蛋白c端端肽(CTX-II)作为标记的炎症和软骨退化,分别估计使用商用高灵敏度酶免疫测定试剂盒(前列腺素E₂参数试验装备、研发系统、美国;血清临床前CartiLaps®(CTX-II)环评,Immunodiagnostic系统控股有限公司(英国)33,34]。

2.7。统计分析

统计分析数据后进行正常的视觉评估。正态分布结果的平均值和标准偏差和其他中间值和四分位数的计算在每一个时间点为每个治疗和剂量组(见补充3)。分析不同剂量的影响,接受安慰剂的关节被排除在外的数据和所有MSC类型的数据汇集在一起。同样,分析不同治疗的影响,数据从剂量都汇集在一起。两种定量结果是正态分布(总蛋白浓度和球节联合周长)和另外两个对数转换遵循正态分布(铂族元素₂和CTX-II浓度)。其他结果(半定量的分数和有核细胞总数)不是正态分布,变成二进制的结果。200细胞/的阈值μL选择符合OA的存在总有核细胞计数,如报道所述[34,35]。对分类结果进行二进制分类根据以下两个球节临床类别:(我)“容忍”当分配的成绩(对数字的敏感性弯曲测试,关节积液,程度的残废,皮下水肿,在超声波和滑液积液)≤1 4(或5残废)。这些信号被认为是可接受的疼痛和炎症的迹象(2)“不容忍”分配分数> 1时的4(或5残废)。这些被认为是过度的疼痛和炎症的迹象(见补充2)

二进制结果时,逻辑回归模型进行了使用广义估计方程(GEE)调整相关的重复测量在每个马(35]。结果定量和正态分布时,线性回归模型也调整了相关的重复测量在每个马(通过使用哎呀模型与一个正常的链接)。在所有模型中,马是作为一个随机效应,和治疗(或剂量)固定效应和时间作为参考价值获得0天内注射前被排除在分析之外。比值比(或)及其95%可信区间(CI)是提供二进制结果和差异(95%置信区间)提供了定量的结果。SAS V9.4 (SAS研究所、卡里、数控)是用于所有哎呀模型(过程GENMOD)。α错误被设定为5%。

3所示。结果

3.1。MSC隔离和表征

msc被成功分离和扩大在文化。表征的流式细胞术检测透露CD29、CD44, CD90表达所有细胞群的每个应变和CD45和MHC II级表达的缺失。CD73表达式donor-dependent,表达式只有细胞群的一部分。同样,CD105表达的不是发现UCB-MSCs和弱BM-MSCs P4(其他发表的报告中显示的数据(26,29日)和补充6)。

本研究中使用的所有BM-MSC菌株有高增殖能力和拥有multipotency分化为成骨细胞的能力,脂肪细胞,软骨细胞,如前所述28]。除了去UCB-MSCs有同样的能力。事实上,未发现脂滴在细胞质的UCB-MSC油红O染色。因此,UCB-MSCs只有部分间叶细胞谱系分化能力(数据显示在其他发表报告26,29日)和补充6)。

3.2。关节内注射

在所有球节关节内注射成功执行。每匹马的细胞系接受同种异体细胞可在补充2。1到2小时内注射了MSC的准备。注射的时候,意味着生存的msc是96.6%(±2.2)和92.7% (±4.2)BM-MSCs和93.09%(±6.12)和85.11% (±5.27)UCB-MSCs(见图1和补充1)。

3.3。临床症状

体温、心率、呼吸率和胃口一直都过着正常的马在整个研究。没有12匹马显示对数字的敏感性弯曲测试在整个研究。周长的测量球节并没有透露任何重大变化除了UCB-MSC-treated球节显示平均周长明显高于控制球节(表3,数据2(一个)和3(一个))。12匹马的四个显示轻度至中度单边残废(1-2/5级)之间的第一天和第七天解决了14天。之一,然而这些马(马7)表明伴随等级3 - 4/5跛一肢1天(右后肢注射UCB-MSCs)明确的迹象不超过3的球节注射msc(临床和超声等级的 )(数据4 (g)- - - - - -4(我),5 (g),5 (h),5 (j);补充2)。作为两国前四肢残废被怀疑的这匹马(四肢注射同种异体和自体BM-MSCs)但不能观察到和分级,残废数据相关的在这个研究中没有考虑设计,被排除在统计分析。此外,马7收到非甾体抗炎药,1.1毫克/公斤静脉注射氟尼辛葡甲胺(Finadyne, Intervet、激怒、法国)从第一天每12 h(临床分级后),直到解决临床不适3天的迹象。所有数据从这匹马也因此被排除在第一天后统计分析。残废等级下降到1/5级3和马天第七天都不再是瘸的。

17球节从8马注射msc显示> 1/4关节积液年级临床检查(补充2)。这些球节,在“不容忍”的类别,分类更频繁的在同种异体BM-MSC-treated球节比UCB-MSC-treated球节但有自体和同种异体组织之间没有显著差异。不允许使用的统计模型比较每个MSC-treated球节组的控制球节,因为没有控制球节是“不容忍”的分类类别在研究期间,虽然每个MSC-treated球节组显示至少5球节分类类别(表3,图2 (b))。17球节的“不容忍”的分类类别,只有3,所有这一切都来自马7和注入每个MSC类型,分别有大量严重的关节积液( )。最后,当考虑关节积液,“不能容忍”球节明显更频繁的球节收到1000万msc比球节收到2000万msc(表3,图3 (b))。

3.4。超声监测

根据关节积液的临床随访,滑液积液通过测量超声波显示18球节注射8马msc显示> 1/4积液和分类在“不容忍”的范畴。这些“不能容忍”球节也明显更频繁的同种异体BM-MSC-treated球节相比UCB-MSC-treated球节,但他们也更频繁的同种异体BM-MSCs而自体msc(表3,图2 (c))。再次,没有统计比较每个MSC-treated之间可以球节组和控制球节,因为没有控制球节是“不容忍”的分类类别。18“不容忍”的球节,6 4马(包括马3球节7)显示大量的严重的超声波信号≥3/4滑液渗漏。其中一个球节被注射自体BM-MSC,注射同种异体BM-MSCs 3球节,2球节与UCB-MSCs注入。五个球节注射1000万msc和一个球节2000万。对于相应的临床参数,考虑在超声波滑膜积液时,“不能容忍”球节明显更频繁的球节收到1000万msc比球节收到2000万msc(表3,图3 (c))。

3.5。滑液分析

滑液成功获得在每个时间点为32/48球节的研究和4个时间点的至少3人。当考虑球节的频率高于200个有核细胞的阈值和平均总蛋白浓度,所有MSC-injected球节显示水平显著高于PBS control-injected球节(表3,数据6(一)和6 (b)),但MSC类型没有明显区别。注射后无显著差异被发现1000万个细胞相比,2000万个细胞总蛋白质含量有关,但球节的频率高于200有核细胞的阈值明显高于1000万年比2000万年(表3,数据7(一)和7 (b))。意思是铂族元素₂浓度没有显著联合注射整个研究(数据后修改6 (c)和7 (c))。相反,意味着CTX-II MSC注射后明显降低浓度比PBS控制和基线与自体BM-MSCs之间的显著差异和PBS控制和UCB-MSCs和PBS之间控制(图6 (d))。此外,CTX-II浓度出现显著降低在1000万组相比2000万年组(表3,图7 (d))。

4所示。讨论

本研究有两个主要发现。首先是存在炎症反应之间的显著差异诱导同种异体UCB-MSCs和同种异体BM-MSCs当注入健康的关节的同一个人,但只有当考虑滑膜积液(临床和超声),而不是对其他地方的临床和超声信号以及滑液参数。同种异体来源也比较自体BM-MSCs和显著差异指出只有BM源之间为滑膜积液测量超声波和总蛋白浓度水平较高后同种异体BM-MSC注射。这证实了一个之前报道的发现(17),但与其他安全研究的结果没有任何区别在哪里看到一个注射后(15,20.]。第二个发现是,注入1000万msc /联合诱发更多滑膜积液和增加总有核细胞计数比注入2000万msc。这些结果支持更高的MSC的使用剂量不依照最近的人类临床初步试验治疗膝OA,在取得了显著的临床改善后关节内的管理的最低剂量(200万)自体脂肪MSC (36]。msc的剂量评估在本研究范围内的推荐剂量,通常用于临床实践马(32)或实验和临床试验在马(9,15- - - - - -17,20.),即使仍没有共识适当的剂量(23]。剂量结果本研究应然而回火的炎症反应的个体差异。事实上,这将是更可靠的评价不同剂量相同的马。

PBS注射是用于监控的反应联合关节穿刺术和传输介质。正如之前报道的(15- - - - - -17),从这个研究结果倾向于确认本地msc在健康关节,关节内注射自体或同种异体,似乎引起瞬态滑液渗漏观测数据2 (b)和2 (c)没有观察到相同的注射生理盐水后控制。不幸的是,没有对这两个参数可以进行统计学比较。然而,显著增加总有核细胞数和总蛋白浓度在所有MSC-treated球节组相比,控制球节组与那些之前报道[模式相似17从第七天28天,28天回到基线值。在铂族元素没有显著差异₂浓度观察MSC类型和安慰剂之间在整个研究中,表明没有重大有害MSC注射后发生炎症反应。有趣的是,UCB-MSCs诱导显著减少CTX-II浓度比PBS控制。类似的减少也观察到CTX-II浓度,生物标志物的软骨退化(34,37注射自体BM-MSC后),但程度不一样。这些数据可以揭示潜在chondroprotective msc与UCB-MSCs更为显著的效果。这种效应似乎是有限的时间回到基线值CTX-II浓度的28天对于所有类型的MSC,强调执行的潜在利益的MSC重复注射治疗使用之前建议(15,20.]。然而一些滑液中的遗漏值的参数可能会影响结果。此外,第一周的滑液结果当然是低估了,因为没有抽样的天1和3。事实上,山峰滑液参数通常发生在天1天3和10之间,主要是解决在先前的研究15- - - - - -17]。相同的研究也报道,滑液取样结合生理盐水注射造成无意义的瞬态滑液细胞数目的增加和总蛋白浓度采样后的第二天,与msc管理无关。我们无法确认这在我们的研究由于缺乏抽样MSC注射后的第二天。

至于临床参数,最无功参数后注射是滑膜积液。的36球节处理msc、17(47%)被分配一个 和被分类”不能容忍”类别,这可能是一个关心主人,从而构成限制因素对这种疗法的使用私有的动物。然而,与安慰剂组显著差异不可能是评估和滑膜积液是温和的球节(12/17)和减少了研究结束时,当它被归类在“容忍“类别除了3/17球节,它保持稳定。关于残废等级,研究设计与并发注射在同一匹马不幸使它不可能得出结论关于这个参数可能被低估了,因为双边残废不能正确评估。这种局限性的研究让我们排除残废的数据分析。改善疼痛评估和评估两国残废,这将是有趣的在将来的研究中测量步长。

本研究的结果表明,关节内注射的同一行msc健康关节诱发一个变量根据个体的局部炎症反应程度。即使只有一个的12匹马(8.3%)在这项研究(马7)表现出严重的疼痛和炎症的迹象,这种反应可能会观察到在任何client-owned动物参与临床试验。越来越多的证据表明,未来的干细胞疗法的临床应用不会瞄准注入msc单独或只是在PBS稀释,而是表明msc将获得治疗的兴趣如果结合细胞外基质替代物水凝胶,以增强他们的生存能力和代谢活动(23,38]。最近的研究甚至表明,msc可以通过注射的治疗活动完全的生物活性分泌因素msc、检查参与组成分泌腺叫,暗示未来/游离细胞策略23,39,40]。尽管这些新策略可以提高msc的安全,它仍然是重要的理解细胞注射的行为单独优化接收响应。

炎症反应观察到的原因还没有完全理解。脓毒症是排除基于滑液分析和临床演变(见补充2)。重要的是要注意,总蛋白浓度和总有核细胞计数仍承认下阈值为脓毒性关节炎(41]除了一个马9球节,走近这些值。事实上,5 g / L总蛋白浓度和23945个细胞/μL测量的滑液球节与自体BM-MSCs注射后7天。没有相关的临床症状观察,和价值观逐渐回到基线值的研究没有任何治疗。马7中的进化临床显示,严重的滑膜积液的迹象,是自发有利没有任何其他治疗超过3天的消炎药。此外,其他马匹的研究收到了相同的细胞池马7和没有任何局部炎症反应。这一事实三个关节从马7处理不同类型的msc的反应同样指向可能这匹马的个人倾向。

即使没有显著增加总有核细胞计数测量和每一行的注入msc缺乏MHC II级测试,观察到的信号可以解释为一种免疫反应。事实上,它已经表明,马同种异体的msc可以诱发抗体反应在活的有机体内与个别的变化强度和时机和独立于MSC MHC II级表达(19]。作者的研究表明,捐赠者和接受者的马前应该筛查MHC兼容性MSC。然而获得微卫星类型是有限的,遗憾的是没有在我们的实验室。然而,发生这样的MSC免疫原性被发现不支持1000万个细胞炎症导致超过2000万,更少的反应以增加细胞数量宁愿建议增加免疫调节。不幸的是,免疫调节msc的潜力在体外没有测量在这个研究。

胎牛血清也应该被视为一个潜在的引起的不同反应观察马,尽管努力已经移除所有的培养基。的边后卫被使用在我们的文化和与xenoproteins残余污染可能发生,也突出了最近的一项研究[20.]的边后卫的胞内xenogen-contaminated自体msc诱导显著免疫反应而FBS-depleted msc。然而,这种重要的反应并不是说第一次注射后只有启动注入后,与本研究结果不同。反应在我们的研究中观察到的另外两个特征不支持假设的体液抗体反应。第一,反应后不仅注射后观察同种异体还注射自体MSC。已经报道了类似的炎症反应后自体关节内注射BM-MSCs [9,15]。MHC表达式是动态的,依赖于环境因素如干扰素γ的存在对MHC II级(18,42]。有可能是一级或二级MSC MHC可以改变他们的表达谱后注入球节关节如果促炎细胞因子已经出现在滑液。另一种可能性可能是可交叉反应的抗体反应针对抗原表位抗原MHC类的,作为描述high-titered anti-MHC抗血清(19]。第二个特点,不支持体液抗体反应的理论是,反应开始发生后24小时内注射,而体液抗体反应倾向于注射后发生7 - 14天(19]。该时间序列,而指向发生过敏性反应或反应性关节炎。反应性关节炎关节内注射后已经报道的化学或生物活性物质如polysulfated葡糖氨基葡聚糖(43)或透明质酸。敏感性旁分泌分子应该考虑干细胞分泌的,因为它是现在普遍接受,干细胞可以有变量的行为取决于他们发展的环境6,44]。渗透压休克或大规模MSC死亡也可以负责这样的反应性关节炎,尽管最近的结果在体外可行性研究报告增加BM-MSC在100%滑液培养72 h,而控制媒体文化(45]。细胞死亡仍然支持的假设两者之间的差异在炎症反应剂量评估在我们的研究中,用更少的反应细胞密度较高时使用。事实上,它已经表明,在密集的悬浮培养软骨细胞在无血清培养基生存,因为他们分泌低分子质量化合物支持自己的生存能力9]。

本研究有两个主要的局限性。首先,设计隐含少量的马,几个MSC来源被注入在同一匹马。因此,统计分析的结果应谨慎对待,并因为没有修正多个测试已经完成。研究设计的另一个后果是,客观的评估每个肢体残废的程度是不可能的,也就是说,这个参数不能被认为是在数据分析。最后,本研究设计有可能诱发系统性效应和影响个人的反应。msc注射的免疫调节功能没有测量在这个研究。尽管msc的免疫调节特性和免疫原性已被广泛报道,已经用于临床的设置(7,46- - - - - -48),这些影响的机制尚未明确定义(46,48,据我们所知,迄今为止执行的研究集中在通用注入msc (49),但没有研究集中在msc的系统性影响当地后关节内的管理。减少人口贩卖的msc据报道由于其尺寸,促进细胞被动诱捕(49]。这可能的联合,滑膜构成blood-joint障碍,这限制了交流滑液及其内容之间的关节腔和血液中50]。系统性效应也可能发生因为MSC-secreting因素或其他的msc分泌的可溶性因子(46]。然而,这也似乎不太可能考虑到马7的结果,所有的关节同时反应。

本研究的第二个限制是缺乏MHC的供体和受体的单体型分析和immunophenotyping马知道如果对MHC匹配或不匹配。如果可用,这种分析将有利于改善机制的理解导致horse-dependent不良反应的发生。证实或反驳一种免疫反应的发生,这也将是有趣的执行重复注射。

5。结论

本研究表明,注入相同的同种异体BM-MSCs个人健康关节引起更多滑膜积液的联合(包括临床和超声)相比,同种异体UCB-MSCs滑液参数无显著差异。总蛋白浓度的增加显著的瞬态和有核细胞数量与单个强度的变化观察MSC注射后无论组织来源。尽管这个海拔滑液参数,CTX-II和铂族元素₂浓度显示msc似乎对软骨保护作用降解而不是有害的。在目前的研究中,这种效果是注入UCB-MSCs后更加明显。这项研究还显示,注射1000万msc /联合诱发更多的临床和超声滑膜积液的迹象,有核细胞总数增加比注入2000万msc。然而,这项研究的结果应该谨慎对待了少量的马,并发管理多个MSC源在同一个体,以及缺乏信息供体和受体匹配,残废等级和滑液分析在第一周的学习。一步一个安全使用的干细胞疗法在未来,结合生物材料作为车辆或用于检查参与组成分泌腺的,不过这项研究强调了需要进一步研究,以便更好地理解的原因引起的反应性关节炎关节内注射的msc马为了寻找新的预防方法。这项研究的结果也将是有用的在人类医学,马被认为是一个可靠的人类骨关节炎模型。

数据可用性

数据库用于支持本研究的结果包括在材料的补充信息。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

莱利亚据托马斯膜,菲利普Galera Magali围捕了同样的工作。

确认

我们感谢Ecuries Lebourgeois和兽医诊所帽别指望(法国圣朱利安苏尔Sarthe)收集马脐带血。这项研究是由ERDF(欧洲区域发展基金)资助SJ, FA, PG, MD (HIPPOCART 1没有。2897/33535,917 rb148;HIPPOCART 917 cb174),由一个诺曼底郡议会程序SJ, FA, PG和MD (HIPPOCART没有。917 2013 -阿勒236/13p07492 cb166),由昏聩Eperon SJ, FA, PG,和MD (917 cb194 EQUISTEM、歌曲到手机上- 2014),由法国国家研究机构(ANR)和诺曼底郡议会通过ANR TecSan PROMOCART程序PG(分别为917 rb020和917 rb072),由法国外交部PG的研究和技术,并通过CENTAURE欧洲项目得到诺曼底县委员会,欧盟的框架ERDF-ESF操作程序2014 - 2020。医学是一个接受者的博士奖学金诺曼底郡议会。结核病是由法国外交部的博士奖学金支持研究和技术。

补充材料

补充1。数据集S1: MSC的可行性测试结果。

补充2。数据集S2:分数和价值观的临床、超声和滑液参数。

补充3。S3数据集:意思是(标准差)或中位数(第一四分位数,第三四分位数)分数和值的临床、超声和滑液参数在48球节从第0天到28天。

补充4。图S1:其次是关节内的滑液取样的msc或安慰剂注射跖趾关节弯曲的一匹马使用横向方法。

补充5。图S2:超声波技术和参考图像。

补充6。图S3:描述马骨髓msc和脐血msc。

补充7。分配表S1: MSC治疗。表S2: msc的质量控制。表S3:对数字的敏感性弯曲测试评分系统。表S4:皮下水肿评分系统。

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