收获的网站影响间充质干细胞的成骨的潜力?

文摘

全髋关节置换术(THA)代表在骨科领域最常见的手术之一。Osteointegration原生的植入骨头是必不可少的一个最优的结果;因此,病人的骨植入物周围的质量(即。骨股票)是至关重要的。然而,在某些情况下,骨股票不足和需要改进与自体移植丰富的多功能细胞(即。,from the iliac crest, from the head of the femur, or from the subchondral bone harvested from the acetabulum) or allogenic frozen bone. It is not known if the harvesting site may influence the osteogenic potential of these cells. Thus, our aim was to characterize and compare multipotent cells collected from the bone marrow, acetabular subchondral bone, and trabecular bone on the femoral head with a focus on osteogenic differentiation. The cells from three sources had a fibroblast-like phenotype and expressed surface antigens CD73, CD90, and CD105 and are negative to CD11b, CD34, and CD45. Although all these cells could be induced to differentiate into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes, they displayed different differentiation potentials. In osteogenic differentiation condition, the cells from the acetabulum had the lowest accumulation of calcium deposit while the cells originated from the bone marrow and femur created a considerably increased amount of the deposit. These findings were confirmed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In chondrogenic and adipogenic conditions, bone marrow cells possessed a predominant differential capacity compared with the others, illustrated by high collagen type II expression together with a cartilage-like lacuna structure and the presence of fat-specific markers, respectively. To our knowledge, this is the first study comparing and demonstrating that the progenitor cells obtained from diverse surgical sites in hip replacement procedure share common characteristics of MSC but differ about plasticity and may provide rational for clinical application in cell therapy and bone grafting. The project number L1033 is registered with ClinicalTrials.govNCT03369457。

1。介绍

更好的卫生保健系统和营养日益改善的生活质量和寿命,导致更多的幸运也容易影响老龄化带来的问题包括肌肉骨骼疾病,即。骨关节炎。经合组织的报告中公布的数据显示2017年,全髋关节置换术(THA)的发病率上升了30%在组织的国家从2000年到2005年(1]。特别是2010年,例THA承认在210万年美国会计0.83%人口2]。在20世纪,约翰Charnley首先介绍他的髋关节置换技术;从那时起,这种技术不断改进克服并发症以及提供长寿的假肢3]。的原则包括更换损坏的股骨头和髋臼金属假体由一个干细胞融合金属或陶瓷股骨头球起到了一定的作用。一个人工插座位于铰髋臼。促进之间的平滑运动“球窝”,金属,陶瓷,或塑料衬垫放置其中。最优的临床结果,植入需要集成与周围的骨头;因此,骨的质量和水平的髋关节(骨股票)是至关重要的手术。但是,在某些情况下复杂的第一个植入或在修订的情况下手术,骨头股票可能是不够的。因此,移植骨可能需要恢复骨股票(4]。

骨缺损是金本位制,因为他们阻止移植排斥和他们提供osteoinduction(成骨细胞刺激、招聘、和/或分化)和osteoconduction(骨骼生长)5];然而,自体骨移植物的可用性是有限的大骨头的缺陷。异体骨,通常morselized和松质骨股头,更可用但它们脱细胞支架(由于冷冻过程);此外,传染性疾病传播的风险不能被解雇(5]。包括羟磷灰石和磷酸三钙陶瓷,综合分析运营商,这是众所周知的骨替代品在整形手术,因为安全,效率,和经济成本6,7]。临床研究由Gali et al。8)表明,自体骨髓送气音和羟磷灰石骨再生增加患者maxillo-mandibular骨性缺陷。在骨科手术的背景下,在活的有机体内研究使用骨髓细胞和磷酸三钙或hydroxyapatite-coated髋臼的杯在兔子和山羊模型,分别证明了这些混合物可以改善osteoinduction osteointegration移植的无菌性松动下降(9,10]。

然而,据我们所知,目前还没有研究寻址和比较不同解剖MSC获得网站在那过程。因此,我们的目标是孤立和识别的多功能细胞髋臼的软骨下骨,从股松质骨碎片和骨髓吸入,这是作为积极的控制。我们利用MSC坚持和成长能力的塑料支架;因此,我们使用密度梯度媒体和特定的设备隔离从骨髓细胞(11]。此外,我们还刺激骨芯片释放细胞没有胶原酶预处理可能影响细胞行为(12];因此,骨头碎片被培养的成纤维细胞生长因子2 (FGF-2),可以改善MSC的增殖和分化13,14]。接下来,多功能细胞进行细胞增殖、克隆形成单位纤维母细胞(CFU-f)和MSC细胞表面抗原的表达流仪分析。最后,在体外分化的细胞成骨,chondrogenic或脂肪形成的血统被qPCR评估特定的组织学染色方法和分析测量的表达特定的信使核糖核酸(mRNA)。此外,对于成骨分化,摘要意思-β添加到成骨的媒介更好地理解细胞分化为成骨细胞的在体外炎症状态。

我们证明了解剖网站影响MSC的多功能潜力。我们的研究结果可能会给一些新的提示为在活的有机体内骨组织工程研究和干细胞疗法。

2。材料和方法

伦理委员会的批准获得IRCCS史Ortopedico Galeazzi。

病人选择9 Galeazzi骨科研究所接受THA手术的患者(意大利米兰)签署知情同意后参加这项研究。

入选标准是年龄在50到80岁之间;身体质量指数(BMI)在18岁和30公斤/米²;没有历史的骨代谢疾病;没有传染性疾病史(艾滋病毒、丙肝病毒、乙肝病毒或梅毒螺旋体)或炎性关节疾病(例如类风湿性关节炎)。

2.1。细胞隔离和外植体培养

骨髓从股管吸入,铰臼软骨下骨碎片,碎片股得到了松质骨的病人。样本储存在4°C和加工(h) 5 - 6小时内手术。

骨髓是稀释1:用消毒1 x 1磷酸盐在1700 g (PBS)和离心10分钟在室温下(RT)。上层清液是小心地删除。这个步骤是重复两次。细胞颗粒在PBS resuspended,第一个测试样本稀释1:10体积/体积(/)在PBS(悬架)。从暂停,第二个测试样本和混合1:1/在4%醋酸(悬挂B)和孵化1分钟(min)消除红细胞和白细胞。从悬架B,第三个测试样本和混合1:1/台盼蓝染色死细胞。镀有核细胞数和密度 细胞/厘米²在完全培养基含有α最低基本培养基(αMEM、生活技术)、10%/胎牛血清(的边后卫,Euroclone),和1%/青霉素、链霉素、谷氨酰胺(P / G / S,生活技术)补充1 ng / ml重组人类FGF-2(研发系统)在t - 175的玻璃瓶。主细胞通道0 (P0)在37°C和5%孵化有限公司₂不干扰1周。然后,媒介改变了每周两次。当细胞达到subconfluence,他们被使用1 x分离胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(胰蛋白酶/ EDTA、生活技术)和通过P2。髋臼的和股骨骨块集中洗PBS去除血液中,然后支离破碎。切碎的芯片在PBS再次清洗,然后保存在完全培养基补充与1 ng / ml FGF-2 6-well盘子。媒介改变了每周两次。当细胞释放部分达到subconfluence,胰蛋白酶/ EDTA添加到井使胰蛋白酶化细胞(骨头芯片接触胰蛋白酶/ EDTA)。这些细胞被扩大到P2。骨头碎片被丢弃在胰蛋白酶/ EDTA治疗两次后。

2.2。纤维母细胞克隆形成单位(CFU-f)测定

细胞密度镀在P1 细胞/ 10厘米菜与FGF-2完全培养基补充。每个实验进行了一式三份,媒介改变了每周两次。两周后,细胞被洗1 x PBS然后绝对固定在甲醇和乙醇(1:1/)10分钟紧随其后的颜色0.5% g / ml结晶紫溶液(溶剂为20%/甲醇)(σ)在室温下15分钟(RT)。然后,细胞与PBS和运行自来水洗两次,消除过度的污点。菜被风干,只包含50多个细胞计数菌落。结果表示为平均至少四个独立实验进行至少4个不同的主要细胞 平均误差(SEM)值。盘子的照片都使用扫描仪爱普生V200(爱普生)。

2.3。细胞增殖和生存能力

2.3.1。结晶紫染色

结晶紫染色进行,以确定在单层培养细胞增殖。细胞被镀的密度 细胞/在完全培养基组成FGF-2 96 -孔板一式五份。在每个时间点,细胞与PBS洗一次,固定和染色50μl着色剂的解决方案(克/毫升0.75%结晶紫(σ),g / ml氯化钠0.35%,32.3%/绝对乙醇,35%/在RT 10%福尔马林)20分钟,最后用水洗了5次和风干。通过使用亮视场显微镜照片(莱卡)。100年μ洗脱液的解决方案(50%的l/绝对乙醇和1%/醋酸)添加到每个好,染料吸光度测量在570 nm波长使用标模型680 (Bio-Rad)。实验至少重复三次至少三个不同的原代细胞培养。

2.3.2。5-dimethylthiazol-2-yl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)污渍

MTT染色剂被用来研究细胞生存和增殖培养的颗粒在悬浮培养(见2.5。2)。文化表现在15毫升猎鹰管的密度 细胞/ 0.5 ml /管21天。实验至少重复三次一式三份至少三个不同的原代细胞培养。污点,管在1700 g离心5分钟,球与PBS洗一次,和0.5毫升无血清培养基补充25μl 5毫克/毫升的MTT(σ)股票的解决方案是添加到管道中。在黑暗中细胞孵化1 h。然后,颗粒与PBS洗两次。1毫升的绝对乙醇添加到每个管;管是涡为1分钟溶解紫色甲瓒。着色剂的吸光度测量在570/670 nm波长通过使用分光光度计Ultrospec 2100 (Amersham生物科学)。

2.4。流仪结果

当细胞达到80%的融合,他们分离使用胰蛋白酶/ EDTA和resuspended污点缓冲区组成1 x PBS和3%/的边后卫,阻止非特异性抗原。圆底细胞悬液分为聚苯乙烯管的密度10⁵细胞/管。在4°C孵化了20分钟在黑暗中使用单克隆抗体CD11b(克隆ICRF44) CD34(581年克隆),CD45(克隆HI30) CD73(克隆AD2), CD90(克隆5 e10汽油),和CD105(克隆266)。自动补偿,anti-mouse搞笑,κ使用/负控制补偿粒子集。所有的试剂都购自BD生物科学。此外,更好的解释结果和控制,我们还使用了荧光- 1 (FMO)方法,在管包含所有的抗体,除了一个被测量。染色后,细胞被洗与PBS resuspended在0.5毫升污点缓冲区,并运行通过流式细胞分析仪BD流式细胞仪第二章(BD生物科学)。数据分析软件FlowJo。

2.5。在体外分化

2.5.1。脂肪形成的分化

诱导脂肪形成的分化,细胞培养与FGF-2在完全培养基补充 细胞/ 24-well盘子或 /好油红O染色和qPCR 6-well板块,分别。油红O染色,实验进行了一式三份。当细胞汇合的,媒介改变了脂肪形成的媒介完全培养基由50μ10 g / ml抗坏血酸,⁷地塞米松,5 ng / ml胰岛素,3-isobutyl-1-methyl黄嘌呤,0.5毫米和0.1毫米吲哚美辛。所有的试剂都买了从σ。完全培养基作为控制。感应媒体是刚做好的,改变了每周两次。感应持续了3周。

2.5.2。Chondrogenic分化

如前所述(执行chondrogenic诱导分化15)进行小修改。在这项研究中,细胞悬浮在15毫升猎鹰管在完全培养基含有50μg / ml抗坏血酸(σ),10⁷M地塞米松(σ),10 ng / ml重组人类转化生长因子-β1 (TGF -β1、研发系统)的密度 细胞/ 0.5 ml /管免疫组织化学和甲苯胺蓝染色 MTT测定细胞/ 0.5 ml /管,和 细胞/ 0.5 ml / qPCR管。媒体改变了每周两次。文化是保持21天。

2.5.3。成骨分化

刺激成骨分化,细胞首先培养与FGF-2在完全培养基补充 细胞/ 24-well盘子或 细胞/板材在6-well茜素红染色和qPCR,分别。茜素红S染色剂,实验进行了一式三份。当细胞达到融合,媒介转向成骨的介质(OM)完成介质包含50μg / ml抗坏血酸(σ),10⁷M地塞米松(σ),10毫米βglycerolphosphate(默克公司)。此外,50个pg / ml摘要意思-β(研发系统)也添加到OM。摘要意思-的浓度β用于这个实验过程推断从文献数据16- - - - - -18]。完全培养基作为控制。OM和OM补充摘要意思-β准备新鲜和添加到细胞每周两次。分化是长时间为3周。

2.6。细胞染色和免疫组织化学

2.6.1。油红O染色

油红O染色用于染色由脂肪细胞脂滴。工作染色溶液制备新鲜(24小时)在实验前通过混合6:4/0.5%的油红O解决方案(σ)和蒸馏水,然后解决方案是沉淀过滤丢弃。PBS的细胞被洗一次,固定在10%福尔马林10分钟,再洗与PBS去除福尔马林。PBS是完全移除之后,颜色在10分钟的工作解决方案rt,然后,细胞在60%异丙醇溶液洗一次30秒(s),用蒸馏水冲洗3次。与彩色照片的细胞液滴都被立即采取使用亮视场显微镜(莱卡)。然后,水被删除,和彩色滴溶解在异丙醇溶液(1毫升/)。染料吸光度测量在510 nm波长使用分光光度计Ultrospec 2100。

2.6.2。阿甲苯胺蓝染色

阿甲苯胺蓝染色剂被用来观察软骨矩阵。着色剂染色细胞核蓝色、蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖如淡蓝色紫罗兰。细胞颗粒在PBS洗两次,在RT在10%福尔马林固定了15分钟,然后包含在石蜡,切成5μm部分SuperFrost +粘附幻灯片(热费希尔科学),以前涂poly-L-lysine(σ),防止部分分离。

颜色,幻灯片deparaffinized和下降0.2%/甲苯胺蓝O解决方案(粉末是由美国赛瓦,德国)在RT 5分钟紧随其后在蒸馏水冲洗两次,每次5分钟,安装DPX安装介质。

2.6.3。免疫组织化学

幻灯片是如上所述。deparaffinization后,抗原检索过程是由浸在沸腾的幻灯片柠檬酸缓冲(pH值6)和冷却20分钟的RT。接下来,部分permeabilized在PBS 10分钟RT Triton 0.2%,与PBS洗了三次,每5分钟,孵化4%过氧化氢为30分钟RT阻断内源性过氧化物酶活性。然后,幻灯片在透明质酸酶II型(σ)孵化1毫克/毫升的浓度在PBS (pH值6)30分钟37°C的分解矩阵和阻塞在10%的边后卫1 h RT其次是孵化主要抗体anti-collagen I型(ab138492 Abcam)和anti-collagen II型(ab34712 Abcam) 16 h在4°C。与PBS洗涤后,部分被孵化与anti-rabbit生物素化的抗体(1:500年,Dako) 30分钟在RT,洗在PBS,孵化的链霉亲和素过氧化物酶在RT (Dako) 30分钟,然后沾3 3 - - - - - -Dako diamino-benzidine (DAB) 3分钟,在迈耶的苏木精复染色1分钟,浸泡在蒸馏水中含有一些NH滴1米₄发蓝哦(σ),安装DPX安装介质。通过光学显微镜照片(DM5000 B,徕卡)。

2.6.4。茜素红S染色

观察诱导细胞的矿化成骨分化,茜素红S染色使用。短暂,细胞与PBS洗一次,固定在10%福尔马林10分钟,洗两次PBS,沾在2%/茜素红S溶液pH值4.2(σ)的粉末是购买在RT 10分钟,用蒸馏水洗净。盘子被风干后。溶解的钙沉积,1毫升的洗脱溶液含20%甲醇和10%醋酸添加到每个为30分钟,孵化RT温柔的移液和颤抖。染料的吸光度测定波长450纳米。实验重复了至少六次至少五个不同的原代细胞培养。

2.7。qPCR

qPCR进行检查从分化细胞中提取的mRNA的表达。总RNA分离利用RNeasy迷你包(试剂盒)。NanoDrop 8000(热费希尔科学)是用来评估RNA质量和纯度。如果需要,RNA被混合沉淀1:3/冷绝对乙醇和1:0.1/3 M醋酸钠和孵化16 h−80°C。1μg的RNA被使用ImProm II逆转录系统相对地转录(Promega)热循环(Euroclone)。进行了放大的cDNA使用PowerUp SYBR大师(热费希尔科学)和混合引物从欧陆坊(德国)购买7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)。引物的序列表中列出1。反应板运行的三个阶段:持有阶段始于50°C 20 s,然后10分钟95°C,循环阶段是重复40周期的反应是保持在95°C 15秒,然后60°C 1 m,最后融化曲线阶段,盘子被设定在95°C 15年代,紧随其后的是60°C 1 m, 95°C 30年代,15秒和60°C。相对基因表达是根据比较方法(192)数据提出了^−ΔΔCt或2^−ΔCt与 (感兴趣的基因)- ct(管家基因)和 在一天 - - - - - -∆Ct在第0天, 天的分化。

2.8。统计分析

所有数据都作为手段和平均数标准误差(SEM)。统计分析是由使用未配对 - - - - - -测试GraphPad的在线应用软件(https://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1);分析细胞增殖的贴壁培养条件下,非参数Mann-Whitney测试应用双尾假设是(https://www.socscistatistics.com/tests/mannwhitney/)。分析被认为是重要的如果值< 0.05。

3所示。结果

3.1。形态学、增殖和细胞的表型特征附着条件

第一个标准来确定MSC是他们坚持一个塑料的支持(20.]。利用这个基本的MSC的特性,我们使用一个非常简单的方法来分离MSC骨髓(BMC)和股骨(FC)和髋臼的骨头(AC)芯片的外植体的文化。骨髓样本清洗和没有干扰;一周后,为外植体培养观察贴壁细胞,纤维母细胞大约两周后,第一个被释放从芯片(图1(一))。此外,细胞也逐渐形成殖民地从电镀密度低,演示图1 (b)。电镀细胞14天后,交流显示出明显的集落形成能力与细胞从骨髓和股骨(分别为1.5和1.6倍增加)。细胞生长也调查了与结晶紫染色的细胞随着时间进程的解决方案。图1 (c)显示了一个重要的交流和FC与BMC ( 和 ,分别)。细胞增殖的差异也见图1 (d):6天培养细胞的骨髓还没有达到融合。相比之下,AC和FC紧张,特别是交流出现小得多比其他人尽管相同播种密度推断更快的增长。

更全面地描述从三个来源的细胞群,我们用流式细胞术对标记的表达谱(图进行评估1 (e))。BMC拥有较低的百分比等造血细胞和内皮细胞的标记CD11b、CD34、CD45与AC和FC,没有显著差异。此外,没有显著差异表达的细胞表面标记通常用来定义MSC CD73等CD90、CD105。

3.2。体外脂肪形成的分化

揭示了在体外脂肪组织的形成,细胞暴露在脂肪形成的媒介21天。7天之后,小胖液泡被油红O染色,检测和它们的大小和密度增加,如图2(一个)。量化的染色脂肪滴在510海里,是由测量吸光度和结果褶皱增加诱导细胞和控制细胞之间的吸光度。在图的图表2(一个)证明,即使在早期治疗,仍有显著增加细胞的脂肪形成的能力方面的天0。三个来源的细胞也有类似的表达的脂肪滴。因此,qPCR进行进一步评估两个脂肪形成的标记的基因表达:LPL和PPARG(图2 (b))。有趣的是,所有三个细胞类型显示LPL表达高于PPARG。BMC和FC显示表达式LPL的时间增加,诱导细胞之间的显著差异和控制细胞从天14 (BMC) 7 (FC),虽然LPL表达在第七天交流达到了显著差异,它在第14天达到峰值,然后在21天下降。PPARG表达诱导FC随着时间的推移,更高的价格相比控制细胞但不显著。

我们也比较LPL和PPARG三种细胞类型。BMC显示更高的表达LPL和PPARG最新的时间点,如图的最后两个图表所示2 (b)。此外,PPARG表达式的差异统计学意义后21天BMC和交流之间的关系。

3.3。体外Chondrogenic分化

为了揭开chondrogenic能力的细胞,我们使用了颗粒培养法在三维悬浮状态,更紧密地模仿在活的有机体内软骨微环境。首先,我们研究了在二维附着条件下细胞增殖(图1 (c))。细胞生存能力的评估和/或增殖悬浮条件还建议预测细胞行为自分化在三维环境中可能会干扰扩散。图3(一个)代表悬浮细胞增殖:BMC保持几乎不变增长而AC和FC不断激增。在21天,FC展示一个令人印象深刻的增长能力与BMC和AC(分别为3.76和1.69倍增加)。

然后我们进行软骨表型的分析通过分析粘多糖沉积和软骨标记的表达,即胶原蛋白II型和Sox9。不幸的是,在体外总是产生纤维软骨软骨形成胶原蛋白的表达类型我22];因此,在这项研究中,我们也评估它的表达式。使用阿甲苯胺蓝染色观察细胞外基质的颗粒的形成。图3 (b)显示所有的细胞能够形成颗粒,但是染色的强度改变的群体。BMC颗粒表现出局部紫区14天显示初始的形成在体外软骨基质;21天的治疗后,紫区扩大,覆盖大部分的部分。更有趣的是,我们也观察软骨细胞的软骨典型的腔隙结构嵌入(insets图3 (b))。另一方面,AC和FC只显示矩阵的浅蓝色的颜色没有任何空隙结构甚至在最长的时间点。胶原蛋白的生产分析了I型和II型胶原免疫组织化学(图3 (b))。在第14天,BMC和FC表示一个强信号比AC胶原蛋白II型;然而,在21天,FC显示更加剧的信号比BMC胶原蛋白II型。胶原蛋白类型我出乎意料地出现在所有细胞颗粒表明unselective分化虽然长在三维条件下文化。

我们也调查了胶原蛋白I型基因表达,胶原蛋白II型,chondrogenic特定标记Sox9 qPCR(图3 (c))。在21天的文化,胶原蛋白I型表达式在BMC和FC与同期相比下降时间点;这个结果中没有交流,虽然没有发现显著差异。更重要的是,经过21天的感应,胶原蛋白II型表达式在BMC细胞达到峰值,相比明显高于AC和FC细胞来源(分别为6.58和6.78倍增加)。BMC显示增加Sox9表达式而不是一个重要的方式,而在交流和FC,表达随时间明显减少。这些发现证实了上述的组织学观察。

3.4。体外成骨分化

融合性的细胞诱导分化成成骨细胞在OM或与il - 1 OM补充β条件。茜素红染色图4透露,即使在长时间实验,交流是最迟钝的细胞条件OM和il - 1β而BMC和FC开始反应第七天的感应。OM和il - 1β条件,从第14天开始,AC最低钙积累对另外两个细胞来源(最后两个图表如图4)。在OM条件、BMC显示最高水平的矿藏,而il - 1β条件从14天,FC发布最存款数量的提升;虽然在两种情况下,测量这两个组之间无显著差异。染色也证实il - 1的存在β在适当的浓度不干扰细胞的矿化成骨分化的媒介。

我们还执行qPCR(图5)全面调查基因表达成骨的标记,如高山(早期骨),骨桥蛋白(中间阶段成骨)和骨钙素(晚期骨)23]。BMC和FC暴露在OM或il - 1β条件高山高度表达的基因在最早的时间点(7天),然后表达减少。

在AC,高山表达在不同的时间点是与天0相比更低但没有显著差异。在FC,骨桥蛋白基因表达的一个重要upregulation注意到第七天,而在BMC和交流,一个重要的区别是观察到的当天晚些时候在14和21天,分别。此外,骨钙素基因表达的一个重要upregulation只发现在FC 14天、21天与天相比0。正如前面所提到的,我们将在标准的OM培养基培养细胞与细胞培养与50 pg / ml il - 1 OM补充β在增加骨生成,测试其可能的作用。茜素染色,我们没有观察到足够不同矿化两个条件OM和il - 1之间β(图4),而通过qPCR,我们指出,il - 1β使用时在成骨的50 pg / ml浓度介质可能会增加骨桥蛋白表达在BMC和FC在第14天,第七天,分别。

图的图表在最后两行5高山相比,骨桥蛋白和骨钙素基因表达的细胞在每一个条件。在OM条件、BMC和FC显示显著upregulation高山基因表达与交流相比;特别是,在FC,显著差异出席第七天。骨桥蛋白基因表达显著调节与交流(BMC相比 在第七天 在第14天)。骨钙素基因表达没有明显变化的三个不同的细胞来源。最后,在OM标准条件,BMC通常显示upregulation的所有三个标记与FC相比,虽然没有显著差异。

在OM + il - 1β条件、BMC和FC也显著upregulation高山和骨桥蛋白基因表达与交流。此外,我们只观察到显著区别BMC和FC在第14天骨桥蛋白基因表达;特别是,骨髓细胞产生了更高的骨桥蛋白( )。所有这些研究结果表明,骨骨髓来源的细胞的成骨的潜力相比还是相当竞争力的祖细胞释放股骨头碎片。

4所示。讨论

msc的异质性,这不仅与捐赠者捐赠还取决于组织的来源,讨论了在以前的作品(24- - - - - -26]。因此,msc的搜索和选择最好的来源为一个特定的临床应用是必需的。特别是,据我们所知,小工作一直比较multipotency从外科网站获得的细胞在人工髋关节置换术。在这项研究中,我们分离,而髋关节置换细胞来源于不同的组织过程:从股管收集的骨髓(积极控制、BMC)的髋臼的软骨下骨(AC),并从股骨颈骨小梁的碎片和头部(FC)。我们工作的目的是分析潜在的细胞来源之间的差异可能对新技术应用的骨修复。我们的研究证明了三种类型的细胞分享MSC的身份,但他们显示不同的细胞谱系分化,可能表明细胞变化的承诺。

CFU-f试验被认为是黄金标准评估祖细胞的具备干细胞(27,28];即从一种稀缺电镀数量,祖细胞可以把塑料培养皿,增殖,形成殖民地。细胞释放的髋臼显示一个伟大的集落形成能力与细胞从骨髓和股骨。这个发现是一致的贴壁培养中的增殖试验展示了引人注目的增长能力交流。我们没有观察到在细胞标记显著差异表达,因为所有造血细胞为阴性的标记(CD11b、CD34、CD45)和阳性MSC标记(CD73 CD90、和CD105)。

髂骨骨髓被接受为“黄金标准”来源MSC隔离(29日,30.因为容易访问和高含量的红色的骨髓。骨髓获得股管也被红色的骨髓和黄色骨髓脂肪细胞组成。即使所有的细胞分离的三个来源形成可见脂肪滴,原始组织的存在可以解释为主要表达的脂肪LPL基因标记PPARG BMC相比AC和FC暴露在脂肪形成的媒介。的概念骨髓干细胞利基,骨髓代表msc的微环境和造血干细胞(hsc)居住,是众所周知的31日- - - - - -34]。利基,MSC是一个主要的球员(32)相互作用,协调,保持体内平衡的微环境。因此,msc更天真,能够快速反应的微环境分化需要取代死亡或受损的细胞。事实上,chondrogenic刺激下,BMC得以形成在体外胶原蛋白II型的缺损具有较强的表达和高数量的粘多糖,而交流,特别是FC显示一个劣质chondrogenic潜在如图所示通过组织学和基因表达。因此,交流和FC祖细胞可能分化成软骨细胞如果适当的刺激,但其内在chondrogenic潜力较低而骨骨髓来源的细胞。在成骨的条件下,我们发现显著差异之间的细胞来源:量化茜素红染色表明,BMC和俱乐部都有一个更高的能力形成钙沉积。这也证实了基因的成骨的标记高山,骨桥蛋白和骨钙蛋白。因此,骨小梁细胞克隆的股骨头颈拥有更高的内在细胞成骨的潜力而孤立于髋臼的软骨下骨。

我们也证明炎症环境中,通过补充摘要意思——成骨的媒介β在低剂量(50 pg / ml),不影响成骨分化。此外,我们的研究结果表明,控制炎症的刺激可以促进多功能细胞的成骨的潜力没有导致细胞死亡或组织损伤。

总之,我们的研究分析和比较了multipotency细胞来源于不同的解剖网站在髋关节置换手术:股骨的骨髓运河,关于髋臼软骨下骨碎片,碎片从股骨颈的骨和头部。我们的数据证实,bmc是最通用的多功能细胞,因为它们显示类似的脂肪形成的,chondrogenic,成骨的潜力。此外,我们证明了FC具有显著提高成骨的潜力而交流。因此,这些细胞可能是precommitted成骨的血统。这部小说发展的发现可能是重要的骨股票恢复的新技术和新骨组织工程的策略。事实上,这些细胞的内在成骨原来可能允许更快和更好的骨修复。

总之,回答我们最初的问题,收集网站多功能细胞的成骨潜能的影响在体外设置。在活的有机体内研究将需要确认我们的初步结果。

数据可用性

GraphPad棱镜文件和所有的血细胞计数数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

附加分

项目数量与ClinicalTrials.gov L1033登记NCT03369457。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持Ricerca Corrente格兰特的意大利卫生部指派给劳拉Mangiavini。

引用

1. 经合组织健康一眼2017年的报告,经合组织(OECD)出版,2017年。
2. k . h . Maradit d·r·拉尔森c·s·克朗逊et al .,“总髋关节和膝关节置换的流行在美国,“《骨与关节Surgery-American体积,卷97,不。17日,第1397 - 1386页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. b . m . Wroblewski p·d·Siney p·a·弗莱明,“-43年Charnley髋关节置换术的临床成功,”Acta chirurgiae orthopaedicae et traumatologiaeČechoslovaca,卷73,不。1,6 - 9,2006页。视图:谷歌学术搜索
4. 诉m·戈德堡”,选择全髋关节置换术的骨骼移植修改”临床骨科和相关研究卷,381年,第76 - 68页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. t Albrektsson和c·约翰逊Osteoinduction osteoconduction和骨整合,“欧洲脊柱杂志》补充2卷。10日,s96 - 101、2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. m·r·怀特豪斯和a·w·布鲁姆”使用陶瓷骨替代品在人工髋关节置换术修订,“材料,卷2,不。4、1895 - 1907年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 诉坎帕纳,g .米兰大肠Pagano et al .,“骨替代品在骨科手术:从基础科学到临床实践中,“材料科学杂志:材料在医学,25卷,不。10日,2445 - 2461年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. r . s . Gali s . k . Devireddy n·m·拉奥et al .,“自体骨髓抽出物合成羟磷灰石涂层的重建maxillo-mandibular骨性缺陷:一个前瞻性研究,“颌面及口腔外科杂志》上,16卷,不。1,第78 - 71页,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. s . m . Rabiee s·m·j . Mortazavi f . Moztarzadeh et al .,”协会的一个合成骨移植和骨髓细胞复合生物材料,”生物技术和生物过程工程,14卷,不。1、1 - 5,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. p .氧化钾m . j . Coathup s Oussedik et al .,“增强骨生长在髋臼的杯表面使用骨髓基质细胞在全髋关节置换手术,”组织工程部分,15卷,不。12日,第3696 - 3689页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. m . Pierini b,凡塔齐尼大肠卢卡雷利et al .,“有效的隔离和浓缩从骨髓间充质干细胞,”Cytotherapy,14卷,不。6,686 - 693年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. r . Tuli Tuli,美国南帝et al .,”表征multipotential间叶细胞祖细胞来源于人类的骨小梁,”干细胞,21卷,不。6,681 - 693年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. r .《m . Gaetani大肠Molino et al .,“bFGF的角色对MSC激活内源性再生机制的能力在一个异位骨形成模型,”生物材料,33卷,不。7,2086 - 2096年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. p . Coipeau p .安全a Langonne et al .,“受损分化潜力的人类骨小梁间充质基质细胞从老年病人,”Cytotherapy,11卷,不。5,584 - 594年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 诉t阮、r . Cancedda和f . Descalzi“血小板溶解产物激活静止人体关节软骨细胞增殖和重组:参与缺氧诱导因子1”组织工程和再生医学杂志》上,12卷,不。3,pp. e1691-e1703, 2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. t . v . a . w . Cheng稳定,m . Bolognesi和v b·克劳斯”硒代蛋氨酸抑制il - 1β诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和环氧合酶2 (COX2)表达在初级人类软骨细胞,”骨关节炎和软骨,19卷,不。1,第125 - 118页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. m·穆米c . Scotti Interleukin-1 Papadimitropoulos et al。。β调节软骨内骨化,成人骨髓基质细胞,”欧洲细胞和材料,24卷,第236 - 224页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. c . Scotti e . Piccinini h . Takizawa et al .,”工程的功能性骨器官通过软骨内骨化,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷110,不。10日,3997 - 4002年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. k . j . Livak和T . d . Schmittgen相对基因表达数据的分析使用实时定量PCR和2(-它δC (T))方法,”方法,25卷,不。4、402 - 408年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. m . Dominici k·勒布朗,穆勒et al .,“最低限度标准定义多功能间充质基质细胞。被国际社会公认为细胞治疗位置声明。”Cytotherapy,8卷,不。4、315 - 317年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. t . d . Schmittgen b·a·扬,“实验处理对管家基因表达的影响:验证通过实时定量rt - pcr,”生物化学和生物物理方法杂志》上,46卷,不。1�2,69 - 81年,2000页。视图:谷歌学术搜索
22. k . Pelttari大肠Steck w·里希特,“使用间充质干细胞软骨形成。”受伤,39卷,不。1,58 - 65、2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. g·r·贝克Jr . b . Zerler, e·莫兰“磷酸盐是一种特定信号诱导骨桥蛋白基因表达,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷97,不。15日,第8357 - 8352页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. c·m·麦克劳德和r·l·莫克”间充质干细胞的起源和影响异构性:单细胞分析、新见解和新兴工具”欧洲细胞和材料34卷,第231 - 217页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m . Pevsner-Fischer s·莱文,d . Zipori“间充质基质细胞异质性的起源,”干细胞的评论和报道,7卷,不。3、560 - 568年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. d . g . Phinney功能异质性的间充质干细胞:影响细胞疗法,”细胞生物化学杂志》上,卷113,不。9日,第2812 - 2806页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. n . j . Sarma a . t . NJ和n . r . Yaseen”集落形成细胞(CFC)测定人类造血细胞,”《可视化实验,18卷,不。46岁的第2195条,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. r . Veyrat-Masson n . Boiret-Dupre c Rapatel et al .,“新鲜骨髓间充质内容:细胞疗法,提出质量控制方法”英国血液学杂志》,卷139,不。2、312 - 320年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. m . f . Pittenger a . m .麦凯s c·贝克et al .,“Multilineage成年人类间充质干细胞的潜力。”科学,卷284,不。5411年,第147 - 143页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. g·考克斯s . a . Boxall p v Giannoudis et al .,“高CD271丰富⁺multipotential基质细胞(msc)髓内腔长骨头,“骨,50卷,不。2、510 - 517年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. p·比安科,“摘要:隔壁的干细胞:骨骼和造血干细胞“利基”骨头。”内分泌学,卷152,不。8,2957 - 2962年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. a . Ehninger和a . Trumpp骨髓干细胞利基成长:间充质干细胞和巨噬细胞的迁移,”实验医学杂志,卷208,不。3、421 - 428年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. y Kfoury和d . t . Scadden干细胞利基,间充质细胞贡献”细胞干细胞,16卷,不。3、239 - 253年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. n .浅田和另外美国Takeishi, p . s . Frenette“骨髓造血干细胞利基的复杂性。”国际血液学杂志》,卷106,不。1,45 - 2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2019 Nguyen Van Thi等。这是一个开放访问分布在条知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。