MicroRNA-28-5p通过IGF-1途径调控肝癌干细胞增殖

抽象的

背景．MicroRNA（miRNA）在癌症干细胞（CSC）的调节中起着关键作用。然而，miRNA在肝脏CSC中的作用尚未完全阐明。方法．使用实时PCR检测肝癌干细胞（CSC）中miR-miR-28-5p的表达。miR-28-5p对体内和体外体内的肝脏CSC扩增的影响。在患者衍生的异种移植物（PDX）中进一步评估了HCC中MiR-28-5P表达和索拉非尼的益处之间的相关性。结果．我们的数据发现，miR-28-5p在排序EpCAM-和CD24阳性肝肿瘤干细胞下调。生物功能调查显示，击倒的miR-28-5p促进肝脏CSC自我更新和肿瘤的发生。一致的是，的miR-28-5p表达抑制肝脏CSC的自我更新和肿瘤发生。Mechanistically, we found that insulin-like growth factor-1 (IGF-1) was a direct target of miR-28-5p in liver CSCs, and the effects of miR-28-5p on liver CSC’s self-renewal and tumorigenesis were dependent on IGF-1. The correlation between miR-28-5p and IGF-1 was confirmed in human HCC tissues. Furthermore, the miR-28-5p knockdown HCC cells were more sensitive to sorafenib treatment. Analysis of patient-derived xenografts (PDXs) further demonstrated that the miR-28-5p may predict sorafenib benefits in HCC patients.结论．我们的发现揭示了miR-28-5p在肝脏CSC扩增和索拉非尼应答中的关键作用，使miR-28-5p成为HCC的最佳治疗靶点。

1.介绍

肝细胞癌（HCC）是世界上最恶劣的肿瘤之一，特别是在亚洲国家[1］．大多数HCC患者诊断为晚期，失去了手术机会[2］．肝肿瘤切除，消融和肝移植仅适用于在早期诊断的患者[3.］．对于这些具有晚期肝癌的患者，没有良好的治疗策略。Sorafenib是高级HCC患者最常用的靶向药物，而其治疗效果并不令人满意[4，5］．多项研究探索了癌细胞的内在机制和影响HCC引发和进展的外部微环境因素;然而，我们对这些机制的理解仍然不完整。

越来越多的证据表明，肝癌干细胞（CSCs）参与调节肿瘤起始，进展，复发和耐药性[6，7］．肝CSC是一小群肝癌细胞，可通过一系列肝CSC标志物进行识别，包括上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、CD24、CD90、CD133和OV6 [8- - - - - -12］．有报道称，cd24阳性肝肿瘤启动细胞通过stat3介导的NANOG调控来驱动自我更新和肿瘤启动[9］．许多研究也表明，复发和肝癌的化疗耐药是由于肝肿瘤干细胞的存在[13］．因此，迫切需要探索肝CSCs增殖的潜在机制。

MicroRNA（miRNA）包含一类小的，非编码的RNA，其通过与3的结合来调节基因表达的RNA沉默和后术式 -靶mrna的UTR [14］．mirna的放松管制已经涉及许多人类疾病，特别是人类癌症[15］．种miRNA也报道了造血干细胞的调节以及造血恶性肿瘤[待牵连16］．例如，miR-181b/Notch2通过调节非小细胞肺癌中的癌症干细胞样性质来克服化疗耐药性[17］．因此，肝脏csc特异性miRNAs可能是癌症治疗的潜在靶点。既往研究发现miR-28-5p在HCC组织中下调，抑制肝癌细胞的增殖和迁移。然而，miR-28-5p在肝脏CSCs中的生物学功能尚不清楚。

在这项研究中，我们证明了的miR-28-5p表达在肝肿瘤干细胞下调。功能测试表明的miR-28-5p缺乏导致肝脏CSC自我更新和肿瘤的上调。进一步的机制研究发现，IGF-1是肝脏肿瘤干细胞的miR-28-5p的直接目标。更重要的是，我们发现的miR-28-5p起着肝癌细胞的索拉非尼的敏感性具有重要作用。总之，我们的研究结果表明在肝脏CSC扩张和索拉非尼响应的miR-28-5p的关键作用。

2.材料和方法

2．1.肝癌病人的组织

在东部肝胆外科医院(EHBH)行原发性肝细胞癌切除术的患者中收集50例肝细胞癌样本;详细的临床病理特征描述在在线补充表1．也获得病人知情同意，和人类样品采集的程序批准EHBH的伦理委员会。四HCC患者组织被用于分离的原代HCC细胞。四十HCC患者的组织被用于分析的miR-28-5p和EpCAM，CD24，或IGF-1之间的关系。六肝癌患者的组织被用于PDX分析。

２.２.细胞培养

肿瘤细胞的患者来源的主HCC培养物从先前描述的HCC患者的新鲜肿瘤样品获得的[18］．通过胶原酶灌注和离心分离人的原发性肝癌细胞。简而言之，在含有双抗体的预冷却无菌PBS缓冲液中用双抗体洗涤肝癌组织，以除去血液和结缔组织，GBSS混合酶溶液用于消化和离心，并弃去上清液;通过细胞滤液通过细胞瘤蓝染色检测细胞活性，通过细胞计数在瓶中培养后的细胞计数后，在37℃和5％CO的细胞计数后，具有完全培养基重悬浮液接种₂环境文化，然后细胞形态学鉴定。

HCC细胞株Huh7和HepG2在添加10%胎牛血清(FBS)和2 mM l -谷氨酰胺的Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM)中培养μ.g/ml庆大霉素，并保持在37°C的5% CO₂孵化器。Huh7和Hepg2感染了miR-28-5p海绵或miR-28-5p模仿慢病毒，并通过嘌呤霉素筛选其对照慢病毒（Ribobio，上海，中国）和稳定的感染剂。

2.3。RNA干扰

小干扰性RNA（siRNA）对IGF-1和NC（阴性对照）的siRNA被锐博（中国上海）合成。siRNA靶序列在补充表列出S3．根据制造商的说明书(Polyplus, Illkirch，法国)，使用siRNA转染试剂将siRNA转染到肝癌细胞中，最终浓度为200 nM。在转染24-72小时后，收集细胞或进行进一步的下游实验。western blotting验证基因敲除。

2.4。动物模型

所有小鼠实验均按照中国科学院宁波华美医院动物护理和使用委员会的指导方针进行。4 - 6周龄雄性无胸腺NOD-SCID或裸鼠(SIPPR-BK实验动物公司，中国)在标准的无菌条件下饲养和饲养。

为在活的有机体内有限稀释法，肝细胞瘤细胞被连续稀释至指定剂量（ ， ， ，和 ）并与基质(1:1)混合。然后，将混合细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠( ）.之后的两个月，处死小鼠并计数肿瘤的数目。

对于患者来源的异种移植物（PDX）模型，如先前所述用于异种移植物建立获得的原代HCC肿瘤样品[19］．收集6例HCC患者的手术标本。置于干净的磷酸盐缓冲盐水(PBS)离心管中，置于冰盒中运送至动物中心(组织保存时间为30 min-60 min)。肿瘤立即被分成组织块 ．70％乙醇用于消毒皮肤上小鼠的右侧背部，并用于在小鼠的移植部位局部浸润麻醉0.5％利多卡因。一个small incision about 0.3 cm long was cut off with scissors on the back of the right lower limb of the mice, and 1-2 pieces of the divided tumor tissue were sent to the subcutaneous and pressed for about 2 minutes. This is the establishment of the original PDX animal model, called P0 generation. The subcutaneous tumor of P0 mice grew to about 1,000 mm^3.．肿瘤被解剖并放入无菌培养皿中。部分组织置于4%中性甲醛溶液中固定。剩下的组织被用来分割肿瘤到大约 ．根据上述方法移植五至十周裸鼠，第1代的PDX动物模型称为P1代。每周定期测量小鼠的体重和肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。当P1生成裸鼠的皮下肿瘤成长为约1,000毫米的尺寸^3.，根据该方法建立了几代人2,3和4的PDX动物模型，其分别称为世代P2，P3和P4。用异种移植物的小鼠每天口服给予索拉非尼（60mg / kg）或载体30天（ 为每个组)。在指定的时间点测量肿瘤体积。所有程序和方案均经华美医院伦理委员会批准。肿瘤 ．

2.5。球体分析

将HCC细胞接种于96孔超低贴壁培养板(Corning Incorporated Life Sciences)(每孔300个细胞)，在添加1%胎牛血清、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的DMEM/F12 (Gibco)培养液中培养7天。统计球体的数量，并显示有代表性的视图。实验结果重复了三次。

2.6。体外极限稀释法

将HCC细胞接种于96孔超低附着培养板(康宁生命科学公司)(每孔2、4、8、16、32和64个细胞( ）））在添加1%胎牛血清、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的DMEM/F12 (Gibco)培养液中培养7天。采用ELDA软件评估CSCs比例(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html) [20.］．实验结果重复了三次。

3.Flow-Cytometric分析

为了进行CD24和epcam阳性细胞的分选，将原代肝癌患者的细胞和HCC细胞与原代抗CD24 (Cat)孵育。不。ab202073;Abcam)或anti-EpCAM (BioLegend, Inc.， San Diego, CA)在室温下保存30分钟。然后，根据制造商的说明，使用Beckman Coulter(印第安纳波利斯，IN, USA)的MoFlo XDP细胞分选机对细胞进行流式细胞仪检测。从三个独立实验中分离的细胞进行实时荧光定量PCR检测。

肝癌细胞与初级抗EpCAM，在室温下孵育30分钟。根据制造商的说明使用MoFlo XDP从Beckman Coulter公司，进行流式细胞分析。实验结果重复了三次。

3．1.细胞凋亡检测

HCC细胞用索拉非尼治疗（10 μ.M) for 48 h, followed by staining with Annexin V and 7-AAD for 15 min at room temperature in the dark. Apoptotic cells were determined by an Annexin VFITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA) and flow cytometer according to the manufacturer’s instructions. The results were repeated three times.

３．２．荧光素酶报告实验

3 -IGF1质粒和突变质粒的UTR已有描述[21］．荧光素酶报告基因检测，将肝癌细胞接种于24孔板上，并用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)共转染，每孔100 ng的荧光素酶utr报告载体，每孔2 ng的pRLCMV载体(内部对照，Promega)，和20ng /孔的miR-28-5p前体分子或对照前体(应用生物系统)，按照制造商的说明。24 h后，细胞被裂解，用双荧光素酶检测报告系统(Promega)评估荧光素酶的相对活性。实验结果重复了三次。

３．３．实时聚合酶链反应

根据制造商的指示，使用Trizol（Invitrogen）与细胞或组织中分离总RNA。用UV分光光度计（NanoDrop Nd-1000）测量RNA的纯度，并用琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。然后用M-MLV拉紧酶cDNA合成试剂盒（Promega）将提取的RNA逆转录至cDNA。使用SYBR Green PCR套件（Roche）和LightCycler 480系统（Roche）进行实时PCR分析。PCR条件包括在95℃下的1次循环5分钟，然后高达40个95℃的循环15秒（变性），60℃，30秒（退火），72℃，30秒（延伸）．通过在反应后熔化曲线证实引物的特异性。每个样品以三份的生物重复测量。HSA-RNU6B和β-Actin分别用作miRNA和mRNA表达的内源性对照。引物序列如补充表所示2．实验结果重复了三次。

3.4。Western Blotting Assay.

用细胞裂解缓冲液获得样品并如前所述设置[22］．用双金鸡宁酸定量之后（BCA）测定法（微凹，上海，中国），我们通过10％SDS-PAGE分离每一个蛋白质，然后将它们移动到PVDF膜（Millipore，USA）。然后，将样品用5％脱脂牛奶。与一抗和二抗温育后，用ImageQuant LAS 4000（GE医疗集团生命科学）来检测蛋白质水平。抗体列于补充表3.．

3.5。统计分析

所有的实验都至少进行了三次。数据以 ．所有统计分析均使用GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.， La Jolla, USA)。统计分析采用a -测试或Bonferroni多比较测试： ．一个值小于0.05被认为是统计学意义的。

4.结果

4．1.miR-28-5p在肝CSCs中的表达降低

要检查肝肿瘤干细胞的miR-28-5p的表达，对EpCAM的⁺和CD24⁺细胞通过流式细胞术分选从患者来源的原发性肝癌细胞和肝癌细胞系中分离。如图所示1(一)和1 (b)，的miR-28-5p表达在排序的EpCAM急剧下调⁺或CD24⁺主要HCC细胞。始终如一，我们发现分类的EPCAM中的miR-28-5p表达减少⁺或CD24⁺HCC细胞系（图1 (c)和1 (d)）.此外，在衍生自人次原发性HCC细胞和HCC细胞系的HCC球中，MiR-28-5P表达降低了（图1 (e)和1 (f)）.此外，与球体相比，miR-28-5p水平可以在再附着过程中部分恢复(图)1 (g)）.更重要的是，在HCC组织中，Pearson相关性分析显示miR-28-5p水平与CD24、EpCAM表达呈负相关(图)1（H）和1（I））.总之，我们的研究结果发现，miR-28-5p表达在肝肿瘤干细胞下调。

4.2。miR-28-5p与肝CSCs的维持有关

为了探索的miR-28-5p的肝肿瘤干细胞的生物学意义，肝癌细胞用的miR-28-5p海绵病毒转染。与miR-28-5p干涉效果，通过RT-PCR测定证实（图2(一个)）.HCC细胞中miR-28-5p的下调显著增加了肝癌细胞中CSC标记物和干细胞相关基因的表达(图)2 (b)- - - - - -2（e））.接下来，我们发现EpCAM在miR-28-5p敲低的肝癌细胞中比例上调(图)图2（f））.此外，与阴性对照细胞相比，miR-28-5p干扰肝癌细胞形成了更多的球体（图2（g））.在体外限制稀释试验发现，miR-28-5p敲低显著增加了肝癌细胞中CSCs的频率(图)2（h））.更重要的是,在活的有机体内有限稀释法起诉了miR-28-5p敲低显着上调在肝癌细胞中的肿瘤发生能力（图2（i））.在的miR-28-5p击倒移植瘤也增加肝癌干标记和干性相关基因的蛋白质（图2（j））.

4.3。的miR-28-5p抑制肝脏CSC扩张

为了进一步探索的miR-28-5p的肝肿瘤干细胞的生物学作用，肝癌细胞用的miR-28-5p模拟病毒转染。与miR-28-5p过表达的效果，通过RT-PCR测定证实（图3(一个)）.在HCC细胞中上调miR-28-5p显著降低肝癌细胞中CSC标记物和干细胞相关基因的表达(图)3（b）- - - - - -3（e））.接下来，我们发现EpCAM在miR-28-5p过表达肝癌细胞中的比例下调(图)3（f））.此外，与阴性对照细胞相比，MiR-28-5P过表达肝癌细胞的过表达形成了较少的球体（图3（g））.在体外极限稀释试验发现，miR-28-5p过表达显著降低肝癌细胞中CSC的频率(图)3（h））.更重要的是,在活的有机体内极限稀释实验表明，miR-28-5p过表达显著下调肝癌细胞的成瘤能力(图)3(我)）.MiR-28-5P敲根肿瘤的肝癌干序标记物和词干相关基因的蛋白质也降低了（图3 (j)）.综上所述，miR-28-5p可抑制肝脏CSC的自我更新和肿瘤发生。

4.4。IGF-1是肝CSCs中miR-28-5p的直接靶蛋白

据报道了miR-28-5p有针对性的3 -肝癌细胞中IL-34和IGF-1的utr [21，23］．因此，我们检查了IL-34和IGF-1是否也需要MIR-28-5P介导的肝CSC膨胀。如图所示4（a）和4（b），IGF-1 mRNA在MiR-28-5P过表达肝CSC中上调，并在MiR-28-5P干扰肝CSC中下调，而IL-34 mRNA水平不变。始终如一地，MiR-28-5P干扰肝CSC中的IGF-1蛋白水平也增加，并在MiR-28-5P过表达肝CSC中减少（图4（c）和4（d））.生物信息学分析表明，IGF-1 mRNA在其3中可能存在miR-28-5p结合位点 -UTR(图4（e））.为了证明miR-28-5p与IGF1 mRNA之间的直接相互作用，包含结合位点的荧光素酶报告系统(IGF1-3) -UTR-WT）或突变位点（IGF1-3 -UTR-mut)转染miR-28-5p干扰的肝CSCs。结果显示，与阴性对照相比，miR-28-5p敲低的肝CSCs中荧光素酶活性显著升高，而miR-28-5p海绵并不影响pGL3-IGF-1-mut载体中的荧光素酶活性(图)4 (f)）.在人HCC组织中，miR-28-5p与IGF-1 mRNA表达呈显著负相关(图)4 (g)）.

接下来，我们探讨IGF-1在肝脏CSCs中的生物学功能。用特殊的IGF-1 siRNA感染HCC细胞，通过RT-PCR检测其抑制效果(图)4 (h)）.如预期，EpCAM的比例⁺在IGF-1敲低的HCC细胞中，细胞表达下调(图)4(我)）.此外，IGF-1敲低的HCC细胞的自我更新能力也被削弱(图)图4（j）的）.这些结果表明，IGF-1可以促进肝CSC扩张。因此，我们用特殊的IGF-1 siRNA处理了MiR-28-5P海绵HCC细胞及其对照细胞，发现肝脏CSCs，自我更新能力和MiR-28-5P敲低之间的致瘤能力的比例差异。通过特殊IGF-1 siRNA对照肝癌细胞减少（图图4（k）的- - - - - -图4（M））.总之，这些结果表明，IGF-1是mir -28-5p介导的肝脏CSC扩增所必需的。

4.5。miR-28-5p决定索拉非尼在HCC细胞中的应答

越来越多的证据表明，肝脏CSCs参与了癌症对靶向药物和化疗药物的耐药性[24］．我们首先检查了Sorafenib抗性HCC异种移植物和细胞中的miR-28-5p表达。结果表明，在Sorafenib抗性HCC异种移植物和细胞中，miR-28-5p表达显着下调（图5（a）和5（b））.接下来，我们发现miR-28-5p过表达导致肝癌细胞对索拉非尼诱导细胞凋亡的敏感性（图5 (c)）.一贯地，miR-28-5p敲低导致肝癌细胞对索拉非尼诱导的细胞凋亡产生抗性(图)5 (c)）.此外，我们还发现，当miR-28-5p模拟肝癌细胞暴露于相同剂量的索拉非尼时，与对照肝癌细胞相比，miR-28-5p模拟肝癌细胞中的PARP蛋白水平显著升高(图)5 (e)）.此外，我们发现来自低miR-28-5p水平的HCC肿瘤的PDXs对索拉非尼治疗具有耐药性。相比之下，来自高miR-28-5p水平的HCC肿瘤的PDXs对索拉非尼治疗敏感(图)5 (f)和图5（G））.综上所述，我们的结果表明，miR-28-5p可能是索拉非尼治疗的可靠预测因素。

5.讨论

肝细胞癌是癌症死亡的第二大原因。中国每年约有31.9万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的51% [25］．HCC治疗包括切除，放疗，化疗和Biotherapy。尽管近期HCC预防和干预进展，但由于复发率和化学率高，HCC的预后也不令人满意[26］．众多的研究表明，HCC预后不良与肝脏CSC的存在密切相关[27］．因此，迫切需要找到肝脏CSC调控的分子机制，以开发新的靶向CSCs治疗策略。在本研究中，我们首次阐明miR-28-5p在肝脏CSC中降低，并抑制肝脏CSC的自我更新和肿瘤发生。我们还证明，miR-28-5p的价值在HCC细胞对索拉非尼的敏感性中发挥重要作用。

据报道，MIR-28参加了几种类型的癌症，包括胃癌，卵巢癌和前列腺癌[28- - - - - -30.］．在该研究中，发现MiR-28-5P表达在分选的CD24-和EPCAM阳性原发性HCC细胞以及主HCC球中进行下调。此外，HCC细胞中的敲低miR-28-5p上调肝CSC标记，并促进了肝脏CSC的自我更新能力和致瘤性。相反，HCC细胞中的过表达MIR-28-5P下调肝脏CSC标记，并抑制肝脏CSC的自我更新能力和致瘤性。以前的研究发现，MIR-28-5P通过IL-34和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）途径抑制HCC细胞转移[21，23］．因此，我们试图确定的miR-28-5p的下游靶基因，并确定这些基因是否占的miR-28-5p介导的肝CSC扩张。我们发现IGF-1作为肝脏肿瘤干细胞的miR-28-5p的直接目标。

胰岛素样生长因子1 (IGF-1)是程序性细胞增殖、分化和凋亡的关键调控因子[31］．有报道称异常激活IGF-1促进肿瘤细胞生长和转移[32]，但在HCC IGF-1激活下方的确切机制仍然模糊。该PI3K / AKT和ERK / P38信号通路是由IGF-1信号在多种肿瘤发生的增强[33，34］．此外，还报告了IGF-1涉及CSC的调节[35］．在本研究中，我们发现miR-28-5p通过与IGF-1的3结合下调IGF-1的表达 -UTR肝肿瘤干细胞。此外，敲除IGF-1表达对HCC细胞的自我更新能力和下调肝脏CSC标记物。此外，特殊的IGF-1的siRNA可以废除的自我更新能力的差异和miR-28-5p击倒肝肿瘤干细胞和对照细胞之间的致瘤性的能力。的miR-28-5p和IGF-1之间的相关性在人HCC组织中进一步验证。

索拉非尼是fda批准的首个用于晚期HCC患者的靶向药物[36］．但是，只有少数HCC患者受益于索拉非尼治疗[37］．因此，迫切需要在HCC中寻找索拉非尼治疗的生物标志物。在这项研究中，我们发现miR-28-5p过表达HCC细胞对索拉染料诱导的细胞凋亡更敏感，MIR-28-5P干扰HCC细胞对索拉非尼诱导的细胞凋亡更耐药。此外，Sorafenib PDX研究进一步证明HCC患者的高miR-28-5p水平可以作为索拉非尼反应的可靠预测因子。

携带，我们证明MIR-28-5P在肝脏CSC中降低，这反过来抑制肝脏CSC的自我更新和致瘤性。此外，MiR-28-5P通过直接调节IGF-1抑制肝CSC膨胀。总之，我们的研究结果提供了对MiR-28-5P / IGF-1轴的洞察力，作为针对肝脏CSC的潜在治疗目标以及HCC患者的索拉非尼治疗的潜在预测因子。

数据可用性

从该研究生成的数据可以在合理的请求上从相应的作者获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

QX, TH, PHY, HYL进行了所有的实验并分析了数据。QX和TH撰写了手稿，JZ和RYW参与了修改。JZ和XFZ构思了这个项目，并监督了所有的实验。所有作者阅读并批准了最终的手稿。夏青、韩涛、杨平华、王若玉等人对该作品贡献良多。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81572791, no . 81902942, no . 81972777);辽宁省自然科学基金重点项目(no . 2018010153-301);上海市国家自然科学基金项目(no . 19ZR1400300, no . 18ZR1438600)。

补充材料

补充表1:50例HCC患者的临床病理特征。补充表2:引物清单。补充表3:抗体列表。（补充材料）

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