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董Joo Hyun Jee,可能早就Lee Jisu Ko, Soojung哈恩,唱Yun,汉族Kyung Kim伊诺克公园,崔Seon年轻Sukin宋,Joong Woon李,韩俊曹,Min-Soo Kwon Jongman柳, ”发展Collagen-Based 3 d矩阵胃肠Tract-Derived瀑样的文化”,干细胞国际, 卷。2019年, 文章的ID8472712, 15 页面, 2019年。 https://doi.org/10.1155/2019/8472712
发展Collagen-Based 3 d矩阵胃肠Tract-Derived瀑样的文化
Joo Hyun Jee,1,2 李董可能,2,3 Jisu Ko,1,2 Soojung哈恩,1,2 唱Yun宋,1,2 汉Kyung金,1,2 伊诺克公园,1,2 崔Seon年轻,1,2 Sukin宋,1,2 Joong Woon李,1,2 韩俊曹,2,3 Min-Soo Kwon2,4et al。 Jongman柳
1,2
1大学医学院微生物系CHA, Seongnam-si,京畿道13488年,韩国
2CHA CHA瀑样研究中心医学院大学Seongnam-si,京畿道13488年,韩国
3CHA大学医学院生理学系,Seongnam-si,京畿道13488年,韩国
4大学医学院药理学系CHA, Seongnam-si,京畿道13488年,韩国
文摘
瀑样是一个细胞组织生长在一个三维(3 d)文化系统代表它的起源的所有特征。然而,这种organ-like结构需要支持矩阵来维持它的特点和功能。基底膜基质,来源于小鼠肉瘤,经常被用作瀑样支持矩阵,但结果可能不需要进行临床应用,因为身份不明的组件的鼠标肉瘤。另一方面,天然胶原蛋白的特点强调有毒的友好的利基瀑样和正常组织。因此,本研究试图开发一个新的,collagen-based矩阵可能替代人工基底膜瀑样的文化。Collagen-based矩阵,使用1型胶原,火腿的F12营养混合物,碳酸氢盐。然后,小鼠结肠瀑样进行了分析通过形态学特征和定量信使核糖核酸(mRNA)表达式,显示鼠标结肠瀑样生长在基底膜基质的collagen-based矩阵和完全相似的形态,特定的标记,增殖率。老鼠小intestine-derived瀑样,stomach-derived瀑样,和人类colon-derived瀑样也讲究的,所有的都成功地生长在collagen-based矩阵和培养在人工基底膜相比有相似的属性。此外,瀑样观察移植的可能性。当鼠标结肠瀑样与胶原基质移植到EDTA-colitis小鼠模型,结肠瀑样在受损组织成功的道。 For that reason, the use of collagen-based matrix in organoid culture will render organoid cultivation less expensive and clinically applicable.
1。介绍
瀑样是一个细胞结构,由自组织干细胞在体外。它包括细胞群,三维(3 d)架构,和原始的瀑特异功能器官。3 d的进步文化方法使用上皮干细胞隔离在胃肠道上皮瀑样的生成可能的(1,2]。这些瀑样复制在活的有机体内生理学、包含所有和他们的组织细胞来源于上皮干细胞增殖特性。这些模型可以提供一个在体外病理生理学研究的平台,筛选药物功效,和测试药物毒性(3]。瀑样也可以作为治疗药物对受损上皮组织,因为这些恢复肠上皮组织在炎性肠道疾病的动物模型4- - - - - -6]。
信号引起的细胞外基质(ECM)的蛋白质层粘连蛋白和胶原蛋白等是至关重要的干细胞增殖,分化,并执行适当的功能。因此,ECM必须支持上皮干细胞传播和维护它的形式作为瀑样。目前,细胞外基质用于生产最瀑样是人工基底膜,与原始的方法来推导肠上皮瀑样使用人工基底膜作为一个3 d支架(7]。基底膜基质是一种凝胶状的蛋白混合物从老鼠EHS肉瘤细胞分泌,包含层粘连蛋白,entactin、胶原蛋白、蛋白多糖和各种生长因子可能引起细胞外基质信号适合瀑样的形成。然而,有不同的证据表明,当注入Matrigel-containing材料可以促进血管生成在活的有机体内(8- - - - - -11]。基底膜基质的成分是定义糟糕的,这样很难预测其对人体的影响,和批次变化非常严重,很难计划可再生的研究(12]。因为这些风险,使用人工基底膜材料不能通过美国食品和药物管理局(FDA),它是很难获得批准其在临床试验中使用。
胶原蛋白是细胞外基质的通用组件组成蛋白质在生物体和支持细胞分裂等不同角色,在体内的迁移和分化。胶原蛋白已被用于各种各样的文化,包括2 d, 3 d,多种细胞,瀑样,以及在医学应用中,包括延长治疗细胞培养,人造皮肤,化妆品,和重建13]。代替人工基底膜collagen-based矩阵瀑样文化,可以培养瀑样水平适合临床应用。出于这个原因,本研究主要探讨是否有可能扩大瀑样从大肠,小肠和胃collagen-based矩阵而不是在基底膜基质。
2。材料和方法
2.1。材料
I型胶原凝胶(cellMatrix类型1 a)从Nitta购买明胶,Inc .(日本大阪)。火腿F-12营养组合,先进的DMEM / F12, n, B-27,庆大霉素/两性霉素B,玫瑰,GlutaMAX-I获得Gibco(美国沃尔瑟姆,MA)。基底膜基质从收购BD生物科学(美国新泽西富兰克林湖)。mEGF和mNoggin从PeproTech购买(美国新泽西州落基山)。CHIR99021, Leu15胃泌激素1 SB202190烟酰胺、n -乙酰半胱氨酸常和thiazovivin取自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。从Tocris A83-01收购生物科学(英国布里斯托尔)。y - 27632和温柔细胞分离试剂购自干细胞技术(加拿大温哥华)。青霉素和链霉素从Welgene Inc .收购(Gyeongsan-si、韩国)。从ATGen FGF10购买(凭借韩国)。
2.2。动物
小鼠C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) (14]和雄性C57BL / 6小鼠从日本获得SLC(日本静冈县)和东方生物(凭借韩国),分别和动物在CHA处理大学动物设施。这个实验被批准并进行了CHA大学根据法规和准则制度动物保健和使用委员会。
2.3。Collagen-Based矩阵的准备瀑样的文化
混合collagen-based矩阵是由I型胶原凝胶(3毫克/毫升)从猪腱(I)与火腿F-12营养混合(II)和1 N NaHCO3 8:1:1比(III),分别。混合后的顺序(我),(2),(3)程序立即使用前。
2.4。隔离和小鼠结肠瀑样的文化
小鼠结肠瀑样之前已经开发(15]。小鼠结肠隐窝是获得5 - 7-week-old C57BL / 6小鼠。结肠与螯合清洗缓冲(2 mM EDTA DPBS) 30分钟,和隐窝被有力的反相了几分钟孤立分离缓冲DPBS(1%山梨醇和1%蔗糖)。孤立的隐窝是透过70μm细胞与人工基底膜过滤器和嵌入式或collagen-based矩阵1:1比例,然后在多井盘子镀。聚合后的矩阵,小鼠结肠瀑样生长培养基添加和孵化37°C和5%的二氧化碳湿润孵化器。培养基是每2天更换一次。
基底生长媒体补充10% R-Spondin 1条件培养基从HA-R-Spondin 1-Fc 293 t细胞(美国Trevigen,马里兰州),50 ng / ml mEGF, 100 ng / ml mNoggin, 50% Wnt-3A从L-Wnt-3A细胞条件培养液(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),500海里A83-01 10μ2.5 M y - 27632,μM CHIR99021。CHIR99021减去2天后亚文化(表1)。
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2.5。隔离和小鼠小肠瀑样的文化
除了隐窝的隔离、制备小鼠小肠的小肠隐窝进行如上所述。小肠隐窝与温和的孤立的细胞分离试剂组织纵向切成5毫米块后从近端到远端,减少横向打开。孤立的隐窝细胞过滤器过滤之前被与基底膜基质或collagen-based混合矩阵的比例1:1和播种在多井盘子。聚合后的矩阵,小鼠小肠瀑样生长介质是补充道。
小鼠小肠瀑样生长培养基的组成如下:基底增长媒体补充10% R-Spondin 1条件培养基,mEGF, mNoggin, A83-01, y - 27632, CHIR99021(表1)。
2.6。隔离和小鼠胃瀑样的文化
小鼠胃组织获得了从幽门窦到眼底。组织被打开了,在冰冷的DPBS洗几次。隔离胃腺体,组织投入5毫升的冰冷的螯合缓冲DPBS EDTA(5毫米)和孵化2小时在室温下轨道振动器。孵化后,5毫升的离解缓冲了,用手轻轻地倒1 - 2分钟。接下来,胃腺体细胞过滤器过滤和镀与基底膜基质或collagen-based矩阵的比例1:1和播种在多井盘子。聚合后的矩阵,小鼠胃瀑样生长培养基添加。
老鼠胃部瀑样生长培养基的组成如下:基底增长媒体补充10% R-Spondin 1条件培养基,mEGF, mNoggin, 50% Wnt-3A条件培养基,500海里A83-01 10μM y - 27632, 10 nM Leu15胃泌激素1,200 ng / ml FGF10,和2.5μM CHIR99021(表1)。
2.7。人类结肠瀑样的隔离和文化
协议进行符合赫尔辛基宣言,CHA盆唐医院的机构审查委员会批准。实验使用 厘米2手术标本CHA盆唐医院提供的。标本,黏膜下层层,和肌肉部分仔细清除和清洗。粘膜然后切成小块,洗了DPBS含庆大霉素/两性霉素b .删除绒毛和碎片,一个额外的3 - 4洗涤步骤添加螯合缓冲。粘膜覆盖着一个螯合缓冲和孵化在室温下30分钟,轻轻倒瓶。获得肠隐窝,粘膜部分与弯钳轻轻刮掉。肠道隐窝被过滤到150年μ米网开口(动态Aqua-Supply、萨里、加拿大)2次。过滤后,隐窝的上层清液被丢弃。其次是在250 g离心5分钟在4°C。接下来,结肠隐窝细胞过滤器过滤和镀与基底膜基质或collagen-based矩阵的比例1:1和播种在多井盘子。聚合后的矩阵,增加了人类结肠瀑样生长介质。
人类结肠瀑样生长培养基的组成如下:基底生长媒体有50% Wnt-3A条件培养基,10% R-Spondin 1条件培养基,mNoggin 100 ng / ml, mEGF 50 ng / ml, 1%的牛血清白蛋白,500海里A83-01 10μM SB202190 10 nM Leu15胃泌激素1,10毫米烟酰胺,2.5μM thiazovivin, 10μ2.5 M y - 27632,μM CHIR99021(表1)。
2.8。EGFP Mouse-Derived结肠瀑样移植到受体小鼠结肠
EGFP结肠隐窝是隔绝C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP)鼠标,和EGFP结肠瀑样出了5天在基底膜基质和胶原蛋白矩阵。结肠瀑样被孤立使用胶原酶从胶原蛋白从histolyticum梭状芽胞杆菌(σ),用冰冷的DPBS基底膜基质。EGFP结肠瀑样暂停在基底膜基质/ 70稀释媒体解决方案μ10 l结肠瀑样文化媒体解决方案μy - 27632的比例1:10。准备EGFP结肠瀑样移植到EDTA结肠炎结肠内腔的受损C57BL / 6小鼠使用200μl吸管。
2.9。定量反向Transcriptase-Polymerase连锁反应分析
瀑样(4)通过与细胞治疗恢复解决方案(美国纽约康宁合并,康宁)去除人工基底膜,和总RNA提取使用MagListo™5 M细胞总RNA提取工具包(Bioneer、大田、韩国)根据制造商的指导方针。随后,RNA产品受到定量逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)。首先,RNA合成互补DNA(互补)使用AccuPower®RocketScript™周期RT预混料(Bioneer)。定量聚合酶链反应是由混合的cDNA AccuPower®2 x Greenstar qPCR大师混合(Bioneer)。信使rna表达水平与热循环仪测量骰子®实时系统III(豆类、志贺、日本)。引物序列表2。消极的控制(没有互补脱氧核糖核酸模板)是与每一个试验,同时跑和PCR cDNA样本一式三份。持续表达GAPDH是作为内生控制纠正任何潜在的RNA加载或反应效率的变化。结果表现为相对褶皱变化使用GAPDH引用和应用公式2-ΔΔCt。PCR产品加载到1%琼脂糖凝胶和可视化DNA凝胶染色紫外线照射下的解决方案。
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2.10。WST-1活动分析
从上述器官分离隐窝被播种到96年多井盘子和培养。经过4天的孵化,细胞生存能力与EZ-Cytox化验分析设备(Daeil实验室服务,首尔,韩国)通过添加水溶性四唑盐每个紧随其后3小时的潜伏期。3小时孵化后,只有中被转移到新井在另一个96孔板,和吸光度测量的波长450 nm VersaMax ELISA酶标读者(分子器件、钙、美国)。
2.11。免疫荧光
瀑样免疫细胞化学发展之前(15]。样本彻底覆盖主要抗体在一夜之间在4°C。抗体用于染色如下:粘蛋白2(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA), Ki67抗体(Abcam、剑桥、马),chromogranin (Santa Cruz),溶菌酶(诊断生物系统,Fremont, CA),粘蛋白5 ac(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA),和villin(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)第二天,样本嵌入二次抗体室温2 h, Alexa萤石594共轭anti-rabbit免疫球蛋白和Alexa萤石594共轭anti-mouse免疫球蛋白(生活技术,马里兰州)。
2.12。数据分析
使用学生的两组之间的差异进行评估 - - - - - -测试。此外,3或更多组与单向方差分析其次是Student-Newman-Keuls事后测试。被认为具有统计显著性差异 。
3所示。结果与讨论
3.1。在体外胶原蛋白小鼠结肠瀑样文化矩阵
鼠标结肠隐窝扩大,形成organ-like结构体外,在胶原基质和生长在基底膜基质。确定影响火腿的F12,火腿的F12补充不同的比率在胶原基质培养。隐窝不能成长为一个没有火腿的F12 organoid-like形状,而在含10%的F12完成结肠瀑样形状出现,发生与原来的胶原蛋白的比例矩阵(数字1(一)和1 (c))。胶原蛋白凝胶本身的比例变化当鼠标结肠隐窝是有文化的。隐窝是播种不同百分比的胶原蛋白凝胶(30%,70%,80%)和在培养5天第一通道0。结果表明,至少70%的胶原蛋白凝胶培养时需要隐窝在一个三维结构(数据1 (b)和1 (d))。与前面的两个结果,collagen-based 3 d的培养与不同比例的碳酸氢盐在培养瀑样(数据没有显示显著差异1 (e)和1 (f))。为了确定pH缓冲的效果在胶原基质,细胞谱系的结肠瀑样在文化系统中根据基底膜基质和胶原蛋白与不同比例的碳酸氢盐分析使用定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)。瀑样培养基底膜基质和胶原蛋白有10%的碳酸氢钠具备干细胞显示类似的表达式(Lgr5就)和分化特点(钙粘蛋白,villin-1, chromogranin和defensin-5)结肠瀑样(图1 (g))。然而,瀑样collagen-based系统没有重碳酸盐或5%碳酸氢钠截然不同的表达模式具备干细胞和分化标记比Matrigel-based系统。这表明,胶原蛋白的碳酸氢盐比率矩阵组件在培养结肠瀑样非常重要。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
鼠标结肠瀑样生长在胶原基质胶原凝胶组成的80%,10%火腿的F12补充,10%碳酸氢钠,生长在基底膜基质矩阵保持隐窝的增长。鼠标隐窝培养这两个矩阵显示正常形态瀑样的人物2(一个)和2 (b)),也有相似的增长模式在通道5及以上(数字2 (c)和2 (d))。定量rt - pcr证实目标基因的表达在两种文化(图的方法2 (e))。结肠瀑样胶原蛋白——和Matrigel-based具备干细胞培养系统显示类似的表达式(Lgr5就)和分化特点(钙粘蛋白、villin-1 defensin-5,粘蛋白2和溶菌酶)的结肠瀑样(图2 (e))。代表的rt - pcr结果显示相同的模式的定量rt - pcr。此外,识别鼠标结肠瀑样细胞,用免疫细胞化学染色法分析结肠上皮细胞特异性标记。细胞标记Ki67 Muc2和chromogranin结肠瀑样中检测到在结肠上皮细胞生长在基底膜基质和胶原蛋白矩阵(图2 (f)),这表明结肠瀑样培养在胶原基质可能增殖和服务它的功能以及人工基底膜。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。在体外小鼠小肠瀑样胶原基质的培养
发现小肠organoid-may也是生长在胶原蛋白和Matrigel-based条件。从小肠隐窝和培养小鼠小肠瀑样基底膜基质——和collagen-based矩阵。的小肠隐窝collagen-based文化系统出现在他们完成形状如瀑样,一样的Matrigel-based文化系统。小鼠小肠瀑样显示发了芽的形状不是人工基底膜胶原蛋白。形态学改变胶原蛋白和基底膜基质在通道4及以上在显微镜下观察与小肠瀑样(图3(一个)),这表明瀑样胶原基质保持它们的属性。确定这两个矩阵影响了他们的特点,定量rt - pcr进行显示具备干细胞的表达(Lgr5就)和分化标记(钙粘蛋白、villin-1 chromogranin,粘蛋白2和溶菌酶)(图3 (b))。小肠标记的表达水平明显不同矩阵,这可能是由于不同的小肠细胞复合培养系统。villin-1 Lgr5就,钙粘蛋白,溶菌酶表达更多的小肠瀑样培养collagen-based矩阵比人工基底膜。此外,识别鼠标小肠瀑样细胞,细胞用免疫细胞化学染色法分析了小肠上皮细胞特异性标记。如Muc2表达的细胞标记,溶菌酶,Ki67小肠瀑样培养在胶原蛋白和Matrigel-based矩阵证明collagen-based矩阵的兼容性和它生长功能瀑样(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。在体外小鼠胃瀑样胶原基质的培养
胃(胃)腺体从分离、培养小鼠胃瀑样基底膜基质和collagen-based矩阵。最初,胃隐窝稀少collagen-based矩阵;他们发现可靠的第三天的文化。胃隐窝collagen-based文化系统出现在他们的完整形状如瀑样,是那些在Matrigel-based文化系统(图4(一))。他们的形态是由显微镜观察日常;胃瀑样生长在通道4或以上没有失去他们的特点。定量rt - pcr显示gastric-specific基因的表达(Gif、热解色谱、Stt Ghrl, Muc6,和Muc5AC),显示不同的模式在这两个矩阵(图4 (b))。特别是在胃瀑样生长在胶原蛋白Muc5AC表达更多的矩阵。此外,识别鼠标胃瀑样细胞,用免疫细胞化学染色法分析了胃上皮细胞特异性标记。细胞标记如Ki67和粘蛋白5 ac在胃上皮细胞(图中被发现4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。在体外人类结肠瀑样胶原基质的培养
人类结肠瀑样被培养在这两个矩阵,为鼠标结肠瀑样。实验进行了在相同条件下的人类瀑样实验,结果发现两个矩阵提供一个适当的文化系统日益增长的人类结肠癌瀑样。胶原蛋白和基底膜基质条件下,人类结肠瀑样保持他们的特点,通过7(图5(一个)),定量rt - pcr结果显示具备干细胞(Lgr5就)胶原蛋白和基底膜基质但谱系标记(图中不同的表达模式5 (b))。Lgr5就、villin-1和溶菌酶表达更在结肠瀑样培养collagen-based矩阵比人工基底膜。此外,识别人类结肠癌细胞类型,利用免疫细胞化学染色分析细胞与人类结肠上皮细胞特异性标记。细胞标记,如Ki67 villin, Muc2和溶菌酶在结肠上皮细胞(图中被发现5 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.5。在活的有机体内EGFP +移植小鼠结肠瀑样胶原基质的培养
鼠标结肠瀑样移植模型来源于小鼠结肠瀑样collagen-based文化系统。结肠隐窝从CAG-EGFP小鼠结肠癌和孤立在胶原基质培养5天。EGFP结肠瀑样被移植到EDTA的结肠损伤小鼠模型(如前所述)(16]。观察移植后一个星期,一个EGFP-expressive地穴的结肠上皮组织(数字6(一)和6 (b))。EGFP +隐窝包含各种分化细胞类型(图6 (b))。没有病变显示直肠出血、脱垂或腹泻观察(图6 (c))。这些结果表明,collagen-based文化结肠瀑样有可能的临床应用结肠治疗。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
成熟并维持健康的瀑样要求矩阵产生组织如环境,和几个候选人进行了调查。首先,基底膜基质是众所周知的瀑样提供ecm和生长因子和成功地支持增长,但它的未知元素阻碍了临床试验。出于这个原因,研究开发寻找合适的替代人工基底膜没有组织体内的毒性。以前,替代研究水凝胶矩阵进行(17,18]。在这些研究中,成功地培育功能瀑样水凝胶矩阵。然而,水凝胶组件移植时体内似乎也有毒。与水凝胶、胶原蛋白确实是最丰富的纤维状蛋白质在ECM和构成高达30%的总蛋白质量,提供力量和调节细胞迁移、趋化性和开发(19]。胶原蛋白矩阵的特征包括结构简单、低免疫原性、低cell-matrix互动,和类似的机械性能的体内。因此,老鼠和人类胃肠道瀑样培养在collagen-based矩阵可能更紧密地模仿原始组织形态、基因表达及分子特性比培养在人工基底膜20.- - - - - -23]。
瀑特异性微型来源于干细胞和祖细胞模拟体内器官系统和克服空间和文化条件的局限性24]。器官的形成可以通过3 d文化通常被诱导干细胞或祖细胞。在这个过程中,细胞外基质分泌的Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤行和层粘连蛋白用于3 d丰富的文化。通过优化各种利基组件如Wnt,‘诺金’(BMP抑制剂),R-Spondin (Lgr5就受体配体)和表皮生长因子(EGF)以及生长因子,细胞功能成功地分化成组织。小鼠结肠瀑样培养collagen-based矩阵中有相似的形态发生在基底膜基质培养的。在我们collagen-based文化,不同瀑样形态学观察小鼠小肠瀑样比传统Matrigel-based瀑样。然而,瀑样形态没有重大影响的增长或函数。特定的信使核糖核酸(mRNA)标记的特点在小鼠结肠瀑样表达类似的模式。此外,瀑样培养在collagen-based矩阵较小的周长,较小的萌芽,在基底膜基质和更高的稳定性比培养,以前将具备干细胞维持优于后者。这个发现,更好的健身移植胶原matrix-cultured结肠瀑样到体内肠道环境中受到了质疑,比人工基底膜(16]。成功移植结果实现的优越性collagen-based瀑样文化在这种背景下,但更详细的功能分析像Forskolin-induced肿胀试验和结肠瀑样宿主交互测试应该提供质量参考证明安全性和可靠性的collagen-based瀑样的文化。
在这项研究中,我们表明,collagen-based定义矩阵瀑样不仅可以取代动物未定义矩阵瀑样文化但也可能有助于提高瀑样的功效为开发治疗修复上皮创伤。
5。结论
本研究试图开发一个新的,collagen-based矩阵,可以作为替代人工基底膜瀑样培养法。这项研究表明小鼠结肠瀑样的新的文化方法,小intestine-derived瀑样,stomach-derived瀑样,和人类colon-derived瀑样,所有的都成功地生长在collagen-based矩阵和有相似的属性在基底膜基质培养的。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
不存在利益冲突。
作者的贡献
JooHyun Jee和李董可能造成了同样的工作。
确认
这项工作是由韩国卫生技术研发项目的资助通过韩国健康产业发展研究所,由卫生部&福利,大韩民国(HI16C1559, HI16C1634 HI17C2094, HI18C2458)和基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会资助的科学,ICT和未来规划,大韩民国(nrf - 2018 r1d1a102050030)。
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