陷波抑制促进肝祖细胞分化成肝细胞通过sox9b镇压在斑马鱼

文摘

大多数形式的损伤后肝再生介导肝细胞的增殖。然而,当肝细胞增殖受损,如慢性肝病、肝祖细胞(lpc)因胆道上皮细胞(BEC)舱可以引起肝细胞调节肝脏修复。促进慢性肝病患者LPC-to-hepatocyte分化可能作为一种新的治疗选择,但首先需要识别的分子机制推动这一进程。Notch信号已被确定为一个重要的信号通路促进BEC的命运在开发过程中,还涉及在再生调节LPC的分化。SRY-related HMG盒转录因子9 (Sox9)是一个Notch信号在肝脏的直接目标,和Sox9也已被证明能够促进在开发过程中BEC的命运。我们最近的斑马鱼模型所示LPC-driven肝再生抑制Hdac1活动通过提高ms - 275治疗sox9blpc的言论,损害LPC-to-hepatocyte分化。因此,我们假设抑制Notch信号将推动LPC-to-hepatocyte分化抑制sox9b在斑马鱼表达式。我们切除的肝细胞Tg (fabp10a CFP-NTR):幼虫和堵塞缺口激活通过治疗在肝再生γ分泌酶抑制剂LY411575并演示了增强诱导Hnf4a lpc的。另外,加强Notch信号通过Notch3胞内域(N3ICD)过度受损Hnf4a归纳。肝细胞中消融sox9b杂合的突变体胚胎增强Hnf4a感应,而BEC-specific Sox9b过度受损LPC-to-hepatocyte分化。我们的结果建立Notch-Sox9b信号作为抑制轴LPC-to-hepatocyte分化的在活的有机体内LPC-driven肝脏再生模型。

1。介绍

肝脏是唯一的人类内脏器官再生的能力,大多数形式的急性损伤后,这个再生增殖分化的上皮细胞介导的肝脏,即肝细胞和胆管上皮细胞(bec)。然而,在长期的慢性肝损伤,这种天生的再生能力可能耗尽,导致发展为终末期肝病、肝硬化、肝衰竭(1]。在病人身上的慢性肝病的共同特征是ductular反应或“活性”BEC扩散,与BEC扩张的程度与肝损伤的严重程度相关2,3]。ductular内反应,被认为是肝祖细胞(lpc) bipotent细胞能够分化成肝细胞或bec。尽管lpc的仍然是一个有争议的话题,有证据表明BEC-to-hepatocyte分化在动物模型中几乎完全消融的肝细胞(4- - - - - -6在严重肝损伤[],损害肝细胞增殖7- - - - - -10),而长期慢性肝损伤(11和人类肝硬化患者12[]或巨大肝坏死13]。与缺乏治疗终末期肝病肝移植之外,促进LPC-to-hepatocyte分化的概念作为一个新的来源的肝实质是一种有吸引力的选择。然而,支撑LPC-to-hepatocyte分化的分子机制在很大程度上仍未知,从而排除这种疗法的发展。

Notch信号通路是一个重要的途径在肝癌的发展过程中,其激活在胎儿hepatoblasts促进胆汁分化和胆管形态发生14- - - - - -16]。有四个级距受体(Notch1-4)和两个家庭的配体(Jagged-1 2和Delta-like-ligand 1, 3, 4)在哺乳动物。Notch信号是一种juxtacrine信号的切口位于一个细胞的细胞膜受体结合的配体表达的膜相邻细胞,激活受体和导致切口胞内的蛋白水解劈理域研究所γ分泌酶。镍镉把原子核,它与dna结合蛋白质重组signal-binding交互免疫球蛋白kappa J (Rbpj)调节目标基因转录17]。除了肝脏发展的重要作用,在肝脏再生Notch信号被牵连,几组有牵连的角色激活促进LPC的分化bec的Notch信号而抑制肝细胞分化在体外(16,18,19]。同样,抑制Notch信号阻塞BEC分化,促进了LPC-to-hepatocyte分化在体外(18- - - - - -20.),而在活的有机体内抑制Notch信号受损BEC扩散后胆管结扎(21)和抑制LPC的分化在老鼠2-acetylaminofluorine结合部分肝切除术模型(22]。在斑马鱼肝细胞消融模型显示,去分化的bec成lpc的要求Notch-dependent Sox9b激活(5),而高水平的等级信号lpc的阻止LPC-to-hepatocyte分化(6]。另一方面,删除Rbpj从bec和随后的接触,5-diethoxycarbonyl-1, 4-dihydrocollidine (DDC)的饮食,导致胆管炎、ductular反应受损和减少成熟胆道标记的表达但并不足以诱导BEC-to-hepatocyte转换(23]。在一起,这些数据涉及的角色等级信号调节的bec和lpc的肝脏再生,尽管下游效应器显然至关重要这一过程仍有待阐明。

在肝癌的发展过程中,SRY-related HMG盒转录因子9 (Sox9)被认为是最早的标志对胆汁的命运。肝脏特异性删除Sox9在老鼠身上导致延迟胆道发展(24),而斑马鱼纯合子sox9b突变体表现出不当的祖细胞分化成肝或胰腺命运也显示来自受损的肝内胆汁郁积管形成在肝脏早期发展(25]。Sox9表示通过bec基线在成年小鼠和活性bec在肝损伤,但有异位表达Sox9在形式的淤胆型肝损伤肝细胞,如胆道闭锁(26)和鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(27在人类和包括DDC的饮食28,29日和很少choline-deficient和ethionine-supplemented饮食后30.在啮齿动物)。Sox9 +肝细胞分离时受伤的老鼠的肝脏,他们成立了瀑样能够区分成两个bec和肝细胞28,30.),虽然克隆血统追踪建议Sox9 + lpc的很少产生肝细胞在活的有机体内(30.]。符合这一观察,表达Sox9中表达下调了lpc的区分对肝细胞谱系(27],CD24 +双电位的Sox9 +肝细胞肝细胞的差别显示对这些标记(31日]。这些数据表明,Sox9是肝细胞的重要调节器/胆表型转换在肝脏发育和再生。

Sox9也被证明是一个Notch信号在肝脏的直接目标。当镍镉在小鼠肝脏中发展,大幅upregulationSox9肝脏中表达的刚出生的幼崽(15]。此外,Notch1显示直接绑定到Rbpj-binding网站中标识Sox9启动子(15]。在sox9b突变斑马鱼胚胎,这是表明Sox9b所需的维护,但不启动,Notch信号在肝内胆道细胞在肝脏开发(25]。尽管已知的Sox9的重要性在调节细胞命运hepatoblasts在开发期间,对Sox9的角色在再生LPC的细胞命运的监管。我们以前建立了在活的有机体内斑马鱼模型的极端肝细胞消融,肝脏再生是由LPC-to-hepatocyte分化4]。该模型系统是适合药物筛选识别LPC的增殖和分化的介质;我们曾表明bromodomain extraterminal(打赌)蛋白抑制了BEC去分化成lpc的(32)和选择性骨形成蛋白(BMP)抑制剂DMH1受损LPC-to-hepatocyte分化(33],我们最近表明,抑制组蛋白脱乙酰酶1 (Hdac1)活动受损LPC-to-hepatocyte分化的增强sox9b表达式[34]。鉴于Sox9 Notch信号在肝脏的直接目标,和过多的在体外数据显示的角色等级在LPC的微分信号,我们假设抑制Notch信号将推动LPC-to-hepatocyte分化的镇压Sox9表达式。这里,我们利用LY411575,小分子抑制剂γ分泌酶激活块级别,在我们的斑马鱼肝细胞消融模型表明,抑制Notch信号促进Hnf4a lpc的感应,而过度的镍镉损害Hnf4a归纳。我们进一步表明,删除一个等位基因sox9b在lpc的斑马鱼中增加Hnf4a感应,而BEC-specific Sox9b损害LPC-to-hepatocyte的过度分化。最后,我们表明,抑制Notch信号足以拯救受损LPC-to-hepatocyte分化和抑制幼虫Hdac1活动,但不救援缺陷打赌抑制剂或DMH1-treated幼虫。我们的工作显然建立Notch-Sox9信号轴时的重要性在活的有机体内LPC的分化。

2。结果

2.1。在bec LY411575治疗促进Hnf4a感应BEC-Mediated再生

为了评估等级信号LPC-driven肝脏再生的作用,我们利用以前公布的肝细胞消融模型(4]。我们使用了Tg (fabp10a CFP-NTR):行,这表达了硝基还原酶hepatocyte-specific下的最惠国待遇fabp10a启动子(ref)。当暴露于这些幼虫无毒甲硝哒唑(MTZ) 36小时(A36h)从3.5到5天postfertilization (dpf),正常肝细胞中表达关系MTZ转换成细胞毒性化合物,导致几乎完全肝细胞消融。我们也使用了Tg (Tp1 H2B-mCherry):马克bec, mCherry表达式是由Tp1子包含Notch-responsive元素(35]。H2B-mCherry蛋白质的稳定性允许跟踪BEC细胞命运的几个细胞分裂(35]。肝细胞消融后,删除MTZ允许肝再生开始,在此期间BEC-derived lpc的分化成肝细胞(4,5]。确定切口的影响抑制LPC-to-hepatocyte分化过程,我们处理的幼虫γ分泌酶抑制剂LY411575长达22个小时,从20个小时到MTZ消融(A20h)直到6小时后MTZ冲刷(R6h)(图1(一))。经过13个小时的LY411575治疗(A33h),有一个数量的显著增加Tp1:H2B-mCherry⁺/ Hnf4a⁺LY411575-treated肝脏细胞相比,二甲亚砜(DMSO)处理控件(数字1 (b)和1 (c))。Hnf4a并不表现在bec nonablated肝脏(4]。事实上,的数量Tp1:H2B-mCherry⁺/ Hnf4a⁺细胞LY411575-treated再生幼虫在DMSO-treated A33h没有明显不同于再生幼虫R6h(数字1 (b)和1 (c); )。的总数Tp1:H2B-mCherry⁺细胞之间的可比性DMSO, LY411575-treated再生肝脏在A33h(图1 (b)),建议增加Tp1:H2B-mCherry⁺/ Hnf4a⁺细胞不是由于BEC扩散。评估R6h显示增加肝细胞的基因表达标记fabp10a,bhmt,组织在减少sox9b和切口目标基因her9表达LY411575-treated再生肝脏而DMSO控制(图1 (d))。在一起,这些结果表明,抑制Notch信号促进LPC-to-hepatocyte在BEC-mediated肝脏的重新分化。

2.2。在bec N3ICD过度抑制Hnf4a感应BEC-Mediated再生

我们下一个评估的影响增强Notch信号在LPC-driven再生使用Tg (hs N3ICD):行,N3ICD的诱导表达的控制下热休克蛋白70 l子(36]。应用热休克诱导N3ICD A27h和A30h时间点的表达式,并分析了幼虫在A33h(图2(一个))。在控制幼虫,Hnf4a表达式在大约40%的明显Tp1:H2B-mCherry⁺细胞,但是数量Tp1:H2B-mCherry⁺/ Hnf4a⁺细胞在N3ICD-expressing幼虫(数据大幅减少2 (b)和2 (c))。的总数Tp1:H2B-mCherry⁺细胞是两组之间的比较。我们还指出,作为评估Tp1:H2B-mCherry表达模式,更多Tp1:H2B-mCherry⁺比控制细胞N3ICD-expressing幼虫表现出一个细长的形状的核(图2 (b)箭头),类似BEC核,大多数Tp1:H2B-mCherry⁺控制细胞表现出一个圆形的细胞核(图2 (b)箭头),功能让人想起肝细胞细胞核。这些N3ICD超表达数据表明,增强Notch信号削弱LPC-to-hepatocyte分化我们的斑马鱼模型。

2.3。Hnf4a感应在bec是丰富的sox9b杂合的斑马鱼突变体

作为sox9b直接下游靶基因Notch信号(25如果减少),我们下一个评估sox9b足以提高LPC-to-hepatocyte分化,观察到LY411575-treated再生肝脏。为此,我们利用sox9b杂合的斑马鱼突变体,进行正常肝发展在缺乏挑战25]。我们决定在A30h时间分析这些幼虫在MTZ肝细胞消融(图3(一个)),因为这标志着Hnf4a感应在bec的开始阶段。在这个时间点,有更多Tp1:H2B-mCherry⁺/ Hnf4a⁺细胞sox9b^{+ / -}突变体比野生型的兄弟姐妹(数字3 (b)和3 (c)在bec),表明了Hnf4a感应Sox9b haploinsufficiency。

2.4。BEC-Specific Sox9b过度损害LPC-to-Hepatocyte分化

以确定Sox9b足以阻止LPC-to-hepatocyte分化的过度表达,我们利用Tg (fabp10a CFP-NTR):;Tg (Tp1 CreERT2):;Tg (ubb loxP-CFP-loxP-sox9b-2A-mCherry):幼虫,在政府4-hydroxytamoxifen (4-OHT)过表达Sox9b(特别是在bec37]。为此,我们处理的幼虫4-OHT从2到5 dpf,重叠与MTZ-induced肝细胞消融(图3 (d))。评估LPC-to-hepatocyte分化,我们检查的表达mCherry (Sox9b-overexpressing细胞),肝细胞标记Bhmt, CFP(派生的fabp10a: CFP-NTR转基因)在肝脏R24h时间点,在LPC-derived肝细胞(很明显4]。量化的Bhmt的百分比⁺细胞之间CFP⁺/ mCherry^{- - - - - -}和CFP⁺/ mCherry⁺数量显示Bhmt明显减少⁺细胞CFP⁺/ mCherry⁺人口(图3 (f)),这表明Sox9b过度抑制LPC-to-hepatocyte分化。的mCherry⁺/ Bhmt⁺肝细胞中观察到这种模式可能来源于细胞中Sox9b超表达在细胞的诱导Hnf4a感应或没有足够Sox9b表达式来削弱LPC-to-hepatocyte分化,随着4-OHT管理直到消融期的结束。一起的数据sox9b突变体,这些结果表明,Sox9b表达bec是LPC-to-hepatocyte分化的抑制。

2.5。LY411575治疗救助缺陷BEC-to-Hepatocyte过渡在ms - 275治疗,但不是JQ1——或者DMH1-Treated,再生肝脏

进一步证明了Notch信号之间的直接机械连接和Sox9b调节LPC的分化,我们试图确定抑制Notch信号可以拯救分化缺陷在幼虫Hdac1抑制剂治疗ms - 275,损害LPC-to-hepatocyte分化通过增强sox9b表达式[34]。为此,我们治疗Tg (fabp10a CFP-NTR):;Tg (Tp1 H2B-mCherry):幼虫和化合物的各种组合评估LPC-to-hepatocyte分化的程度在R24h时间点(图4(一))。我们为Bhmt识别LPC-derived肝细胞染色,在DMSO-treated控制幼虫明显(图4 (b))。仅在幼虫治疗ms - 275,有Bhmt明显减少⁺/ H2B-mCherry⁺细胞,表明受损LPC-to-hepatocyte分化。然而,当幼虫与ms - 275和LY411575 cotreated R24h,有一个显著增加Bhmt的数量⁺/ H2B-mCherry⁺细胞(图4 (c)),表示救援缺陷LPC-to-hepatocyte分化诱导的ms - 275治疗。如果切口抑制促进LPC-to-hepatocyte分化的机制是通过减少sox9b表达式,然后其他化合物可能抑制LPC的分化机制增强sox9b表达式不应受到LY411575治疗。因此,我们利用DMH1选择性BMP抑制剂,抑制LPC-to-hepatocyte分化(33]。单独治疗DMH1受损Bhmt表达式,和cotreatment DMH1 LY411575 Bhmt感应表现出类似的障碍(数字4 (b)和4 (c)),这表明抑制Notch信号不救援LPC-to-hepatocyte分化缺陷引起的BMP信号受损。幼虫JQ1处理时,打赌蛋白抑制剂,有缺陷的BEC去分化成lpc的,就是明证减少CFP和Bhmt表达式R24h(图4 (b))。与LY411575 Cotreatment没有显著增加Bhmt的数量⁺/ H2B-mCherry⁺细胞在JQ1-treated幼虫(图4 (c)),这表明抑制Notch信号不足以拯救LPC的缺陷与打赌蛋白抑制幼虫。在一起,这些数据表明LY411575只是能够改善缺陷LPC-to-hepatocyte分化如果这个缺陷是造成的增强sox9b表达式,为ms - 275治疗再生幼虫但不是DMH1——或者JQ1-treated幼虫。

3所示。讨论

在这项研究中,我们表明,抑制轴Notch-Sox9b信号促进LPC-to-hepatocyte分化的斑马鱼肝细胞消融模型。鉴于bec的健壮的去分化成肝细胞后lpc的消融和高度可再生的和协调的lpc的分化成肝细胞或bec [4),该模型允许仔细评估LPC的分化的分子机制。此外,离合器尺寸大,在水中快速增长,和光学透明的斑马鱼胚胎(38)使它非常容易使用小分子抑制剂调节特定信号通路在肝再生的关键阶段(32- - - - - -34]。为此,我们使用了γ分泌酶抑制剂LY411575演示增强诱导的肝细胞标记Hnf4a bec在早期肝脏再生。我们进一步显示激活的Notch信号通过N3ICD超表达了Hnf4a归纳。我们另外证明sox9b^{+ / -}突变体幼虫显示促进Hnf4a感应,而BEC-specific Sox9b过度降低肝细胞标记Bhmt的表达,揭示Sox9b模仿切口的调制调制在LPC-driven肝脏再生。最后,我们从力学上看链接切口和Sox9b表明LY411575 cotreatment救援sox9boverexpression-mediated LPC-to-hepatocyte分化缺陷在ms - 275 treatedregenerating幼虫(34]。我们提供了证据,这个救援Sox9b依赖,作为LY411575 cotreatment没有拯救LPC的分化DHM1 -[缺陷33]或JQ1-treated幼虫(32]。

啮齿动物肝脏中Notch信号促进胆管形态发生发展(14- - - - - -16]。缺口信号在人类肝脏发展也很重要,随着Alagille综合症患者切口的突变信号组件,如Jagged1(39,40),Notch2(41),而大多数的患者显示新生儿黄疸的临床表现,胆汁淤积、肝内胆管缺乏(42]。在胆道开发符合其角色,Notch信号已经被证明可以促进BEC或者在肝损伤(LPC的扩散6,21,23]。很多研究也证明了在体外抑制Notch信号需要LPC-to-hepatocyte分化(18- - - - - -20.),证实了的在活的有机体内提出了研究数据。扩张的活性bec是人类慢性肝病的共同特征(3],ductular反应细胞分泌促炎和profibrogenic细胞因子(43]。作为ductular反应的程度与肝损伤的严重程度(2)理论,促进LPC-to-hepatocyte分化将服务于两个目的:[1)减少profibrogenic ductular反应和2)提供肝细胞的来源。为此,抑制慢性肝损伤患者的Notch信号可能会降低活性bec的数量,从而减少肝纤维发生,以及促进LPC-to-hepatocyte分化。支持这一假说,发现斑马鱼肝纤维化模型对抗Notch信号提升LPC-to-hepatocyte分化(6),和脂肪肝炎小鼠模型发现Jagged1促进分化的巨噬细胞表达的lpc的bec,虽然表情麻木,损害Notch信号提升lpc的分化成肝细胞(44]。然而,其他组织报道,Notch信号是bec的去分化成所需的lpc的斑马鱼肝细胞消融模型(5),抑制Notch信号不足以促进LPC-to-hepatocyte分化在淤胆型肝损伤(23]。此外,抑制Notch信号可能损害肝脏再生,因为Notch信号报道促进大鼠部分肝切除术后肝细胞增殖(45,46],尽管另一组报道,过度的Rbpj肝细胞细胞系减少肝细胞增殖(16]。这种混合证据的效力等级抑制在促进肝脏再生表明更加谨慎在活的有机体内分析切口抑制的临床相关的慢性肝损伤模型是必要的切口抑制剂之前提出作为人类患者的治疗选择。

Sox9已知活性bec的标记,和我们最近表明,增强Sox9b表达抑制LPC-to-hepatocyte分化(34]。作为sox9b是切口的下游靶基因在肝脏信号(25),我们将演示的减少sox9b表达促进LPC-to-hepatocyte分化。虽然已知Sox9调节胆汁开发(24,25)和异位表达Sox9的观察肝损伤的肝细胞在多种形式(26- - - - - -30.),所知甚少Sox9在肝脏再生的作用。表达Sox9的肝细胞被认为促进bipotent状态(28,30.]。这也是在肝癌的上下文;Sox9表达肝细胞癌(HCC)细胞与未分化状态,静脉入侵,减少患者总生存期(47]。此外,核本地化Sox9的肝内胆管癌(ICC)与中等或低分化状态(48],Sox9过度ICC与侵袭性增加,预后差(49]。切口也开车的表达Sox9在刑事法庭,作为镍镉的水动力尾静脉注射质粒与AKT超表达质粒足以诱发刑事法庭在老鼠身上,以及由此产生的刑事法庭表达Sox9 [50]。在慢性肝病患者更容易患肝癌(1),减少Sox9表达式作为一种手段促进LPC-to-hepatocyte分化在慢性肝病患者也可减少肝肿瘤发生。然而,Sox9的重要性在促进肝细胞增殖在慢性肝损伤模型是未知的;因此,之前还需要做更多的工作策略,减少Sox9表达式可以用于慢性肝病患者。

总之,目前的研究表明,抑制Notch-Sox9信号轴促进斑马鱼LPC-to-hepatocyte分化。我们的发现支持这一信号通路的重要性LPC-mediated肝再生和证明的效用斑马鱼肝损伤模型来识别LPC的增殖和分化的调节器。我们预计,未来的研究将继续阐明调节LPC的分化在再生的因素,从而将导致新的治疗策略的发展为慢性肝病患者。

4所示。材料和方法

4.1。斑马鱼的研究

实验机构批准,动物保健和使用委员会(IACUC)匹兹堡大学。胚胎和成年鱼在标准实验室条件下提高和维护。我们使用了sox9b^fh313突变体和后转基因线行:Tg (fabp10a CFP-nfsB):^s931(4),Tg (EPV.TP1-Mmu.Hbb hist2h2l-mCherry):^s939(35),Tg (hsp70l canotch3-EGFP):^co17(36),Tg (EPV.Tp1-Mmu.Hbb: Cre-ERT2 cryaa: mCherry)^s959(51),和Tg (ubb loxP-eCFP-loxP-sox9b-2A-mCherry):^{jh4 37}(把这里称为Tg (fabp10a CFP-NTR):,Tg (Tp1 H2B-mCherry):,Tg (hs N3ICD):,Tg (Tp1 CreERT2):,和Tg (ubb loxP-CFP-loxP-sox9b-2A-mCherry):分别)。

肝细胞进行消融治疗Tg (fabp10a CFP-NTR):幼虫与10毫米MTZ蛋水补充0.2% DMSO和0.2毫米1-phenyl-2-thiourea (PTU)。

4.2。基因分型的sox9b突变体

为sox9b基因分型,基因组DNA是放大与野生型等位基因(5 - - - - - -AGACCAGTCGTAGCCCTT-3 )或突变allele-specific (5 - - - - - -AGACCAGTCGTAGCCCTA-3 )反向引物和一个共同的引物(5 - - - - - -TGAGTGTGTCCGGAGCTCCGA-3 )。

4.3。LY411575, JQ1 DMH1, ms - 275治疗

女士- 275 (Selleckchem,休斯顿,德克萨斯州)治疗,25岁μM用于最终的浓度。JQ1(开曼化学,安阿伯市MI), 3μ米被用于决赛如前所述浓度(52]。LY411575(开曼化学,安阿伯市MI)和DMH1 (Selleckchem,休斯顿,德克萨斯州)治疗,10μM是用作之前报道33]。

4.4。包埋疣状

如前所述(执行包埋疣状53),使用下面的抗体:山羊anti-Hnf4a (1: 50;圣克鲁斯、达拉斯、TX),鼠标anti-Bhmt (1: 400;礼物Jinrong彭浙江大学),鼠anti-mCherry (1: 400;等位基因生物技术、圣地亚哥、CA)和Alexa萤石,488 - 568,和647 -共轭二次抗体(1:500;生命技术、大岛,纽约)。

4.5。图像采集、处理和统计分析

蔡司LSM700共焦显微镜是用来获取图像数据。分析了共焦栈使用禅宗2009软件。所有数据、标签箭头,酒吧、规模,并概述了组装或使用Adobe Illustrator软件绘制。对于分析关于只有两组,小动物——一张长有学生的 - - - - - -测试执行 被认为是重要的。为分析关于以上两组,单向方差分析测试执行, 被认为是重要的。定量数据都显示为 。

4.6。热休克状态

Tg (hs N3ICD):幼虫被转移到热休克鸡蛋水prewarmed 37°C和保持在这个温度20分钟(如前所述)(54]。

4.7。Cre / loxP-Mediated Sox9b超表达

鱼带着Tp1: CreERT2转基因是交叉Tg (ubb loxP-CFP-loxP-sox9b-2A-mCherry):鱼。幼虫从十字架治疗MTZ从3.5到5 dpf,另外处理5μ从2到5 dpf M 4-OHT 3天。在6 dpf, 24小时4-OHT和MTZ惨败后,幼虫是疣状,露出mCherry收获和加工⁺细胞表达Sox9b,如前所述37]。

4.8。定量聚合酶链反应(qPCR)

总RNA提取50解剖肝脏(池)使用RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA);互补脱氧核糖核酸合成的RNA使用上标®三世第一链合成SuperMix(生活技术,大岛,纽约)根据设备协议。如前所述(执行qPCR55),使用Bio-Rad iQ5 qPCR机与智商™SYBR绿色Supermix (Bio-Rad大力神,CA)。eef1a1l1是用于规范化如前所述32]。技术复制(3 x)进行互补dna样本。qPCR使用的引物如下:

eef1a1l1转发(5 - - - - - -CTGGAGGCCAGCTCAAACAT-3 ),eef1a1l1反向(5 - - - - - -ATCAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATTAC-3 ),fabp10a转发(5 - - - - - -GCAGGTTTACGCTCAGGAGA-3 ),fabp10a反向(5 - - - - - -TCCTGATCATGGTGGTTCCT-3 );bhmt转发(5 - - - - - -CTGATCGCTGAGTACTTTG-3 ),bhmt反向(5 - - - - - -CAATGAAGCCCTGGCAGC-3 ),sox9b转发(5 - - - - - -CTGATCGCTGAGTACTTTG-3 );sox9b反向(5 - - - - - -CACACCGGCAGATCTGTTT-3 ),组织转发(5 - - - - - -ACTACGCTGTGGCTGTTGTG-3 );组织反向(5 - - - - - -AATCCTTTGCCCAGTCCTTT-3 ),her9转发(5 - - - - - -AATGCCAGCGAGCATAGAAAGTC-3 ),和her9反向(5 - - - - - -TGCCCAAGGCTCTCGTTGATTC-3 )。

缩写

LPC的:	肝脏祖细胞
BEC:	胆道上皮细胞
Sox9:	SRY-related HMG盒转录因子9
N3ICD:	Notch3胞内域
Rbpj:	复合signal-binding蛋白免疫球蛋白kappa J
监护系统:	3 5-diethoxycarbonyl-1 4-dihydrocollidine
注:	Bromodomain和extraterminal
骨形态发生蛋白:	骨形成蛋白
Hdac1:	组蛋白脱乙酰酶1
正常:关系	硝基还原酶
MTZ:	灭滴灵
dpf:	天postfertilization
h:	小时
4-OHT:	4-Hydroxytamoxifen
肝细胞癌:	肝细胞癌
国际刑事法庭:	肝内胆管癌
IACUC:	机构的动物保健和使用委员会
DMSO溶液:	二甲亚砜
PTU:	1-Phenyl-2-thiourea
qPCR:	定量聚合酶链反应。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

研究和设计概念:”栏目和科学博士数据分析:”栏目和J.O.R.解释数据:”栏目,J.O.R.,D.S. Writing the paper: S.K., J.O.R., and D.S. Study supervision and funding: S.P.M. and D.S. Jacquelyn O. Russell and Sungjin Ko are co-first author.

确认

工作得到了国家卫生研究院的基金科学博士(DK101426) S.P.M. (DK62277, DK100287, CA204586)和J.O.R. (T32EB0010216 1 f31dk115017)。实验病理学S.P.M.是一个赋予椅子。

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