预处理大鼠骨骨髓来源间充质基质细胞toll样受体受体激动剂

文摘

骨骨髓来源间充质基质细胞(BM-MSCs)是动态的细胞能够感知环境,适应不同条件下的监管职能。因此,BM-MSCs的治疗潜力可以通过预处理调制策略旨在修改他们的旁分泌作用。虽然老鼠BM-MSCs (rBM-MSCs)被广泛测试在临床前研究中,大多数BM-MSCs预处理研究人类和老鼠。在此,我们调查是否rBM-MSCs修改他们的表型和旁分泌功能,以应对toll样受体(TLR)受体激动剂。数据显示rBM-MSCs TLR3表达、TLR4 MDA5 mRNA和能够内化polyinosinic-polycytidylic酸(聚(我:C)), TLR3 / MDA5受体激动剂。rBM-MSCs然后刺激与保利(我:C)或脂多糖(LPS, TLR4受体激动剂)1 h,在正常培养条件。有限合伙人或聚(我:C)刺激并不影响生存能力或rBM-MSCs的形态,没有修改关键细胞表面标记物的表达模式。保利(我:C)没有产生显著变化多种炎症介质的释放和rBM-MSCs VEGF,尽管它倾向于增加il - 6和MCP-1分泌,而有限合伙人增加释放il - 6, MCP-1, VEGF,三个因素被如果持续分泌的细胞。的神经营养活性条件培养基从如果LPS-preconditioned rBM-MSCs研究使用背根神经节外植体,表明如果产生的可溶性因子和LPS-preconditioned rBM-MSCs可以刺激神经突产物同样,VEGF-dependent的方式。LPS-preconditioned细胞,然而,更有效地增加再生轴突的数量在一个模型大鼠的坐骨神经横断。 In conclusion, LPS preconditioning boosted the production of constitutively secreted factors by rBM-MSCs, without changing their mesenchymal identity, an effect that requires further investigation in exploratory preclinical studies.

1。介绍

间充质基质细胞(msc),多功能细胞,可以隔绝广泛的胎儿,围产期,和成人组织,已成为一种很有前途的细胞类型为再生医学(1,2]。虽然msc分化成神经元和胶质细胞体内,他们有强大的免疫调节特性,为神经再生以旁分泌的方式,这使得他们一个有吸引力的选择一些神经系统疾病的新疗法的发展(3- - - - - -7]。

msc的最有趣的特性之一是他们应对环境变化的能力,如氧张力的变化或其为病原体接触的分子模式(pamp) alarmins和其他炎症介质(8- - - - - -11]。例如,人类,马,鼠msc获得来自不同组织表达功能已被证明toll样受体(TLR) [12- - - - - -16]。刺激MSC与脂多糖(LPS),一个典型的TLR4受体激动剂,核factor-kappa B和增殖激活蛋白激酶信号通路,导致MSC旁分泌活动的调制(15,17- - - - - -20.]。此外,msc刺激时获得一种独特的功能表型polyinosinic-polycytidylic酸(聚(我:C)),双链RNA的合成模拟激活TLR3 [13,19,20.]。这些观察结果导致预处理toll样受体激动剂的使用协议旨在提振和/或修改msc的治疗效果21- - - - - -23]。

然而,据我们所知,只有少数研究了有限合伙人的影响和聚(我:C)对大鼠骨骨髓来源msc (rBM-MSCs) [24- - - - - -27),尽管rBM-MSCs仍广泛应用于临床前研究。在最近的评论文章,例如,我们确定了18文章来源于msc (BM-MSCs)动物模型的移植骨脑出血和蛛网膜下腔出血,其中14使用rBM-MSCs [3]。同样,rBM-MSCs已广泛应用于研究调查的临床疗效BM-MSCs治疗中枢和外周神经疾病(4,28]。此外,尽管这些研究提供了证据,BM-MSC-based疗法可促进周围神经损伤的修复29日- - - - - -31日),数据预处理msc在周围神经系统的影响是有限的(21,32]。在这项研究中,我们评估的影响一个简短的接触有限合伙人或聚(我:C)表型,旁分泌/营养活动,proregenerative rBM-MSCs的能力。

2。材料和方法

2.1。动物

所有程序都是依法批准并进行动物保健和使用委员会里约热内卢联邦大学做的。所有的动物获得了人道关怀的遵守“实验动物保健原则”由国家制定医学研究学会和美国国家科学院指导实验室动物保健和使用的。Wistar鼠的男女体重250 - 400克被用于这项研究。

2.2。rBM-MSC文化和维护

Wistar鼠深感通过腹腔内注射麻醉的混合甲苯噻嗪盐酸盐(15毫克/公斤)和盐酸氯胺酮(100毫克/公斤),颈椎错位安乐死。胫骨和股骨的后爪被移除和认真分析相邻组织在无菌环境中。松果体被减少,骨髓是刷新骨头在300 g离心后的5分钟。细胞在杜尔贝科resuspended修改鹰的媒介/营养混合物F-12 (DMEM / F12;热费希尔科学)培养基补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco)和机械分离。细胞从一个胫骨和股骨汇集和镀在DMEM / F12补充10%的边后卫(维护媒介)在100 mm细胞培养皿中,被保存在一个孵化器有限公司为5%₂在37°C。经过12 h,不依从细胞被洗两次与磷酸盐(PBS)和维护中添加和更新每2 - 3天。当rBM-MSCs到达大约80 - 90%的融合,细胞收获与胰蛋白酶/ EDTA溶液(0.25%胰蛋白酶EDTA约1毫米;热费希尔科学)和增加了3 - 5个段落在维护中。的身份证实了rBM-MSCs评估细胞表面标记物的表达通过流式细胞术,如下所示,以及通过评估他们的能力分化为中胚层细胞谱系,在我们之前的研究(33]。

2.3。RNA分离、cDNA准备和rt - pcr

rBM-MSCs在100毫米在标准条件下培养细胞培养菜肴24 h,收获和储存在-80°C,直到RNA制备。RNA被隔离使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。1μg总RNA消化使用DNase我(Ambion热费希尔科学),并使用上标互补脱氧核糖核酸合成二世逆转录酶(热费希尔科学)。使用执行rt - pcr引物列在表中1(20 pmol)和40个周期(95°C 15年代,56°C 30年代,30年代和72°C)。电泳是使用PCR产品在2%琼脂糖凝胶沾GelRed核酸凝胶染色(Biotium)和可视化与《奥德赛》®Fc成像系统,使用图像工作室5。x软件(LI-COR生物科学)。

2.4。保利(我:C)内化

确定rBM-MSCs能够内化保利(我:C),细胞被镀在密度10³细胞/ 35毫米的玻璃盘(尺寸:14毫米)。24小时后,细胞被孵化rhodamine-labeled高分子量聚(我:C) (1μg / mL;InvivoGen)观察聚过程的细胞(我:C)内部化使用观察者时不时共焦显微镜(蔡司)。

2.5。预处理的rBM-MSCs

在这项研究中使用的预处理协议(toll样受体激动剂浓度和培养时间)是基于沃特曼等描述的协议。20.]。24小时后在文化、rBM-MSCs刺激了1 h和有限合伙人(10 ng / mL;LPS-B5超纯的大肠杆菌055年:B5;InvivoGen)或高分子量聚(我:C) (1μg / mL;InvivoGen)稀释在维护中。在对照组,rBM-MSCs孵化新的维护媒介1 h。然后,细胞被小心翼翼地清洗5 x DMEM / F12和维护系统中没有额外的刺激23或47 h,如以下规定,评估他们的表型,生存能力,和旁分泌能力。

2.6。流式细胞术分析

的immunophenotype rBM-MSCs被流式细胞术进行评估。msc在100毫米在标准条件下培养细胞培养菜肴24 h,然后用LPS刺激,保利(我:C),或新鲜维护媒介1 h,洗5 x DMEM / F12,并允许增长23 h DMEM / F12 + 10%的边后卫,如上所述。简而言之,rBM-MSCs收获和孵化用鼠标anti-rat CD32抗体20分钟(猫# 550271;RRID: AB_393568, BD Pharmingen)货代阻塞。后来,rBM-MSCs孵化了第二抗体,稀释(1:50)在PBS补充0.5%牛血清白蛋白(BSA), 20分钟在4°C:鼠标anti-CD34 PE共轭(猫# sc - 7324;RRID: AB_2009969;圣克鲁斯生物技术),鼠标anti-CD90 PE-Cy5共轭(猫# 555597;RRID: AB_395971;BD Pharmingen),仓鼠anti-CD29 FITC共轭(猫# 555005,RRID: AB_395639;BD Pharmingen),或鼠标anti-CD45 FITC共轭(猫# MR6901; RRID: AB_1476185; Caltag Laboratories). Cells were then washed with PBS+0.5% BSA and centrifuged at 300 g for 5 min. The pellet cells were again suspended in 300μL PBS和数据。细胞生存能力评估7-AAD(猫# 559925;BD Pharmingen)。数据获得在BD FACSAria II (BD Pharmingen),并分析使用FlowJo软件版本10 (FlowJo, LLC)。

2.7。形态分析rBM-MSCs

rBM-MSCs镀在24-well板块(TPP)用玻璃盖玻片插入(Knittel Glaser)的密度 细胞每口井。12 h后,细胞受到的预处理协议1 h, DMEM / F12洗5 x,种植更多23 h在维护中。然后,细胞被洗3 x的PBS和固定的4%多聚甲醛(PFA) 10分钟。phalloidin染色,下面的步骤进行:透化作用与0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich) PBS为5分钟,阻止0.5% BSA在PBS 20分钟,孵化与phalloidin共轭Alexa萤石®555 (PBS稀释1:100;英杰公司)为20分钟,最后洗PBS。细胞被安装在幻灯片与安装中包含4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Fluoroshield™,σ)。所有步骤都是在室温下进行。图像捕获使用evo™FL细胞成像系统(热费希尔科学)。

2.8。细胞生存能力分析

生活/死细胞生存能力分析(猫# L3224;热费希尔科学)是用来评估的可行性rBM-MSCs经过预处理的协议。rBM-MSCs镀在24-well板的密度 每口井的细胞培养24小时。然后,细胞被提交给预处理协议1 h, DMEM / F12洗5 x,培养在维护中。23 h后,上层清液被丢弃;细胞被洗3 x PBS和孵化在PBS溶液包含calcein-AM(1: 5000)和ethidium homodimer-1(1: 1000) 10分钟37°C。数字化的图像立即从每口井的三个随机选择的字段是使用一个evo FL细胞成像系统。可行的和总细胞之间的比例计算为每个字段。

2.9。Luminex®化验

细胞被镀上24-well盘子和允许坚持24 h。然后,rBM-MSCs与LPS刺激或聚(我:C) 1 h如上所述,DMEM / F12培养基洗5 x,生长在维护中。23或47 h后,条件培养基收集和储存在-80°C。水平的干扰素(IFN)γ白介素- 1 (IL)β2、il - 4、il - 6、il - 10 IL-13,地震,肿瘤坏死因子(TNF),α和血管内皮生长因子(VEGF)以未稀释的样本,使用磁Luminex筛查试验(LXSARM-10;研发系统),遵循制造商的指示。VEGF和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)进行了分析与Milliplex地图大鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板(recytmag - 65 k;微孔),稀释(1:5)样品,遵循制造商的指示。试验板在Luminex立即读取和分析200™系统(微孔)。所有样品和标准在重复测量。

2.10。背根神经节(DRG)外植体培养

DRG外植体获得从产后第一天C57BL / 6 j小鼠崽。Cold-anesthetized动物很快被斩首。DRG被解剖,然后孵化DMEM / F12培养基中含神经生长因子(神经生长因子;20 ng / mL,热费希尔科学)24小时37°C和5%股份有限公司₂在盖玻片24-well板(TPP) (Knittel Glaser)之前涂上poly-D-lysine (10μg / mL,σ)和层粘连蛋白(50μg / mL,热费希尔科学)底部的每个。然后,DRG外植体是孵化24小时的条件培养基从如果或LPS-preconditioned rBM-MSCs(收集47 h与LPS刺激后1 h,如上所述;稀释1:1与新鲜新鲜DMEM / F12培养基)或控制介质(DMEM / F12 + 5%的边后卫,对应的边后卫浓度在其他条件)。新鲜的控制中补充了5%的边后卫和神经生长因子(20 ng / mL)作为一个积极的控制。我们使用rBM-MSCs只获得1动物减少donor-related可变性。Axitinib (5μg / mL, Sigma-Aldrich) VEGFR抑制剂(34),被用来确定MSCs-derived VEGF在DRG神经突的潜在影响结果。孵化后,文化系统是轻轻地用PBS PFA和固定的4%,其次是Tuj1疣状(兔多克隆anti-beta微管蛋白3 / Tuj1抗体;1:300;猫# GTX50789;RRID: AB_11171559;GeneTex)。Alexa萤石488驴anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (1: 600;猫# - 21206;RRID: AB_2535792;热费希尔科学)作为二级抗体。 Samples were mounted directly on a microscope slide with Vectashield® mounting medium with DAPI (Vector Laboratories) and imaged on a Zeiss Axio Imager M2 microscope equipped with an Apotome System and fluorescence optics (Zeiss). Neurite density was quantified in a blinded fashion with ImageJ 1.48v software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

2.11。坐骨神经横断和rBM-MSC移植

总横断和重新连接的坐骨神经进行如前所述[33,35]。雄性Wistar鼠深感通过腹腔内注射麻醉的混合甲苯噻嗪盐酸盐(15毫克/公斤)和盐酸氯胺酮(100毫克/公斤)。一个小切口在皮肤上,右侧坐骨神经被暴露在midthigh水平。坐骨神经切断,远端和近端树桩连接硅胶管的两端,留下一个缺口之间的4毫米树桩。 rBM-MSCs(或预先处理这些rBM-MSCs),悬浮在15μL的基底膜基质®生长因子减少基底膜基质(康宁)解决方案(1:3在DMEM / F12培养基),注入管。这些实验,rBM-MSCs种植24 h DMEM / F12 + 10%的边后卫在组织培养菜(100毫米),与LPS刺激,保利(我:C)或DMEM / F12培养基1 h, DMEM / F12洗5 x,收获用0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液(热费希尔科学)。我们使用rBM-MSCs只获得1动物减少donor-related可变性。在对照组,只有基底膜基质®的解决方案是注入管。从麻醉中恢复后,动物们回到了动物设施和住免费的水和食物。

2.12。坐骨神经的免疫荧光分析

手术后4周,老鼠深深麻醉如上所述,然后用冰冷的0.9%生理盐水灌注transcardially 5分钟,其次是4% PFA在磷酸盐缓冲剂,pH值7.4,25分钟,以恒定流量的2毫升/分钟。坐骨神经在4% PFA 12 h在4°C,通过顺序cryoprotected沉浸在10%,20%和30%磷酸盐蔗糖24小时解决方案在每个解决方案4°C。坐骨神经是嵌入在Tissue-Tek®O.C.T.化合物(樱花),和14μ米厚的纵向部分得到使用低温恒温器(徕卡1850厘米,徕卡微系统)。部分是安装在gelatin-coated幻灯片和储存在−20°C到免疫荧光程序进行。

免疫荧光分析、神经部分被固定为4% PFA 15分钟,洗净用PBS ( 每个),孵化与0.3% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)在PBS溶液5分钟,和阻止1% BSA在PBS溶液在室温下30分钟。然后,神经部分与兔子anti-beta孵化微管蛋白3 / TuJ1多克隆抗体(1:300;猫# GTX50789, RRID: AB_11171559;一夜之间GeneTex)在4°C。部分被用PBS ( )和孵化biotin-conjugated鼠标anti-rabbit免疫球蛋白(gamma-chain特定)单克隆抗体(1:600;猫# B5283;RRID: AB_258574;在室温下Sigma-Aldrich) 90分钟。然后,部分与Cy3-conjugated孵化链霉亲和素(1:100;热费希尔科学)90分钟在室温下,用PBS(3×5分钟)和密封的安装介质包含DAPI (Fluoroshield™;Sigma-Aldrich)。

坐骨神经的再生部分在聚乙烯管,彩色TuJ1,轴突的标记,被拍到使用40 x客观蔡司Axio成像仪M2显微镜配备Apotome系统和荧光光学(蔡司)。图像盲法的方式进行了分析使用禅宗软件(蔡司),通过跟踪10行,25岁μ米,再生神经的近端和远端部分段( 每个),开始20μ从残端缝合区域。TuJ1-positive轴突穿越每一行的数量平均为每一个部分。

2.13。统计分析

统计分析了使用GraphPad棱镜(GraphPad软件)6.01版本。数据表示为 或中位数和四分位范围,显示在图的传说。以下测试是使用:单向方差分析(方差分析)Newman-Keuls多重比较测试(用于参数数据),克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的多重比较检验(非参数数据),或者是弗里德曼测试和邓恩的多重比较测试(两两比较),表示。观察到的差异被认为是重要的时候 。

3所示。结果

3.1。rBM-MSCs先天免疫受体表达,可以内化保利(我:C)

与预处理协议之前,我们评估是否rBM-MSCs先天免疫受体表达有限合伙人(TLR4)和聚(我:C) (TLR3和MDA5) (36,37通过rt - pcr)。这一分析表明,rBM-MSCs从三个不同的捐赠者表达TLR4的信使rna, TLR3和MDA5(图1)。

鉴于TLR3和MDA5胞内受体识别双链RNA,保利(我:C)需要内化激活这些受体。因此,我们进行一个实验来评估是否保利(我:C)将由rBM-MSCs内化在1 h预处理协议。Rhodamine-conjugated保利(我:C)被添加到培养基,细胞共焦的旋转圆盘显微镜成像。荧光斑点在msc孵化后15分钟内可见,和荧光斑点的数量增加85分钟观察期间(图2A)。共焦重建显示细胞内聚的存在(我:C)在rBM-MSCs 1 h(图2 (b))。

3.2。有限合伙人和聚(我:C)预处理不影响rBM-MSCs的表型和活力

流式细胞术分析确定预处理协议与有限合伙人或聚(我:C)将改变关键的细胞表面标记物的表达用于MSC表型的鉴定。细胞治疗与有限合伙人或聚(我:C)或保存在控制中没有刺激1 h,洗,允许增加一个额外的23 h。尽管CD90和CD29,两个MSC标记(38,39),98%以上的细胞表达的所有条件(图3),不到4.12%的细胞表达造血血统CD45和CD34标记实验(图组3)。根据这些结果,我们发现msc的形态没有改变23 h后的有限合伙人或聚(我:C),评估通过染色细胞与phalloidin f -肌动蛋白标签(图4 (b))。此外,rBM-MSCs的可行性并不影响有限合伙人或聚(我:C),所展示的生活/死可行性分析执行刺激(图23 h后切除4(一))。这些结果表明,在本研究中使用的预处理策略没有细胞毒性,不诱导表达谱的变化形态的细胞表面标记和rBM-MSCs。

3.3。有限合伙人和聚(我:C)预处理对炎症介质的释放,rBM-MSCs VEGF

msc可以发挥他们的治疗行动通过旁分泌机制,包括营养因子的释放,细胞因子和趋化因子1,40]。因此,我们评估是否短暂接触有限合伙人或聚(我:C) 1 h将改变rBM-MSCs的分泌能力。使用磁luminex免疫测定,我们测量可溶性分子的表达rBM-MSCs条件培养基的培养为一个额外的23 h或47 h后刺激了。这一分析显示,rBM-MSCs标准培养条件和LPS刺激下分泌il - 6的浓度增加il - 6在这两个时间点的条件培养基,如果相比rBM-MSCs(图5)。保利(我:C)刺激的影响il - 6的释放,没有达到统计学意义(图5)。rBM-MSCs持续分泌VEGF,尽管它是不可能来定量确定VEGF水平由于高浓度的这个分子在所有样本。相反,干扰素-的水平γ,il - 1β2、il - 4、il - 10 IL-13,地震,TNF -α仍低于检出限的测定在所有组。

考虑到VEGF参与了几个修复和再生过程,包括血管、神经发生,和周围神经再生(41,42),我们做了另一组实验量化VEGF水平在稀释的样本(1:5)预处理和如果rBM-MSCs。VEGF水平明显高于条件培养基从LPS-preconditioned rBM-MSCs,相比条件培养基从如果rBM-MSCs,在47 h。相比之下,保利(我:C)预处理rBM-MSCs没有增加VEGF分泌。VEGF水平更低的培养基从保利(我:C)预处理rBM-MSCs比培养基从LPS-preconditioned rBM-MSCs 23 h(图5)。MCP-1水平也评估在这个实验中,鉴于这趋化因子在沃勒变性的核心作用和轴突再生43,44]。我们发现MCP-1公布了如果rBM-MSCs, LPS刺激增加了这个分子的浓度培养基在23 h和47 h。我们还发现高水平的培养基的MCP-1保利(我:C)预处理rBM-MSCs 23 h比培养基从如果rBM-MSCs,尽管没有统计学意义(图5)。自维护培养基补充10%的边后卫,我们也分析了VEGF水平和MCP-1新鲜维护中游离,排除这种可能性,我们检测VEGF和MCP-1的边后卫。VEGF和MCP-1水平都低于检出限的测定,这对大鼠蛋白质的检测验证。综上所述,这些研究结果表明,生理释放il - 6, MCP-1,和VEGF可以增强培养rBM-MSCs短暂的接触有限合伙人,而其他促炎(干扰素的生产γ,il - 1β2、地震和TNF -α)和抗炎细胞因子(il - 4、il - 10 IL-13)没有观察到任何条件。

3.4。有限合伙人预处理不影响的能力rBM-MSC-Conditioned DRG外植体诱导神经突生长介质

我们以前,rBM-MSCs的旁分泌活动增强神经突生长显示在DRG感觉神经元transwell培养系统(33]。考虑到rBM-MSCs持续高水平的分泌VEGF,如上所示,,VEGF可以促进神经突生长和背根神经节感觉神经元(在45,46),我们假设这个神经营养活性rBM-MSCs可能至少部分由VEGF。测试这个假说,DRG外植体生长在DMEM / F12控制媒介,DMEM / F12 + rBM-MSC-conditioned介质,或DMEM / F12 + rBM-MSC-conditioned培养基+ axitinib (VEGF受体抑制剂)。DMEM / F12 +神经生长因子作为一个积极的控制。我们发现rBM-MSC-conditioned介质增加神经突密度与神经生长因子,axitinib废除这种效果(图6)。鉴于有限合伙人预处理增加rBM-MSC培养基中VEGF的水平,我们也评估这种预处理策略是否会影响rBM-MSCs的神经营养活性。我们的研究结果表明,有限合伙人预处理并没有改变rBM-MSC-conditioned介质的影响,促进神经突生长在体外和axitinib废除这种效应(图6)。

3.5。有限合伙人的预处理效果Proregenerative rBM-MSCs在周围神经系统的能力

考虑到VEGF、il - 6和MCP-1参与周围神经修复和再生42,43,47),我们评估了proregenerative rBM-MSCs容量和LPS-preconditioned rBM-MSCs坐骨神经横断大鼠模型。动物被分成3组。汽车组,只有基底膜基质®方案注入管,而在其他两组实验, rBM-MSCs或LPS-preconditioned rBM-MSCs分别悬挂在基底膜基质®解决方案和注入管后立即坐骨神经横断和tubulization。汽车组相比,治疗LPS-preconditioned rBM-MSCs或如果rBM-MSCs倾向于增加TuJ1的数量⁺近端和远端部分的轴突再生神经部分损伤后4周。事实上,在统计上有显著差异的TuJ1的数量⁺每平方毫米,轴突比较动物收到车辆和那些接受LPS-preconditioned rBM-MSCs,近端和远端部分再生神经段(数字7(一)- - - - - -7 (c),7 (f),7 (g))。没有神经厚度的差异或在细胞密度中观察组(数字7 (d)和7 (e))。

4所示。讨论

BM-MSCs起到至关重要的作用在维护和调节造血干细胞造血利基和他们的后代,而这些监管行为可以影响pamp48- - - - - -51]。msc来自不同来源的治疗潜力也可能依靠他们的能力由局部或全身释放激活因素调节分泌活动(52- - - - - -54]。这个证据导致了预处理的搜索策略,旨在指导msc的旁分泌活动。沃特曼和他的同事们(20.),例如,显示一个简短的刺激人类的msc与低剂量的有限合伙人或聚(我:C),两个toll样受体激动剂,能引起所谓MSC1 MSC2表型,类似地,分别M1 / M2巨噬细胞极化和Th1 / Th2范式。

在第一部分的研究中,我们测试是否和rBM-MSCs如何应对保利(我:C),使用沃特曼等描述的协议。20.]。我们表明,rBM-MSCs表达TLR3和MDA5受体保利(我:C)在mRNA水平。然后,我们使用共焦显微镜视频显示,第一次,保利(我:C)的内化msc。我们表明,内化的聚(我:C)是一个相对快速的事件,已经观察到后第一个15分钟内孵化的开始。这些结果验证了该协议的使用(短暂刺激的rBM-MSCs聚(1 h)我:C)与先前的研究报告,在协议TLR3 mRNA的表达,老鼠和人类BM-MSCs(分别mBM-MSCs和hBM-MSCs) [15,55- - - - - -58]。这些发现也符合工作Raicevic et al .,那些报道,hBM-MSCs表达功能MDA5 [59]。在他们的研究中,聚(我:C)内化被转染试剂促进LyoVec,这种方法已被证明刺激视黄acid-inducible基因——(钻机)我喜欢受体(RLR),如MDA5、而不是TLR3 [60,61年]。虽然RLR的激活可以触发细胞死亡,Raicevic等人显示,只有长时间的刺激(48小时),高剂量的聚(我:C)结合LyoVec(但不是单独使用聚(我:C))可以诱导细胞死亡在hBM-MSCs [59]。我们的结果同意这些研究结果,表明短暂暴露于聚(我:C) 1 h不影响rBM-MSCs的可行性。此外,细胞形态和细胞表面标记物的表达被这预处理协议没有改变,这表明这些细胞保持MSC刺激后的身份。然而,先前的研究已经表明,聚(我:C)刺激增加rBM-MSCs的成骨和脂肪形成的分化潜能和hBM-MSCs在适当的电感的存在刺激27,58,62年]。的表达功能mda - 5和TLR3 BM-MSCs可能因此让这些细胞应对双链RNA病毒不改变他们的MSC的身份。

MSC2概要文件的主要特性之一沃特曼等人报道的趋化因子的分泌增加IP-10和咆哮,在较小程度上抗炎细胞因子il - 4和il - 1020.]。我们没有使用rBM-MSCs生殖能力的这些发现,没有检测出分泌il - 4和il - 10在任何条件。IP-10咆哮,然而,并不包括在我们的检查化验。我们却发现一个简短的刺激与聚(我:C)倾向于增加il - 6的分泌和rBM-MSCs MCP-1,尽管这些影响没有达到统计学意义。在这方面,诱导的细胞因子il - 6是最稳定报道在之前的预处理研究刺激mBM-MSCs和hBM-MSCs不同剂量和曝光时间的聚(我:C)(表2)。这可能表明,在我们的研究中使用的剂量太低或刺激的时间太短暂了。大多数的研究概述在表2骨髓间充质聚暴露(我:C)至少4 h,而我们刺激细胞与保利(我:C)只有1 h。它也证明了人类鼻mucosa-derived msc只有高水平的il - 6分泌和长时间(24小时)刺激后引发聚(我:C),揭示自分泌的机制启动第一个细胞因子的释放增加的敏感性msc保利(我:C) (63年]。因此,在我们的研究中使用的剂量(1μg / mL)已被证明诱导释放il - 6 hBM-MSCs和mBM-MSCs研究这些细胞被刺激的时间更长(表2)。

第二个协议rBM-MSC预处理测试与有限合伙人在本研究中是一个短暂的刺激,bacteria-derived分子常用的诱导促炎的概要文件在不同的细胞类型64年]。我们发现rBM-MSCs TLR4表达,LPS受体,在RNA水平,同意史等。65年),以及与研究执行mBM-MSCs hBM-MSCs [15,55- - - - - -58]。然后,我们表明,短暂的刺激与有限合伙人(使用沃特曼和他的同事所描述的协议(20.)不改变rBM-MSCs的可行性。事实上,以前的研究已经报道,有限合伙人预处理保护mBM-MSCs从H₂O₂/血清deprivation-induced凋亡TLR4和MyD88-dependent的方式(66年),防止细胞凋亡在rBM-MSCs应对缺氧和血清剥夺(67年]。我们的研究结果表明,rBM-MSCs维持其形态和MSC细胞表面标记物的表达与LPS经过短暂的刺激。有趣的是,有限合伙人预处理,结合TNF -α(68年)或使用静电纺丝(69年),可以提高成骨的潜在BM-MSCs生长在成骨的媒体,尽管我们的数据表明,有限合伙人不改变他们的MSC的身份在正常培养条件。

沃特曼等人表明,人类MSC1细胞具有分泌的能力更高水平的il - 6和引发20.]。因此,我们评估是否有限合伙人rBM-MSCs的分泌功能变化。文献检索发现,il - 6的分泌增加LPS刺激后,我们观察到一个非常一致的和可再生的反应。据报道il - 6的水平升高在许多研究调查的影响有限合伙人在老鼠和人类BM-MSCs预处理,不管使用的协议(表2)。我们找不到可检测水平的肿瘤坏死因子-α或il - 1βrBM-MSCs上层清液的实验条件。这是一个令人惊讶的发现,考虑到燕等人你们等人表明LPS诱导这两种细胞因子的生产rBM-MSCs [24,25]。然而,他们使用不同的协议,包括使用一个不同的老鼠应变,高剂量的有限合伙人,和长时间的曝光时间;同时,燕et al。24培养的细胞在钛表面(表2)。此外,il - 1的感应β和肿瘤坏死因子-α发布仅仅是报道的一些研究调查的影响有限合伙人mBM-MSCs和hBM-MSCs(表2)。同意我们的研究结果,这些研究表明,MCP-1和VEGF分泌mBM-MSCs诱导,hBM-MSCs与LPS刺激后(表2)。的功能角色MSC-derived MCP-1被史和他的同事报道(49),表明在小鼠的腹腔内注射低剂量LPS BM-MSCs MCP-1生产的增加,这反过来,动员是必要的炎症性单核细胞进入血液。MPC-1释放的感应可能有限合伙人预处理可能是有用的在趋化因子的生产的情况下受损的原发性疾病或疾病患者将接受自体BM-MSCs,如果这对所需的趋化因子是必要的治疗效果。例如,从lupus-like BM-MSCs老鼠和系统性红斑狼疮患者显示MCP-1水平下降,损害他们的抑制能力(b细胞反应70年],MCP-1 mRNA表达减少BM-MSCs新诊断的1型糖尿病患者(71年]。此外,一个有趣的研究发现释放il - 6之间的负相关,引发,VEGF的BM-MSCs多发性硬化症患者和他们的大脑的白质病变(72年]。

我们还表明,VEGF的释放增加有限合伙人预处理后,尽管以推迟的方式。可能的解释延迟可能rBM-MSCs介质释放的自分泌反应后的第一个小时刺激。其他的研究也发现,mBM-MSCs hBM-MSCs释放更高水平的VEGF在应对有限合伙人(表2)、促炎细胞因子或生长因子(73年- - - - - -77年]。最近的一项研究发现,可溶性淀粉样蛋白-低聚物β肽(βOs)增加培养基中VEGF的水平rBM-MSCs,这些细胞神经元的保护βO-induced氧化应激在coculture系统中,被阻止的鸡尾酒中和抗体对il - 6、il - 10, VEGF (78年]。

值得注意的是,所有的可溶性因子的分泌受到有限合伙人在本研究被rBM-MSCs已经持续分泌,再次表明,细胞保留他们的MSC身份。我们还提到一个相当大的可变性分泌反应的大小有限合伙人和保利(我:C),这反映了发展的挑战MSC-based免疫调节产品预测疗效[79年]。分泌的水平因素,然而,可以作为生物标记物预测msc的功效,证明金正日et al .,发现四个因素的水平之间的相关性(VEGF, MCP-1、引发和血管生成素)和人类沃顿jelly-derived msc的proangiogenic活动从不同的捐赠者80年]。

然后,我们表明,该条件培养基从rBM-MSCs增加神经突在DRG外植体的文化产物,与之前的研究相一致从hBM-MSCs实验使用条件培养基(81年)或rBM-MSCs coculture transwell系统[33]。VEGF的含量极高的条件培养基如果msc可以解释为什么没有区别的影响从如果条件培养基,LPS-stimulated rBM-MSCs增强神经突的产物。这个假设是缺乏营养支持的活动后VEGF受体抑制在两种实验条件,表明VEGF的影响是一个关键因素rBM-MSCs和LPS-preconditioned rBM-MSC-conditioned DRG神经元中。此外,VEGFR1受体表达的外围在癌症疼痛感觉神经元和脊髓运动神经元在开发和再生(82年]。最后,我们发现LPS-preconditioned msc再生轴突的数量增加坐骨神经横断的典范。虽然这种proregenerative效应背后的机制没有调查在目前的研究中,现有的证据表明,msc的旁分泌活动主要是负责大部分的治疗周围神经系统的活动(33,83年]。所有三个因素被rBM-MSCs持续分泌,分泌的增强是由有限合伙人(VEGF、il - 6和MCP-1)是重要的炎症介质和再生过程,发生在周围神经受伤。例如Macrophage-derived VEGF,负责新血管的形成,作为迁移的雪旺细胞的支架引导再生轴突(42]。反过来,il - 6信号加速神经再生(47)和MCP-1招募巨噬细胞必须在沃勒变性神经受伤(84年,85年]。植入一个包含MCP-1 atelocollagen海绵和唾液的分泌ectodomain结合Ig-like lectin-9促进了巨噬细胞的极化到tissue-repairing M2表型和恢复神经功能的面部神经横断模型大鼠(86年]。此外,il - 6分泌的免疫调节作用是证明是必要的mBM-MSCs(影射促炎细胞因子)对体外巨噬细胞极化的影响[87年]。然而,我们不能忽视其他机制的有益的贡献rBM-MSCs对神经再生的影响。msc的免疫抑制功能,例如,已经探索了一些自身免疫性疾病的治疗88年),可能抵消了存在的有害影响。细胞外囊泡的释放msc (89年)和传递健康的骨髓间充质细胞功能失调或死亡的细胞器(90年,91年]也密集的研究的重点。一个详细的功能和机械特性的预先处理这些rBM-MSCs对神经再生的影响超出了本研究的范围,但肯定值得进一步调查。

5。结论

rBM-MSCs能够内化保利(我:C),但他们的旁分泌反应的大小与保利(我:C)短暂刺激大大不同,一个限制,应该在将来的研究中得到解决。有限合伙人预处理提高了生产rBM-MSCs持续分泌的因素,按照先前的研究在人类和老鼠BM-MSCs。重要的是,这些影响是实现在不改变细胞的间充质基质细胞的身份或损伤其神经营养行动。我们的研究结果支持利用rBM-MSCs预处理策略的调查旨在改善MSCs-based疗法的疗效,尤其是临床前对老鼠的研究,仍广泛应用于神经再生领域的(3,28,30.,83年,92年,93年]。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

维克多杜立欧Ribeiro-Resende和佩德罗莫雷诺Pimentel-Coelho贡献同样这项工作。

确认

这项工作是企业管理学院卡洛斯基金会支持恰加斯球场德帕罗尽管带动做里约热内卢(FAPERJ) -APQ1 2013/2 (E26/110.573/2014)。作者还要感谢Departamento de Ciencia e Tecnologia(十进数字)Ministerio da Saude和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)对金融支持(402319/2013-3),以及巴西的资金来源(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,CNPq,和FAPERJ)发放奖学金,让这项研究成为可能。作者感谢珍妮·里德博士的语言编辑稿件,费利佩•马林和卢西亚诺Cavalcante技术援助。

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