骨骼肌居民祖细胞Coexpress间叶细胞和肌原性的标记和不受慢性心脏引起的失调

文摘

背景和目的。在心力衰竭(HF)、代谢改变诱导骨骼肌浪费,降低运动能力和生活质量。激活骨骼肌的再生潜力是未来的策略来减少肌肉萎缩;因此,这个项目的目的是确定功能性质的骨骼肌间叶细胞祖细胞(SM-MPC)受到HF-induced功能和代谢失调。方法。腓肠肌肌肉活检样本来自3健康献血者(HD)心力衰竭患者和12净化mRNA进行进一步分析和孤立SM-MPC。体外细胞扩张和免疫细胞化学、流式细胞术表达间充质(CD105 / CD73 / CD166 / CD146 CD140b / CD140a / VIM)和肌原性的(Myf5 / CD56 / MyoG)标记。细胞诱导分化和免疫染色和Q-PCR进行分析来验证分化的效率。控制肌肉代谢基因的表达和发展比较高清/ HF患者肌肉活检和vitro-differentiated肌管。结果。的upregulation MYH3 / MYH8 Myf6高频骨骼肌中发现随着代谢的改变表明慢性病理激活肌肉发展计划。SM-MPC隔绝HD和心力衰竭患者代表混合人口coexpresses间叶细胞和肌原性的标记和不同于AD-MMSC BM-MMSC, IMF-MSC。的功能属性SM-MPC HD和心力衰竭患者没有差异。结论。在目前的工作中,我们证明我们检测到的代谢和功能改变骨骼肌心力衰竭患者不显著影响净化的功能性质和体外SM-MPC扩大。我们推测,骨骼肌祖细胞保护自己的定位,在有利的情况下可能导致肌肉修复和预防和治疗肌肉萎缩。潜在的新的治疗策略HF-induced骨骼肌浪费应该针对SM-MPC再生潜力的激活和改善骨骼肌代谢状态为SM-MPC-driven肌肉恢复提供一个有利的环境。

1。介绍

在心力衰竭(HF)、功能和代谢改变检测不仅在心肌1,2),但也在骨骼肌组织。氧化应激、系统性炎症、慢性缺氧,降低脂肪酸氧化加上线粒体功能障碍是HF-induced肌肉损伤的因素,包括纤维类型的变化,诱导萎缩,胰岛素抵抗的发展,脂质代谢失调,异位脂肪骨骼肌的口供。此外,慢性激活肾上腺素和利钠肽系统的高频导致脂肪细胞的脂解作用导致持续的积累有毒和中性脂质物种在脂肪和骨骼肌,也会导致骨骼肌损伤(3- - - - - -9]。骨骼肌干细胞功能的障碍也被认为是一个重要因素导致的损失会随着年龄增加肌肉质量(10),同样可以视为因素HF-induced骨骼肌浪费。

开发针对肌肉萎缩疾病的预防和治疗策略仍然是一个未解决的挑战。现在,运动训练,无论是单独或结合营养支持,是最行之有效的策略来减少骨骼肌浪费心力衰竭患者和治疗指南推荐的(7,11]。因此,激活骨骼肌发育,增长,再生潜力是一个重要的机制来治疗/预防骨骼肌肉萎缩。因此,骨骼肌祖细胞,导致骨骼肌再生和增长可能是一个潜在的治疗目标,和功能性质的分析骨骼肌干细胞来源于心脏衰竭患者已经成为一个至关重要的问题。

识别和描述肌原性的祖细胞在产后组织再生潜力的评估是很重要的。在我们最近的研究(12),我们已经表明,骨髓多能间充质基质细胞(BM-MMSC)来源于心脏衰竭患者以多种方式影响心力衰竭:(1)在HF-derived文化中,我们发现upregulation控制再生和纤维化的基因,包括Tgf -β通路,ECM的合成、重构酶和粘附分子;(2)在体外扩张,BM-MMSC心力衰竭患者演示了复制衰老的早期发展和增殖活性的降低;和(3)改变分化潜力也观察到HF-derived样本。然而,当培养条件进行了修改,我们已经实现了主要的净化和扩张的高度增殖nonprofibrotic CD146 + / SMAα分数证明的潜在功效HF-derived BM-MMSC在再生过程中(12]。

多能间充质基质细胞优先tissue-committed祖细胞,导致某些类型的组织的再生。骨骼肌,nonsatellite居民肌原性的祖细胞的作用包括多功能间充质基质细胞在组织再生也报道13- - - - - -17]。在当前的工作中,我们试图调查是否HF-induced代谢失调影响居民骨骼肌的功能性质间叶细胞祖细胞(SM-MPC),以确定这些细胞能够充分应对治疗干预旨在激活肌肉再生和增长,包括物理康复项目集中在肌肉代谢的稳定和预防骨骼肌肉萎缩。

2。方法

2.1。研究设计和伦理问题

目前的工作是一个复杂的正在进行的项目集中在评估有氧体能训练的效率和发展为心脏衰竭患者个性化的物理康复项目。第一个结果证明有氧体能训练的生理反应是最近发表(18,19]。在这个项目中,骨骼肌活检应采取从一组被选的病人参加程序之前和之后的运动训练,以检查肌肉的再生潜能祖细胞在心力衰竭患者提出了工作;RNA-Seq分析将揭示了全球反应的骨骼肌运动训练并确定潜在的具体目标,当样本收集完成。在当前的工作中,第一部分的活检样本使用。所有收集的样本根据协议的机构伦理委员会Almazov国家医学研究中心。所有患者和捐助者进入程序同意并签署知情同意的机构审查委员会批准了声明。研究符合当前良好的临床实践标准和按照原则在赫尔辛基宣言》(1989)。

2.2。人类被试和腓肠肌肌肉活检样本

只有男性捐赠者都加入了这项研究。总共3健康成年人捐助者(HD)和12慢性心脏衰竭患者(高频)登记。心力衰竭患者有以下特点:NYHA ii iii功能类,年龄54±12.5年,身体质量指数(BMI) 26.5±6.4公斤/米²和左心室射血分数(LV EF) 26.4±1.4%。NYHA II: III病人比例是67%:33%。

研究入选标准如下:年龄18 - 65岁,LV EF < 40%(辛普森),稳定的瑞士法郎NYHA ii iii功能类,知情同意签字,执行CPET能力,和最佳的药物和电生理治疗(ICD, CRT-D)。

研究排除标准如下:心肌梗死心肌血管再生,不到3个月,中风和CRT-D植入不到6个月,表达了认知障碍,任何慢性疾病代谢失调,high-gradation室性心律失常没有植入心律转复除颤器(ICD)。

腓肠肌肌肉活检样本来自每个捐赠者/患者基线和经过3 - 6个月的随访。活检样本分为两部分。一个是立即转移到液氮mRNA为进一步净化。第二部分是骨骼肌祖细胞净化立即使用。

因为我们的研究是有限的少量的高清注册到这个项目中,我们证明了一致的响应HD-derived细胞刺激肌原性的差异和相似之处immunophenotypes补充图所示S1。

2.3。骨骼肌的净化与分离间充质祖细胞(SM-MPC)和肌间的脂肪间充质基质细胞(IMF-MSC)

SM-MPC分离酶学根据前面描述的协议(20.,21用微小的变化)。在短暂的,孤立的肌肉被置于一种酶解,与剪刀机械破坏,消化60分钟在5毫升过滤0.1%胶原酶37°C (C0130 Sigma-Aldrich,德国)。消化后去除胶原酶和细胞碎片,细胞悬液离心5分钟 和上层的丢弃。释放干细胞从纤维、颗粒使用无菌吸管resuspended建议在2.5毫升的洗涤媒体(DMEM补充10%马血清(HS)(美国Gibco))。再悬浮后,纤维被允许接受5分钟然后上层清液含有干细胞被转移到一个新的管。增加产量,这一步骤是重复两次。的double-collected上层清液过滤是40μ米尼龙细胞过滤器和离心10分钟 为了丢弃垃圾。然后,结果上层清液都被丢弃的颗粒细胞放置在一个媒体(DMEM补充10% FCS)增殖细胞培养融合菜肴和培养,直到80%。

IMF-MSC样本来自肌间的脂肪组织位于活检材料。IMF-MSC文化准备中描述(22]。脂肪组织分离样品的清洗与磷酸盐(PBS)和悬浮在同等体积的DMEM补充0.1%胶原酶类型III, prewarmed 37°C。组织是放置在一个摇晃在37°C水浴连续搅拌30分钟和离心机在室温下300×g 5分钟;然后,组织样本resuspended文化传媒(DMEM补充流化床燃烧器为10%)和镀在培养皿扩张。

骨髓间充质多功能基质细胞(BM-MMSC)和皮下脂肪间充质多功能基质细胞(AD-MMSC)收集,特征,并保存在我们之前的项目(22]。对于这个项目,他们获得的生物Almazov国家医学研究中心,培养IMF-MSC,用作控制样品在适当的地方。

2.4。分化的协议

融合的细胞没有外部刺激通常在subconfluent SM-MPC文化和作为一个可靠的指标,在那之后我们诱导骨骼肌分化。诱导分化、增殖媒体被删除,取而代之的是分化媒体这是每隔一天后再次。血清DMEM媒体补充2%的马。文化被实验的第五天,第七天感应后肌管显然是可视化。脂肪组织分化是刺激如前所述22)代替脂肪细胞的培养基诱导培养基补充1组成的介质μM胰岛素,1μ0.5 M地塞米松,μM 3-isobutyl-1-methylxanthine。分化脂肪细胞被固定和沾油红O感应后9天。

2.5。免疫细胞化学

证实了孤立的细胞的性质采用免疫染色。细胞播种到封面眼镜在4%多聚甲醛固定在4°C 10分钟然后permeabilized Triton x - 100为0.02% 5分钟。非特异性结合被孵化在15% FCS为30分钟,紧随其后的是一小时孵化与以下主要抗体:anti-MyoG(研发系统、美国),anti-MYF5(研发系统、美国),anti-vimentin(美国Sigma-Aldrich) anti-CD146(美国Sigma-Aldrich) anti-desmin (D33、Dako、丹麦),肌凝蛋白重链(MF20、MAB4470、研发系统、美国),anti-myosin(骨骼快;人类MYH1 / MYH2)(美国Sigma-Aldrich M4276) anti-myosin(骨骼缓慢;人类MYH7)(美国Sigma-Aldrich M8421)和anti-myogenin (MAB6686、研发系统、美国)。二次抗体共轭Alexa萤石546 / Alexa - 488(美国分子探针)在室温下申请45分钟。核与DAPI复染色(美国分子探针)。

2.6。流式细胞术分析

干细胞的immunophenotype评估通过流式细胞术分析进行CytoFLEX(贝克曼库尔特)。Сells resuspended在100年μL的PBS包含1%的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和孵化20分钟20°C在黑暗中使用以下单克隆抗体(Ab): anti-CD56 PC7(美国贝克曼库尔特,A21692) anti-CD146 PE(美国贝克曼库尔特,A07483) anti-CD166 PE(美国贝克曼库尔特,A22361) anti-CD73 PE(550257年美国BD Pharmingen), anti-CD105 APC(研发系统、美国、fab1097a - 100), anti-CD45 PC5(美国贝克曼库尔特,A07785) anti-PDGFRβAPC(美国BD Pharmingen FAB1263A)和anti-CD140a PE(美国BioLegend, 323506)。数据分析使用CytExpert 2.0(贝克曼库尔特)。

2.7。细胞分类

所有排序程序进行的BD FACSAria™III(美国,正欲)流式细胞分析仪使用BD FACSDiva(美国,正欲)软件。执行流校准使用Acudrop珠子(BD流式细胞仪™)与稳定后至少25分钟。喷嘴的大小是100毫米,鞘压力设定在17 psi。在排序过程中,流量被限制在< 800 /秒,以确保最小的污染事件。此外,使用一种“4路纯洁”选项,就足以获得99%纯样品。在排序之前开始,适当设置所有参数的测定。

细胞培养是沾antiCD56 PE(美国贝克曼库尔特A07788)单克隆抗体根据制造商的协议。主要细胞被发现在前方散射(FS)的对数的尺度和侧散射(SC)。根据电子控制策略执行排序。两个靶细胞的数量(分别为CD56 +和CD56 -) 15毫升猎鹰收集管包含PBS补充2%的的边后卫。

排序效率控制使用额外的分类样本的流式细胞术分析。检测纯度不低于95%。

2.8。RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,Q-PCR

序列Q-PCR补充表中可以找到引物S1。总RNA分离使用ExtractRNA试剂(Evrogen,猫。不。BC032、俄罗斯)。500 ng的总RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶MMLV RT工具包(Evrogen、SK021、俄罗斯)。的基因表达进行定量评价qPCR mix-HS SYBR +火箭(Evrogen,猫。不。PK156、俄罗斯)。Q-PCR数据给出了任意单位mRNA表达的规范化GAPDH表达和表达水平的参考样本。

2.9。统计方法

使用GraphPad棱镜7执行统计分析软件。所有的数据进行了分析与至少三个生物复制和均值±SEM。有关详细信息,请参阅图传说为每个特定的实验。

3所示。结果

3.1。病理Upregulation的基因调节发育/再生程序,在骨骼肌代谢检测心衰患者

为了检测标记HF-induced功能和代谢改变骨骼肌,表达式分析了HD - HF-derived骨骼肌活检样本标记和监管机构的发展、成熟和功能(Myf6、Myh3 Myh8, Myh1, Myh4, Myh9, Myh10, Myh7, TNNI2,和TTNC1),和能量代谢,包括基因的表达调控脂质和葡萄糖处理(Pgc1a、HIF1a GLUT1、GLUT4, aP2, PLIN2, PLIN3, PPARg, ATGL, SCD1,非政府组织CGI58, CD36, NPRA, NPRB,和NPRC)。一些来自这个面板显示显著改变的基因表达HF-derived样品(图1(一))。

我们发现表达水平之间的平衡的缓慢氧化骨骼肌纤维MHC同种型MYH7和快速糖酵解同种型MYH1特别是高频肌肉(图表达下调1 (b)表达的差别),随着对这些Pgc1a(图1 (c))表明一个障碍在转录的调控线粒体生物起源和氧化代谢在高频23]。此外,发展肌凝蛋白的表达水平,胚胎(MYH3)和新生儿(MYH8),在HF-derived大幅度调节骨骼肌活检,连同upregulation肌原性的监管因素Myf6 HF-derived样本中发现(数字1 (d)- - - - - -1 (f))可能表明慢性转向发展计划和病理刺激肌肉再生在高频24,25]。

我们也发现在高频骨骼肌的表达的改变NPRA / B-to-NPRC比率(数字1 (g)- - - - - -1(我))控制利钠肽的生物活性系统(NP)在靶组织层面26),包括控制对胰岛素的敏感性和脂质氧化能力通过Pgc1a-dependent通路(27)和心脏祖细胞增殖和分化成心肌细胞(28]。

3.2。体外扩大SM-MPC细胞的鉴定和比较不同来源的间充质多功能细胞

体外净化和扩大种群SM-MPC源自HD和高频肌肉活检证实混合表型可能会改变在体外动态扩张。细胞不同样本之间没有显著性差异,心力衰竭患者之间和HD流式细胞术分析和免疫细胞化学分析。BM-MMSC、IMF-MSC AD-MMSC被用来证明肌源性干细胞和间充质之间的相同点与不同点多功能基质细胞从其他来源。代表图像呈现在图2。

大多数SM-MPC细胞CD73 + / CD105 + / CD166 + / CD140b +,和大约30 - 40%的细胞样本中NCAM表达/ CD56,称为一个可靠的分子标记人类骨骼肌卫星细胞,成肌细胞的肌管,以及在开发过程中肌肉纤维和/或再生(29日)(图2(一个))。有趣的是,我们发现CD140b的两种不同的亚种^亮/细胞在一些样品,但是这些人群是CD56 +(图2 (b))。此外,几乎所有SM-MPC细胞证明没有CD140a表达式,只有约15%的CD146^昏暗的。明显,CD146相当大一部分^昏暗的细胞CD56 +(图2 (b))。

BM-MMSC证明,正如所料,CD73 + / CD166 + / CD140a + / CD140b + / CD146 +表型,令人惊讶的是,NCAM表达/ CD56。CD56的表达在骨骨髓来源MSC并不常见,但据报道之前在信使rna和蛋白质水平和供体特异性CD56 +分数从24 - 88.5%30.]。在我们的所有3样品实验,我们发现相当大一部分CD56 +细胞;然而,CD56的分数^明亮的样本中细胞是不到15%,而在SM-MPC样品这个分数超过30%,显示在图2(一个)。有趣的是,不像SM-MPC, BM-MMSC样品中所有CD140a + / CD140b + CD56 +细胞。

的immunophenotypes脂肪样本,IMF-MSC AD-MMSC,非常相似和差异显著的SM-MPC和BM-MMSC样本。几乎所有细胞IMF-MSC AD-MMSC样本CD56消极和表达间充质标记CD73 CD105, CD166和CD140b (PDGFRb),但他们很少或没有CD140a (PDGFRa)和CD146的表达。

疣状分析还显示coexpression肌原性的间叶细胞标记和标记的细胞在SM-MPC(图2 (c))。几乎所有细胞体外扩大;然而,没有刺激的细胞分化成细胞表达早期肌原性的调节因子Myf5 [25),和一些细胞,想必那些将进行自发的融合,表达myogenin (MYOG),调节细胞的融合和肌管的形成(25]。此外,体外扩大骨胳肌源性干细胞表达波形蛋白(图2 (c)),已知表达不仅在间质细胞(31日),但也在成肌细胞和肌管在胚胎发育的早期阶段(32,33]。细胞表达的promyogenic性质黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM或CD146)最近被证明(16),我们也有发现CD146 +人口在我们的样品(图2 (c))。同时我们Myf5和MyoG疣状为同一文化,波形蛋白染色,和这些数据结合流式细胞仪分析提供证据的间充质细胞谱系标记的coexpression肌原性的标记。

3.3。和CD56 + CD56——分数SM-MPC证明肌原性的潜力

为了确定两大亚种群SM-MPC (CD56 - / CD56 +)具有肌原性的潜力和可能因此对骨骼肌再生的维护很重要,我们使用流式细胞仪分选分离这些从SM-MPC亚种群;纯化CD56 - / CD56 +样本扩大在体外诱导分化成脂肪和肌肉组织(图3)。IMF-MSC样本作为控制。

正如我们所料,IMF-MSC样品没有回应刺激肌细胞生成,但积极分化成脂肪细胞(图3 (b))。相反,两个亚种群SM-MPC没有分化成脂肪细胞脂肪形成的刺激下但证明分化成肌管(图的能力3 (c))。融合系数略但不显著的高于CD56 +分组人口( vs )(图3 (d)),确认这两个分数的潜在意义SM-MPC肌肉再生/发展。考虑到上面提到的所有信息,我们选择使用整个无序HD - HF-derived SM-MPC细胞样本的进一步工作。

3.4。免疫组织化学分析和基因表达分析在HD -和HF-Derived SM-MPC体外分化没有揭示群体之间的差异

高清,HF-derived SM-MPC演示了一个类似的反应能力的刺激肌发生体外。我们采用免疫染色分化的早期和晚期的步骤。在诱导后第五天,观察肌管的形成和采用免疫染色法检测到的表达myogenin, CD146,波形蛋白。众所周知,波形蛋白是最丰富的中间丝蛋白在不成熟的成肌细胞/肌祖细胞。在肌肉发展的早期阶段,肌间线蛋白和波形蛋白是coexpressed。在进一步分化为成熟的肌肉细胞,肌间线蛋白是强烈的调节,而波形蛋白的表达完全停止(34]。在我们的文化中,我们发现波形蛋白在祖细胞(图2 (c)在肌管)和分化的早期步骤(图4),而肌间线蛋白表达在所有测试条件(数据检测3和4)。

为肌间线蛋白染色(图4)和MF20(数据未显示)在第五天没有演示cross-striated模式具体成熟的骨骼肌纤维(图4)。在第七天采用与MF20抗体染色,慢速和快速MyHCs证实,分化肌管演示cross-striated模式,类似于成人肌肉纤维。HD -和HF-derived细胞发达肌管都积极为慢速(MYH7)和快速(MYH1 / MYH2)肌凝蛋白,核的分数纳入myosin-positive肌管高频和HD样本之间没有显著差异(图5(一个))。融合系数HD和高频样本之间没有显著差异( vs )(图5 (b))。

标记的基因表达分析和监管机构的肌原性的分化SM-MPC源自HD和心力衰竭患者免疫组织化学结果证实:缓慢的骨骼肌纤维的表达MHC同种型MYH7和快速同种型MYH1高清之间没有显著差异,HF-derived分化肌管,和胚胎(MYH3)的表达和新生儿(MYH8)肌凝蛋白没有显著差异。肌原性的调控因子的表达Myf6, Pgc1a,心房利钠肽受体C有区别的肌管组(图之间也没有显著差异5 (c))。

4所示。讨论

心力衰竭是一种multiorgan综合症影响不同的细胞类型,包括骨骼肌。预防和治疗策略的发展在高频对肌肉萎缩疾病仍然是一个未解决的挑战,和激活骨骼肌的发育/再生程序可以考虑作为一个潜在的方法。因此,骨骼肌祖细胞的激活将有利于骨骼肌结构和性能的恢复。在这项工作中,我们旨在确定HF-induced骨骼肌病变影响SM-MPC发展/再生潜力。

我们发现许多慢性失调骨骼肌组织从我们的病人。最重要的一个是慢性激活的发展计划:mRNA的表达MYH3 / MYH8肌球蛋白和肌原性的调节因子Myf6检测HF-derived活检。这些改变结合慢/快纤维成分的变化可能严重影响骨骼肌代谢、结构和性能。我们建议在高频再生过程是刺激响应HF-induced伤害:骨骼肌祖细胞进展成功通过活化,增殖,分化成肌细胞,并融合步骤;然而,而不是推进纤维成熟阶段,他们会“粘”在发展阶段可能是由于慢性代谢改变观察高频骨骼肌。的reexpression发育成人骨骼肌肌凝蛋白检测在不同病理条件,包括肌肉变性/再生,如创伤、慢性去神经、肌肉萎缩症,和不同类型的肌肉疾病(了24]);然而,据我们所知没有一个是高频之前报道。

从氧化纤维素I型转变为糖酵解纤维II型和减少氧化酶活性是最好描述HF-induced在骨骼肌代谢改变3,5,8,35,36]。我们还检测到表达的转变比率在骨骼肌纤维I型和II型纤维从心力衰竭患者中,表达的差别以及对这些Pgc1a(图1),这是一个重要的中介在骨骼肌线粒体代谢的特性,表达下调在各种类型的肌肉萎缩37与高频(包括大鼠的骨骼肌38- - - - - -41]。此外,心力衰竭是一种慢性激活状态的肾上腺素能和NP系统,除了他们的记录在心血管系统中的作用有利于脂肪氧化能力中也扮演了重要的角色在人类骨骼肌细胞(42通过cGMP的激活信号,诱导PGC1a,增强线粒体呼吸(27]。还有最近的数据显示,NP系统参与调节通过NPR-A心脏祖细胞增殖和分化成心肌细胞通过NPR-B [28会导致心脏发育和再生。开关从NPR-A / B表达平衡NPRC中发现我们的工作表明增加NP系统活动(9),也可能影响upregulation高频骨骼肌的发育信号。在一起,我们发现许多HF-derived骨骼肌的改变会影响发育,代谢、结构和功能属性的骨骼肌。

接下来,我们纯化SM-MPC HD - HF-derived活组织检查和调查如果HF-derived细胞的功能性质受到这些变化的影响。我们隔绝的SM-MPC HD和心力衰竭患者的骨骼肌活检样本代表一个混合的细胞表达间充质和肌原性的标记。流式细胞仪分析(数据样本的特征2(一个)- - - - - -2 (c))和免疫细胞化学(图2 (c)),他们还追究区分体外(图的能力3)。为了更好地评价肌肉的肌原性的潜能祖细胞来源于HD和高频科目根据获得的结果,我们得出使用整个未分类的样本在分化实验为了留住文化亚种群可能有助于刺激体外肌发生通过旁分泌信号机制和/或直接和信息交互。

事实上,有很多证据在文献中描述不同的亚种的骨骼肌祖细胞支持骨骼肌肉发展,增长,再生(了13])。最好的特点是肌原性的祖细胞在出生后肌肉卫星细胞被激活在损伤或刺激增长,然后开始成肌细胞的增殖并生成一个池能够融合到新形成的肌纤维。CD56被认为是最可靠的卫星细胞表面标记(38]。然而,人类卫星细胞不容易分离,净化,并扩大在文化:大部分研究卫星细胞在老鼠身上进行,但不是人类16]。此外,近年来报道的肌原性的细胞不同于卫星细胞积累了,也并不是所有的这些细胞CD56 +。例如,PW1 + / Pax7 -间质细胞不表达CD56(图片)但证明双电位的行为在体外,生成光滑和骨骼肌,分离和特征17];coexpression间充质(CD90、CD73 CD166和CD105)和肌原性的报道(CD56)标记在几个细胞群与肌原性的潜在包括人类胚胎中胚层祖细胞(43),体外肌源性扩张主要文化(14,肌原性的间叶细胞祖细胞来源于他和iPSC [29日]。也表明皮下(壁画)培养CD146 +细胞(也称为“间充质干细胞”)纯化不同组骨骼肌能够自发地产生肌管体外和体内肌原纤维,和CD146的表达CD56互斥在不同的细胞肌原性的子集,没有coexpression [16]。重要的是,在这本书中作者报告说,排序和培养CD146 +人类肌源性细胞逐渐打开的表情肌原性的标记PAX7 PAX3, Myf5、CD56、肌间线蛋白,和MyHC他们验证了荧光免疫细胞化学(16]。最后,在一些协议CD146建议积极的选择标记在细胞分类获得人类胎儿成肌细胞的人口(44]。在一起,这些先前的发现支持观察我们的工作。首先,在扩大体外贴壁细胞纯化从腓肠肌肌肉活检我们还发现大量的亚种群coexpress间充质细胞和肌原性的标记(图2)。其次,我们发现不仅排序CD56 +还演示排序CD56 -群肌原性的潜在的(图3)。由于有限数量的样品,我们不能监控标志的动力学表达式在体外扩大排序CD56 + / CD56——人口;不过,我们可以推测,CD56 -族群的肌原性的潜力可以CD146 +分组人口相关的细胞,这些细胞可以打开的表情肌原性的标记在扩张的过程中所描述的Persichini et al。16]。在数据的数据2和3支持这个设想很好:coexpression CD146和CD56某些亚种群的扩大体外SM-MPC(数字2(一个)和2 (c))和coexpression肌原性的调节因子myogenin (MyoG) CD146肌原性的分化的早期步骤(图3)确认CD146的重要性+ SM-MPC分数为肌原性的分化。

同时,作为显示在图3,两个主要的分数SM-MPC (CD56 + / CD56)演示了一个类似的能力向脂肪细胞分化成肌管但不是。这是一个重要的观察:骨骼肌脂质代谢失调的心力衰竭患者是一种很好的描述代谢障碍(9,脂肪变性骨骼肌通常与代谢失调有关的45,46]。在我们的实验中,无论是高清还是HF-derived SM-MPC证明体外脂肪形成的潜力。我们的数据适合描述的观察Uezumi et al。45)表明,只有CD140a +显示有效的脂肪形成的间叶细胞祖细胞的肌源性细胞分化在体外和体内。在我们的工作中,SM-MPC证明CD140a -表型。有趣的是,这两种脂肪tissue-derived AD-MMSC IMF-MSC,但不是BM-MMSC样本分化成脂肪细胞(图2,我们之前的数据22]),展示了一种CD140a -表型。

有趣的是,我们发现肌管的形成不仅对规范分化条件马血清(2%),但即使在脂肪形成的刺激(数据未显示)。类似的观察是以前被别人:肌发生在骨肌源性祖细胞脂肪形成的刺激被Persichini et al .(前面提到的16和Uezumi et al。45];然而,这些数据并没有得到太多的关注,值得进一步研究。在一起,这些观察让我们得出这样的结论:SM-MSC样品纯化HD -和HF-derived骨骼肌受到限制/致力于肌原性的分化,一般来说,不健康的捐赠者和心脏衰竭患者之间的差异。

5。结论

在目前的工作中,我们证明我们检测到的代谢和功能改变骨骼肌心力衰竭患者不显著影响净化的功能性质和扩大体外骨骼肌间叶细胞祖细胞(SM-MPC)。

这些发现使我们能够推测,骨骼肌祖细胞是很好保护他们的利基HF-induced代谢压力,他们可以在有利的情况下,导致受损肌肉恢复,预防和治疗肌肉萎缩;背后的确切机制改变肌肉在高频再生项目仍有待调查,和潜在的新治疗策略HF-induced骨骼肌浪费都应针对激活骨骼肌干细胞再生潜力,改善骨骼肌代谢状态为了提供一个有利的环境SM-MPC-driven改善肌肉结构和性能。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

位于美国罗德岛州Dmitrieva,Lelyavina T.A., Komarova M.Y., Ivanova O.A., Galenko V.L., Tikanova P.O., Khromova N.V., Golovkin A.S., Bortsova M.A., Sergushichev A., Sitnikova M.Yu., and Kostareva A.A. declare that they have no conflict of interest.

确认

细胞分选实验进行FACSAria III细胞分选仪(Becton, Dickinson和公司、美国)研究资源中心“分子和细胞技术”,圣彼得堡州立大学;http://www.biomed.spbu.ru/en/。工作是由俄罗斯科学基金会# 16-15-10178 (RD)。

补充材料

表S1:列表中使用的引物Q-PCR实验。从高清演示图S1: SM-MPC一致的响应在immunophenotypes刺激肌原性的差异和相似之处。上面板:immunocytological可视化HD-derived分化肌管的样品:肌管是彩色MyHC表达的抗体识别肌凝蛋白重链的二世(MF20)。核与DAPI标记(蓝色)。较低的面板:柱状图展示的表面标记流式细胞仪分析结果SM-MPC来自高清。(补充材料)

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