细胞来源的影响,供体年龄Tenogenic潜力和人类间充质基质细胞的趋化因子的分泌

文摘

背景。细胞治疗提出了病变的治疗。(骨髓)- BM-MSC和脂肪组织——(ASC)派生间充质基质细胞是候选人数量等治疗。研究的第一个目的是比较人类BM-MSCs和对asc基底的表达tenogenesis以及趋化作用的相关因素。额外的目标是评估如果供体年龄影响这些特性。方法。细胞被隔绝24人类的捐助者,每组8:hASC hBM-MSC Y ( ),和hBM-MSC ( )。微阵列分析法进行RNA隔绝hASC hBM-MSC细胞。基于微阵列的结果,8个因素被选作进一步评估。另外两个基因被包含在分析:SCLERAXIS和PPARγ。这10个因素都存在检测基因表达的方法,和所有除了RUNX2的另外评估蛋白表达和分泌。结果。微阵列分析显示超过1400个基因表达明显不同与hASC hBM-MSC组。8这些基因被选作进一步分析:CXCL6,CXCL12,CXCL16,TGF-β2,SMAD3,胶原蛋白14 a1,莫霍克,RUNX2。在随后的分析中存在,hBM-MSCs显示表达显著高于hASCs在基因:CXCL12,CXCL16,TGF-β2,SMAD3,胶原蛋白14 a1,SCLERAXIS( ,不管BM供体年龄)。在的情况下CXCL12,hASC和hBM-MSC之间的区别是很有意义的只有对年轻BM捐赠者,而为胶原蛋白14 a1只有老BM捐助者。PPARγ显示表达式相比,hASCs hBM-MSCs更高。关于CXCL6,莫霍克,RUNX2基因表达,观察组之间没有显著差异。结论。在细胞病变的治疗,骨髓似乎是一个更有吸引力的msc比脂肪组织来源。细胞捐赠者的年龄比细胞来源似乎不那么重要,虽然老捐赠者的细胞显示基底tenogenic潜力略高于细胞从年轻的捐助者。

1。介绍

细胞疗法目前被认为是作为替代或支持性治疗病变的病例。相信一些细胞类型管理区域的损伤可以直接分化成tenocytes或刺激当地内源性修复机制。有几个候选人数量为这样一个过程。最重要的是tendon-derived细胞,骨骨髓来源间充质基质细胞(干细胞)(BM-MSCs)和脂肪间充质基质细胞(干细胞)(AD-MSCs或对asc) (1]。Tendon-derived细胞拥有tenogenic潜力最大的这些人群(2),但人体肌腱组织隔离程序的可用性是有限的。相比之下,对asc BM-MSCs和自体移植可以相对容易地孤立,而且他们适用于同种异体转移(3,4]。一些临床前研究表明,注射msc肌腱受伤改进它的治疗(1]。首先来自临床试验的数据表明,同种异体MSC移植到影响肌腱是一个安全的程序,可以有有益的临床疗效5]。至少有两个提议的行动机制的msc可以在病变的行为。一个概念说,msc可以支持肌腱再生通过直接分化。的确,这是表明对asc BM-MSCs和在某些情况下可以进入tenogenic通路在体外(6,7]。直接分化的概念最近支持的一项研究,人类AD-MSCs被移植到大鼠肌腱受伤。移植细胞存活了至少4周,生产tendon-associated蛋白质和蛋白聚糖这表明tenogenic分化(8]。尽管BM-MSCs和属于MSC家庭也有某些差异这两个细胞群(9,10]。它显示在大鼠骨骨髓来源的细胞msc tenogenic潜在拥有高于脂肪msc。类似的比较没有以前公布的人类细胞。因此,本研究的主要目的是比较人类BM-MSCs和对asc的基底tenogenic活动在细胞病变的治疗提供潜在的线索。

第二个假设msc移植后的行动机制是基于旁分泌活动(11]。这个活动是由分泌的细胞因子,生长因子,趋化因子(9]。相信本地管理的msc可以提高招聘的内生祖细胞,以这种方式提高再生受伤的网站。同样,招募巨噬细胞可以是有益的,因为它是已知的,M2巨噬细胞对组织修复至关重要12]。此外,msc被证明驱动分化的巨噬细胞有益的表型(13]。它曾表明,生长因子的分泌,细胞因子,金属蛋白酶可以根据不同msc的来源(14,15]。然而,msc对趋化因子生产的起源的影响研究较少。因此,我们旨在分析来自不同来源的msc趋化现象的活动。

MSC领域的另一个未解决的问题担忧供体年龄在细胞特性的影响。msc可以自体或同种异体移植的方式(16]。尽管有越来越多的同种异体MSC传输的数据量是安全的(3,17)、自体治疗仍被认为是最安全的一种移植。然而,在老年患者,问题出现老化的细胞特性的影响(18]。因此,额外的本研究的目的是评估的影响供体年龄tenogenic标记表达式和趋化因子的分泌。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离

2.1.1。人类骨髓间充质基质细胞(hBM-MSCs)

骨髓样本来自16个病人在收到他们的书面同意。所有BM捐助者的平均年龄是51年。过程是经当地生物伦理学委员会批准(批准文号:KB / 130/2013)。骨髓中收集标准整形手术所需的骨髓腔。骨髓MSC的协议隔离之前由我们组(详细描述19]。细胞培养在标准生长培养基(GM)由杜尔贝科修改鹰的介质与低葡萄糖(DMEM-LG Sigma-Aldrich)补充15%胎牛血清(的边后卫,LONZA)和1.5% ( )antibiotic-antimycotic解决方案(penicillin-streptomycin-amphotericin B;英杰公司)BD Primaria™文化菜(正)。2天之后,通用汽车是补充,另一个2天后,不依从被移除和第一纤维母细胞贴壁细胞可以观察到。

2.1.2。人类脂肪干细胞(hASCs)

对asc来自8个健康的捐赠者被Pojda Z教授请提供。,Department of Regenerative Medicine, Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Center, and Institute of Oncology. Adipose tissue was collected from healthy donors by liposuction. The samples were used in research after receiving patients’ informed consent. The protocol of human adipose tissue stem cell isolation as well as identification was previously described in detail by our group [6]。

期间的文化细胞types-hBM-MSCs hASCs-the生长介质是改变每2 - 3天,冲洗之前与PBS。通过达到subconfluence后。通过3后,细胞通过流式细胞术和multilineage分化能力。

2.2。细胞识别

2.2.1。在体外成骨分化

细胞培养在hMSC成骨分化BulletKit™中(Lonza) 3周。成骨分化被识别的特征矿物口供与茜素红染色的细胞外基质(Sigma-Aldrich)和可视化标准光学显微镜。另外,碱性磷酸酶的活性是评价使用半定量的比色方法。碱性磷酸酶液体基质试验(Sigma-Aldrich P7998)使用。在实验结束时,细胞分化和控制处理0.2% Triton x - 100在PBS为20分钟。溶菌产物,离心后,结合反应底物,在RT孵化长达30分钟,在405 nm根据制造商的指示。

2.2.2。在体外脂肪形成的分化

细胞培养在hMSC脂肪形成的差异化BulletKit™介质(Lonza)为3周。去评估使用油红O染色(Sigma-Aldrich)作为细胞内脂质积累的指标和可视化标准光学显微镜。此外,在代表细胞群(两个hASC人口和四个BM-MSC人口,两个从捐赠者和两个年轻的捐助者),脂肪形成的分化的影响PPARγ基因表达是评估使用rt - pcr方法(下面详细描述)。

2.2.3。在体外Chondrogenic分化

诱导chondrogenic分化、三维颗粒文化。Unsuspended细胞颗粒chondrogenic 19天的培养基培养由DMEM high-glucose (LONZA)中补充1%的边后卫,1% ( )+补充,0.1μM地塞米松,抗坏血酸2-phosphate 0.1毫米,100μg / mL丙酮酸钠,10 ng / mL重组人类转化生长因子-β2和1% ( )penicillin-streptomycin解决方案。组织学分析,颗粒沉浸在石蜡,分段,沾着马森三色的或甲苯胺蓝法。

2.2.4。流式细胞术分析

乙肝表面抗原的脂肪和骨头来源于MSC在第三段的特点是使用人类MSC流式细胞术分析工具包(BD生物科学)。的存在细胞CD73 CD90、CD105和CD44和缺乏CD34、CD45、CD11b, CD19和HLA-DR评估。染色是按照制造商的指示执行。染色细胞进行了分析使用BD FACSCanto II(正)。进行分析,BD FACSDiva软件使用,使用相同的设置对所有测试数量。

2.3。研究设计

材料分为3组:实验

hASC-cells捐助者的未知的时代,

从捐赠者hBM-MSC Y-cells 45岁(平均年龄38.1;平均年龄38.0),

hBM-MSC单元格从捐赠者超过45岁(平均年龄64.4;平均年龄64.5),

微阵列分析进行RNA源自hASC hBM-MSC组。从基因表达分析组之间差异显著,几个被选作进一步分析。在这个阶段,细胞年轻BM-MSC捐助者被添加到研究(hBM-MSC Y组)。对所有分析,细胞从4日到6日通过。实验一直是进行细胞分别从每个捐赠者。细胞从不同的捐赠者没有集中在这项研究中,使检测个人间的差异。细胞总是培养集包括1 hASC人口,人口1 hBM-MSC Y,和1 hBM-MSC人口避免变异性的分析条件。

2.4。RNA隔离

总RNA进行隔离使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。至少 细胞被用于这个过程。RNA浓度和纯度进行评估通过分光光度计在260海里使用NanoDrop (nd - 1000分光光度计,NanoDrop技术Inc .)。

2.5。微阵列分析

微阵列表达分析都使用了Affymetrix GeneAtlas系统根据制造商的指示。10 ng的总RNA,通过初步质量控制屏幕(2100生物分析仪,安捷伦)当时处理使用GeneChip™WT Pico装备,专门处理少量的输入RNA, Affymetrix提供的标准协议。样本的杂化GeneChip™人类基因第2.1位数组地带(Affymetrix)。

微阵列进行扫描,Affymetrix GeneAtlas扫描仪,和强度信号每个探测器的设置是Affymetrix软件到玻璃纸文件写的。玻璃纸文件导入到Partek基因组学套件v 6.6软件使用RMA(健壮Multiarray平均)。在这一步中,背景校正应用基于全球分布的点(完美)探针强度和亲和力的探针(基于序列)计算。进一步,探针强度quantile-normalized [20.]和log2转变,中位数波兰总结每个探针集应用。定性分析,例如,主成分分析,以识别异常值和工件的微阵列。质量检查后,双向方差分析(方差分析)模型,利用矩量法(21)是应用于数据,允许创建列表之间的显著差异表达基因和生物变异(截止值:值< 0.05; )。

2.6。实时qPCR分析

具体TaqMan®基因表达分析从应用生物系统公司购买:莫霍克同源框(类似MKX)Hs00543190_m1 scleraxis (SCX)Hs03054634_g1十四α1型胶原COL14A1)Hs00964045_m1转化生长因子β2 (TGF-β2)Hs00234244_m1 SMAD家庭成员3 (SMAD3)Hs00969210_m1 Runt-related转录因子2 (RUNX2)Hs01047973_m1、过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARG趋化因子配体)Hs00234592_m1 C-X-C图案6 (CXCL616)Hs00605742_g1 C-X-C主题趋化因子配体(CXCL16趋化因子配体)Hs00222859_m1, C-X-C图案12 (CXCL12)Hs03676656_mH。人类GUSB用于规范化。实时PCR进行ABI 7500序列检测系统使用棱镜TaqMan®RNA-to-C_T™互译工具包(应用生物系统公司)。每个样本重复进行了分析。相对基因表达被2计算^−ΔΔCt方法。结果提出了折叠的基因表达变化

hBM-MSC Y和hBM-MSC,参考点在hASCs表达式

hBM-MSC,参考点的表达hBM-MSC Y

ΔCt值的统计分析是由比较使用独立测试样本(hASCs比hBM-MSC Y或和hBM-MSC Y和hBM-MSC)。

2.7。分泌的分析

细胞被播种在12-well盘子。达到subconfluence后,生长介质改为DMEM + 3.5% BSA 48小时。这一次后,收集上清液,离心(沉积物可能包含细胞碎片被丢弃),整除,冻结在−80°C。收集上清液后,细胞分离和计数使规范化的分泌细胞的数量。上层清液被用来评估选择的分泌因素:CXCL6, CXCL12和CXCL16决定使用Bio-Plex Pro人类趋化因子分析(Bio-Rad实验室Inc .)和TGF -β2使用酶联免疫试剂盒(研发系统®)根据制造商的指示。

2.8。免疫印迹(WB)

收集细胞颗粒对asc人力BM-MSCs和细胞溶解了里帕缓冲区(Sigma-Aldrich)补充鸡尾酒的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)。蛋白质的提取进行了30分钟在4°C。接下来,溶解产物清除了20分钟在14000 rpm,和上层的收集。总蛋白浓度是决定使用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂(Bio-Rad实验室Inc .)根据制造商的指示。蛋白质(40µ克每)解决了总蛋白质sds - page和转移到PVDF膜(微孔)。疣状,膜被封锁TBS脱脂奶粉5%(20毫米Tris-HCl, 500毫米氯化钠)含0.1%渐变20。膜与兔多克隆anti-COL14A1孵化(Abcam ab101464 1: 500),兔多克隆anti-MOHAWK (LSBio aa46 - 75 1: 1000),兔多克隆anti-SMAD3 (Abcam ab28379 1: 1000), anti-SCLERAXIS (pa5 - 23943热费希尔,1:1000),和鼠标单克隆抗-β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术sc47778 1: 1000)主要抗体。接下来,这些墨迹洗了三次TBST和孵化与适当的二次抗体结合红外荧光团:680 IRDye或800 IRDye (LI-COR生物科学)1:5000稀释。奥德赛红外成像系统(LI-COR生物科学)被用来分析相关蛋白表达。集成光密度(IOD)的量化目标蛋白质IOD的规范化β肌动蛋白和执行奥德赛的使用分析软件(LI-COR生物科学)。免疫印迹分析从每个细胞捐赠了一式三份。出版的目的,彩色免疫印迹图像转换成黑白图像在《奥德赛》软件。

2.9。迁移分析

分析人口的能力来刺激其他细胞的定向迁移研究了用细胞培养插入8μ格林尼m孔隙大小(ThinCert™)。试验的目的是为了模拟循环或当地内生间充质细胞的招募。细胞从4个不同BM-MSC人口集中和沾染了红色荧光染料DilC18 (5) - ds(做)(1 1 - - - - - -dioctadecyl-3 3 3 -tetrametlylindodicarbocyanine-5 5-disulfonic酸), , (AAT Bioquest)。该池构成迁移人口在这个实验中,在所有探测器都是一样的。约 这些标记细胞被播种在每个插入。基底室,要么是没有细胞(如果迁移,控制)或无标号hASCs hBM-MSCs Y,或hBM-MSCs播种浓度 /在24-well底板。每个人口被播种在重复。细胞在37°C和5%孵化有限公司₂在接下来的48小时,允许细胞迁移从插入到基底隔间。之后,插入被移除,细胞对井的底部固定有4%多聚甲醛(10分钟,RT)和细胞核可视化与DAPI染色(20 ng / mL的DAPI解决方案4分钟,RT)。此外,细胞迁移使胰蛋白酶化从底部插入,他们被允许附加在一夜之间,他们也固定并与DAPI染色。细胞被可视化和成像阅读器Cytation™1 (BioTek)和计算Gene5软件(图3.04S1)。迁移/刺激细胞的数量计算来自25个不同领域的观点在每个样本。迁移细胞构成的和那些从井底实验期间的插入和持续时间(DIDf)和那些脱离底部插入(既)和附加的实验结束后就完成了。字段的观点有相同的位置在所有井和之前任意选择分析。随着刺激细胞数量的不同的实验在不同的细胞群之间,最后分析我们选择那些刺激细胞的数量的人口(后自动计算)是最类似的(一个人口从每个细胞类型)。两个不同的分析。首先,迁移细胞的数量为每个类型的刺激与控制(如果迁移)。的总和DIDf和经久不衰被分析。第二,刺激细胞相互之间的比较。我们将这个参数称为“刺激的潜力。” For this analysis, the ratio of migrating cell (with red fluorescence, FigureS1A”)数量刺激细胞数量(无标号,图S1A”)是按照下面的公式计算。 在哪里

DIDf-the迁移细胞的数量(沾了),从插入

DIDins-the迁移细胞的数量(彩色)脱离底部的插入

DAPI-the细胞核的数量(与DAPI染色)。刺激细胞的细胞核和DIDf细胞数。

2.10。统计分析

进行数据分析,STATISTICA软件(StatSoft®波兰)使用。数据了 或 。学生组之间的差异进行了分析 - - - - - -测试或Mann-Whitney测试根据数据分布分析组。验证假说的特征正态分布分析人口使用Shapiro-Wilk测试执行每个分析组的数据。方差同质性的假说是使用列文的试验来验证。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。分离和鉴定

细胞已经成功地分离出24捐助者(8捐助者为每个组)。细胞表现出附着性能和能力形成的殖民地和区分adipo,骨的,和chondrogenic通路(图1)。细胞从骨髓分离似乎更容易分化成成骨的血统比细胞从脂肪组织分离(图1(a))。相反的趋势是观察到的关于脂肪形成的分化(图1(b))。流式细胞术分析证实CD90的表达(中位数为100%,98%,和98.9%的阳性细胞在hASCs hBM-MSC Y,和hBM-MSC,分别),CD44(中位数为99.5%,99.3%,和99%的阳性细胞在hASCs BM-MSC Y,和BM-MSC,分别),CD105(中位数为100%,98.9%,和98.7%的阳性细胞在hASCs BM-MSC Y,和BM-MSC,分别),和CD73(中位数为99.5%,99.7%,和99.6%的阳性细胞在hASCs BM-MSC Y,和BM-MSC,分别)。

3.2。微阵列分析

微阵列分析显示超过1400个基因表达明显不同与hASCs hBM-MSCs a .图中展示了这些基因的列表S2在补充材料(可用在这里)。我们特别感兴趣的基因与tenogenesis和趋化作用有关。tenogenesis-associated基因表达明显不同的团体包括分析TGF-β2(4.5倍差异表达),COL14A1(3.9倍),SMAD3(2.9倍),LUMICAN(2.3倍),生长分化因子5(2.08倍),类似MKX(1.96倍),COL6(1.96倍),DECORIN(1.8倍),纤维母细胞生长因子(FGF)受体1(1.89倍),FGF9(1.6倍),弹性蛋白(1.5倍)FGF10(1.5倍)(排名根据褶皱变化差异)。所有这些基因除了FGF9显示更高的表达对asc BM-MSCs比。关于chemotaxis-there 7趋化因子有显著差异表达分析组:CXCL16(10倍差异表达),CXCL6(5倍),CXCL12(3.6倍),CCL2(3.5倍),CXCL8(2.8倍),处于受控(2.5倍)亚兰(2倍)——它们的显示表达式对asc BM-MSCs比更高。从数据库获得的8与领域相关的因素上面提到的选择进行进一步分析。有3 tenogenesis-associated基因最高的褶皱变化表达式基于微阵列:TGF-β2,COL14A1,SMAD3。这一组,类似MKX添加关键tenogenic转录因子之一。接下来,有3基因编码趋化因子与最高的褶皱变化表达式基于微阵列:CXCL16,CXCL6,CXCL12。这个列表,我们补充道RUNX2(1.9倍的区别),我们旨在评估的活动竞争成骨的途径。另外两个基因被包含在分析:SCX和PPARγ。这使得测试在不同的方向:(1)趋化性相关的基因和细胞招聘(CXCL6,CXCL16,CXCL12)(2)相关基因tenogenic分化潜力(类似MKX,COL14A1,TGF-β2,SMAD3,SCX)(3)转录因子与成骨的竞争和脂肪形成的途径(RUNX2,PPARγ)

3.3。细胞迁移,细胞间相互作用的影响

在中存在的分析中,细胞从骨髓分离显示显著的高表达CXCL16( )比hASCs。的褶皱变化CXCL1611.42 (hBM-MSC Y)和8.86 (hBM-MSC)相比 (图2)。一致性的结果被发现不管hBM-MSCs捐赠者的年龄。分泌的研究证实了基因表达的结果研究-CXCL16大大减少分泌hASCs比hBM-MSCs(献血者的年龄是可以忽略不计)(图3)。相比之下,的水平CXCL12表达明显不同只有hASCs和BM-MSCs之间从年轻的捐助者( )而不是hASC与hBM-MSC a。此外,也显示出了显著性差异CXCL12从hBM-MSC根据捐赠者的年龄( )(图2)。然而,在CXCL12分泌的情况下,hBM-MSC Y和hBM-MSC组之间的差异可以忽略不计(图3)。关于CXCL6基因表达,发现没有明显的统计学差异分析的内容(骨髓和脂肪,年轻比年龄)的基因表达分析(图2)以及分泌(图3)。

3.4。的起源细胞影响的表达式/分泌Tenogenesis的相关因素

的表达TGF-β2和SMAD3基因在hBM-MSCs显著高于hASCs不论BM-MSCs的供体的年龄。计算折叠变化TGF-β2为5.67 (hBM-MSC Y参照hASC, )和6.73 (hBM-MSC Y和hASC, )。为SMAD3,折叠变化是2.01 (hBM-MSC Y比hASC)和1.77 (hBM-MSC Y比hASC)的意义 和 ,分别(图4)。的蛋白表达分析SMAD3证实这些结果。免疫印迹分析表明,SMAD3 hASCs表达显著低于在hBM-MSCs Y ( )和hBM-MSC ( ),和捐助者的年龄是无关紧要的(图5)。TGF -的差异β2分泌显著只有hASC vs hBM-MSC一组( )(图5)。BM-MSCs显示显著的高表达SCX与比hASCs tenogenesis ( Y和团体,褶皱变化1.89和1.94,分别),也不取决于年龄的骨髓捐赠者(图4)。相比之下,另一个重要的转录因子,tenogenesis -类似MKX在两组之间并没有显著差异基因表达(图4(图)和蛋白质水平5)。更高的表达COL14A1已经证明在hBM-MSCs ( ,褶皱变化8.31)比细胞来源于脂肪组织(图4)。在的情况下COL14A1,尽管获得的褶皱变化为3.81,hASC和hBM-MSC Y之间的表达差异没有统计学意义。同样的,对COL14A1没有明显差异有关骨髓供体的年龄。在蛋白质水平,没有hBM-MSC Y和hASCs(图之间的区别5)。统计上显著的增加是hBM-MSC实现一组相比hASCs ( )。此外,蛋白表达的一个显著差异是观察到的COL14A1 hBM-MSC根据捐赠者的年龄和高hBM-MSC一组( )(图5)。

3.5。表达的细胞起源的影响因素与骨生成和脂肪生成

PPARG表达显著低于hBM-MSC Y和hBM-MSC比hASCs(0.43折变化, ,0.44和褶皱变化, ,分别)与骨髓组织(图之间没有差异6)。虽然表达的意思RUNX2hBM-MSC高1.96 - 1.68倍(分别为Y和)hASCs相比,没有明显的差异RUNX2群体之间的表达式(图6)。

3.6。细胞的起源的影响BM-MSCs定向迁移

我们的功能分析表明,msc不管细胞起源高度显著刺激BM-MSC的迁移。迁移的平均数BM-MSCs的刺激细胞的存在增加了2.9倍,3.2倍和3.1倍(ASC, BM-MSC Y, BM-MSC,分别)与如果控制( 对所有群体,图7(一))。额外的分析考虑的差异刺激细胞的数量计算的实验提出了“材料和方法”。至少1400的从每个细胞类型包括细胞迁移到这种分析。它表明,刺激潜在的关于BM-MSCs BM-MSC来自年轻的捐助者高出了34.7%和28.2%的潜力ASC和BM-MSC,分别为( 在这两种情况下)。潜在的ASC和BM-MSC没有显著差异。

4所示。讨论

间充质基质细胞正在测试治疗各种疾病(https://clinicaltrials.gov)。尽管数量壮观的研究已经进行了msc,仍有许多问题有待阐明。间充质基质细胞分离出不同的组织分享一般特征,这使分类msc。然而,有越来越多的数据表明msc的来源问题的详细特征(14,22,23]。因此,它似乎是非常重要的在不同的MSC类型进行比较研究以评估他们的效用为特定的临床应用。在目前的研究中,主要目标是比较人类BM-MSCs和对asc的潜在效用细胞病变的治疗。当然,很少有机会复制的正常(产前)模式腱形成由细胞治疗考虑到基因负责tenogenesis涉及至少400规范的途径24]。细胞移植在肌腱损伤的目的是支持自然,而是不完美的肌腱愈合和获得与高阻re-injury功能结构。以前,msc孤立的tenogenic潜力来自不同来源的研究只有在动物细胞(6,7,25]。本研究进行的计划和评价人类msc三步协议包括微阵列分析,使用rt - pcr基因表达水平的评估,最后评估的蛋白质产品表达或分泌(取决于特定的蛋白质功能)。这种研究设计提供高质量的数据。此外,我们使用细胞从24个独立的捐助者( 每组),另外增加了结果的可靠性。在我们比较分析hASCs hBM-MSCs,超过1400个基因表现出明显不同的表情。它占所有的2.6%分析记录。这是一个有意义的基因,特别是考虑到个别间msc的多样性。从这一大群基因,几个被选择进行进一步分析。我们特别感兴趣的基因与tenogenesis和趋化性有关。

肌腱组织胶原蛋白的关键组件类型即其他胶原蛋白与tenogenesis相关胶原蛋白类型III, V, VI,十二、十四26]。我们比较微阵列分析表明,只显示其中一个胶原蛋白表达hBM-MSCs和hASCs明显不同。这是COL14A1,这显示出比hASCs表达式hBM-MSCs高出3.9倍。在另一个工作,Col14也被证明是高度调节在tenogenic马BM-MSCs培养条件(27]。作者表明,增加Col14表达BM-MSC Wnt /β连环蛋白通路。激活这种类型的信号增加也与tenogenesis相关的其他基因的表达:tenomodulin,decorin,fibromodulin。胶原蛋白I型的形成和类型十四是依赖的表达Scleraxis(28]。我们的研究结果表明,BM-MSCs显示基底的表达显著升高SCLERAXIS,这是在蛋白质水平上证实BM-MSC一组。这种转录因子是极度参与胚胎肌腱发展和扮演关键的角色向tenocyte msc分化的命运的决心29日]。此外,缺乏Scleraxis导致分泌的增加袜9和促进软骨形成路径28]。因此,我们的研究结果表明,骨髓来源的人类骨髓msc对asc tenogenic潜在拥有高于。类似的结论以前从研究老鼠,老鼠,或者马msc (7,30.,31日]。在马,实验也表明,BM-MSC移植到受伤的肌腱移植提供了一个更好的结果比类似的ASC [32]。可能因此,骨髓可以更理想的MSC来源的潜在治疗肌腱损伤也在人类患者。戴et al。7)表明,老鼠BM-MSCs明显高于基底的表达Scleraxis和胶原蛋白我脂肪组织相比msc和BM-MSCs显示更明显回应tenogenic BMP-12比对asc治疗。此外,BMP-12-treated hASCs显示低Scleraxis表达式比未经处理的BM-MSCs [7]。我们组在早前的研究(6),人类对asc的感应BMP-12 100 ng / mL的言论导致7天2.05折的变化SCLERAXIS。在目前的研究中,我们表明,基线的表达SCLERAXIS几乎2倍hBM-MSCs比hASCs。这些结果综合表明,活动hASCs tenogenic通路的治疗7天后可以比得上一个参与hBM-MSCs。我们组曾表明,诱导tenogenesis TGF -通过使用多效性的因素β家庭可能会影响其他msc的特性与移植后细胞的命运。BMP-12的使用造成了障碍治疗的免疫调节特性的msc及影响il - 6的分泌VEGF,这些细胞(6]。因此,一个有趣的替代使用在体外predifferentiated细胞移植是使用细胞最初更有利的特性在一个给定的应用程序。一个更先进的方法可以根据结果提出的侯et al。33]。他们证明BM-MSCs内,有一个分组人口生理表达高水平的tenomodulin(Tnmd)。作者推测,选择自然tenogenic族群比使用tenogenic BM-MSCs可能是一个更好的解决方案在体外移植前预处理。实际上,这些细胞更容易tenogenic感应并显示表达的增加tenogenic factors-BMP-12和比BM-MSCs BMP-13正常Tnmd表达式。此外,细胞高表达Tnmd拥有一个调节TGF -β信号通路。TGF -β/ SMAD2/3和ERK MAPK信号通路对肌腱的形成似乎是至关重要的(24]。研究老鼠,老鼠,和小鸡表明TGF -β1、2和3有正向且显著的影响在肌腱tenogenic分化干细胞/祖细胞,ADSCs,羊水干细胞(24,34,35]。补充TGF -β增加了Scleraxis,胶原蛋白我,莫霍克在这些细胞中表达。此外,TGF -β促进了tenogenesis通路,减少Sox9表达式,它是一个软骨形成标记(24]。这很重要,因为交叉信号通路和许多协作因素参与腱形成,激活的风险有一个不受欢迎的路径在体外细胞治疗。在我们的研究中,水平的TGF -β2骨骨髓来源的细胞的表达明显高于脂肪tissue-derived msc在微阵列分析阶段(4.55折变化, )。这个结果证实了在评价中存在基因表达的方法。此外,BM-MSCs也显示出更高的表达SMAD3基因和蛋白表达分析。我们的数据表明,TGF -β途径可以更活跃在BM-derived细胞比脂肪tissue-derived msc可与增强tenogenic潜力。

在这项研究中,我们也感兴趣如果趋化因子的表达变化在不同来源的msc。越来越多的证据表明,旁分泌作用具有显著的msc治疗的作用机制的重要性。在大面板的因素由msc分泌,趋化细胞因子(趋化因子)似乎是相关的,但部分研究相对较少。趋化因子驱动的炎症的过程,招聘和迁移的细胞,是一个必要的步骤,组织再生/治疗。另一方面,过度或者长期的炎症反应可以导致病理的后果。免疫细胞的影响(特别是巨噬细胞)在再生过程的深入研究和证实在骨骼肌组织(36]。肌腱愈合也是免疫系统的调制(37),但自然发生的过程是缓慢而最终与肌腱受损的力量。假设修改MSC-based疗法可以改善肌腱愈合的炎症反应。我们的比较分析hASC和hBM-MSC转录组使用Affymetrix微阵列显示7基因编码趋化因子表达明显不同这两种细胞类型。包括基因的组CXCL16,CXCL6,CXCL12,CCL2,CXCL8,处于受控,亚兰。在所有情况下,表达高hBM-MSCs表明BM-MSCs通常更积极地分泌趋化因子对asc比。考虑到BM-derived基质细胞的生理作用,它不是一个令人惊讶的结果。褶皱最高的三种趋化因子基因表达的变化差异选择进行进一步分析。CXCL16而言,微阵列的结果明确证实在后续测试。骨骨髓来源msc显示更高的表达式CXCL16比hASCs ( 不管BM供体年龄),进一步证实了CXCL16评估细胞培养上清液。CXCL16是唯一CXCR6受体的配体。CXCR6 / CXCL16轴有一个很坏的新闻作为其活动增加了某些癌症的入侵(有关38)和代谢疾病的发展障碍(39]。然而,另一方面,CXCL16被证明是一个关键的中介的肌肉再生,而抑制纤维化的发展(40]。在老鼠身上缺乏CXCL16,巨噬细胞的浸润受伤的肌肉受损,巨噬细胞显示骨骼肌再生的必要元素。目前尚不清楚如何增加CXCL16水平会影响肌腱愈合,它显然需要进一步调查。它可以是假定可以增强单核细胞/巨噬细胞受伤的招聘网站。它是假定msc分化的巨噬细胞到M2表型(13),一般在解决炎症是至关重要的,组织重建和再生。巨噬细胞的作用在肌腱修复不是公认的在肌肉组织中,但大多数公布的数据表明,该细胞群是有益的肌腱愈合过程41,42]。另一种趋化因子显示更高的表达比在我们的微阵列分析对asc BM-MSCs CXCL12 (SDF-1)。这个结果证实了rt - pcr方法,但只有hBM-MSCs来自年轻的捐助者(3.2倍之间的表达差异hBM-MSC-Y hASC, )。同样,分泌CXCL12明显高于年轻(但不是年龄)donor-derived hBM-MSCs hASCs。CXCL12是持续分泌的骨髓,使retainment骨髓干细胞和祖细胞,而脂肪组织不是一个在生理条件下趋化因子的重要来源。我们的研究首次表明,分离和培养人类BM-MSCs表达和分泌对asc CXCL12明显多于做。我们另外在功能测试,尽管所有分析MSC类型chemoattracted BM-MSCs, BM-MSC Y提供更强的信号比ASC或BM-MSC a可能这种效果是由于更高的CXCL12分泌这些结果是同意CXCL12表达和分泌的差异。它可以作为CXCL12-CXCR4 '重要的是公认轴的关键招聘不同的干细胞和祖细胞,不仅造血血统。CXCL12吸引间充质基质细胞,内皮祖细胞,神经干细胞,平滑肌祖细胞和纤维母细胞祖细胞,因此协调各组织和器官再生过程(43]。结果表明,增加当地CXCL12浓度提高的愈合肌腱受伤。沈et al。44)表明,CXCL12纳入针织silk-collagen海绵支架改进后的肌腱再生的功效,增加纤维母细胞和肌腱细胞外基质生产的招聘相比没有CXCL12脚手架。最近,CXCL12的积极影响肌腱再生证实了太阳et al。45]。在他们的研究中,使用胶原蛋白支架与连接collagen-binding SDF-1导致改善力学性能相比,再生肌腱支架本身。我们的研究结果表明,hBM-MSC Y可以更有效地提高肌腱再生后地方政府比hASCs因为密集CXCL12生产。另一方面,旁分泌活动由很多因素可以修改;因此,很难预测分泌的差异是否会保留原位移植后。CXCL6第三趋化因子分析更多的细节在我们的研究中。在这个分子的情况下,微阵列结果不经rt - pcr和ELISA检测中没有发现显著差异hBM-MSCs和hASCs之间。

另外在这里讨论的研究中,我们评估BM捐助者的年龄对表达的影响选择的因素。我们的研究结果表明,供体年龄分析细胞的影响参数显著低于细胞来源的影响;然而,从老BM-MSCs捐助者tenogenic活动似乎高于BM-MSCs从年轻的捐助者。文献数据不一致的问题。有几项研究,作者得出结论,msc的分化潜能并不是影响供体年龄(18,46]。另一方面,一些报道表明人类msc孤立从捐赠者岁现在受损治疗属性(47,48]。在一项研究中,BM-MSCs岁年轻和捐赠者进行蛋白质组学分析后归纳tenogenic分化。已经证明,超过200种蛋白质有不同表达BM年轻和年长的捐助者。相关的差异表达蛋白质是细胞生存和死亡或抗氧化潜能,以及一般的蛋白质代谢,但不是tenogenic分化潜能(49]。在我们的研究中,hBM-MSC Y和hBM-MSC组之间差异的基因表达水平的趋化因子是重要的只有CXCL12。一个更高的CXCL12表达式是hBM-MSC Y组。分泌活性试验,细胞年轻,年龄捐助者之间的差异没有达到统计学意义,但功能测试与基因表达分析是相一致的。然而,对于SMAD3 COL14A1,骨髓组织之间的差异只在蛋白质水平显著。有趣的是,在这两种情况下,更高的蛋白质水平观察细胞在骨髓捐赠者。包括其他基因和蛋白质的分析,没有团体hBM-MSC Y和hBM-MSC之间的差异。

5。结论

细胞疗法正在认真考虑治疗肌腱损伤。使用本机msc的可能性以及部分区分tenogenic途径都有其优点和缺点。根据损伤的类型和汽车之间的决定——或者同种异体移植,可能需要选择不同的细胞制备的方法。不管选择的方式,选择合适的细胞来源似乎是至关重要的。在我们的研究中,我们提出的第一个比较人类从骨髓msc和脂肪组织中潜在使用肌腱治疗。什么是重要的,比较关注选择基因的基础水平。这是很重要的,原因有两个。首先,它显示了哪些细胞来源是更多的治疗最好是选择使用nondifferentiated细胞。其次,它允许参考其他研究msc诱导各种tenogenic因素或它们的组合测试。这种比较可以推断褶皱改变基因的表达是否重要tenogenesis感应后高于未经处理的BM-MSCs仍然细胞治疗的黄金标准。 Based on these results, we can suggest that for therapy of tendon injuries, MSCs originating from the bone marrow can be more beneficial than ASCs. The influence of the age of bone marrow donors seems to be less crucial than MSC source; however, cells from elder donors displayed a higher expression of some tenogenic markers than BM-MSCs from younger donors.

数据可用性

列表之间的显著差异表达的基因组织微阵列分析提出了补充信息文件1。微阵列数据用于支持本研究的结果存入NCBI的基因表达混合和可通过地理系列加入GSE128949数量(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE128949)。流式细胞术、微阵列实时qPCR,分泌,免疫印迹和迁移试验数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了国家研究和发展中心(批准号STRATEGMED1/233224/10 NCBR / 2014;项目开始)。作者请谢谢Paulina Gorka和Wiktoria Dawidczuk执行美联社活动分析。我们还要感谢Danuta Kłosowska和彼得亚雷Wierzbicki MSC识别过程中执行仪分析。

补充材料

辅料S1:图像自动成像阅读器Cytation™1。,“,“现在相同的视野。细胞迁移的上层舱插入沾了(红色)。细胞核与DAPI染色(蓝色)。”和“演示的方法分析(核编号,一个“迁移细胞编号)、规模酒吧- 300μm。辅料S2:表提供了列表hASCs之间表现出明显不同的基因表达和hBM-MSCs基于微阵列分析。辅料S3:表提供了所有基因意味着Δct和SEM值和所有组织分析研究( 在每组)。(补充材料)

引用

1. c . w . y . Liu孙,j . f . Zhang和g·李,“当前概念tenogenic分化和临床应用”骨科杂志》的翻译卷。9日,28-42,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 问:棕褐色,y . f .鲁伊·p·p·卢伊和y . m . Wong“比较潜能的干细胞分离肌肉骨骼组织工程肌腱和骨髓,“组织工程部分,18卷,不。7 - 8,840 - 851年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. c . s .林,林g, t·f·卢“同种异体移植和异种的脂肪中提取干细胞的免疫活性的收件人没有免疫抑制剂,”干细胞与发展,21卷,不。15日,第2778 - 2770页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. k .勒布朗f . Frassoni l .球et al .,“间充质干细胞治疗抗类固醇,反应的严重,急性移植物抗宿主病:二期的一项研究中,“《柳叶刀》,卷371,不。9624年,第1586 - 1579页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 郑胜耀李,w . Kim c . Lim和s . g .钟”治疗侧epicondylosis通过使用同种异体脂肪间充质干细胞:一个试点研究,“干细胞,33卷,不。10日,2995 - 3005年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. w·Zarychta-Wisniewska a . Burdzinska a Kulesza et al .,“Bmp-12激活tenogenic通路在人类脂肪干细胞和影响他们的免疫调节和分泌特性,”BMC细胞生物学,18卷,不。1,p。13日,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. l .戴x, x Zhang et al .,“不同tenogenic分化能力不同的间充质干细胞在BMP-12面前,“转化医学杂志》,13卷,不。1,p。200年,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 郑胜耀李,b . Kwon k . Lee黄懿慧儿子,和s . g .钟”治疗机制的人类脂肪间充质干细胞在大鼠肌腱损伤模型中,“美国运动医学杂志》上,45卷,不。6,1429 - 1439年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m . Strioga s Viswanathan a . Darinskas o . Slaby和员工j . Michalek”相同或不相同的吗?比较脂肪tissue-derived与骨骨髓来源间充质干细胞和间质细胞,”干细胞与发展,21卷,不。14日,第2752 - 2724页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. d·诺埃尔·d·卡顿,美国罗氏et al .,“人类脂肪细胞特定的差异和mesenchymal-stromal细胞尽管相似的分化潜能,”实验细胞研究,卷314,不。7,1575 - 1584年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. m .情歌,k . s . Rao, n . h .赖尔登”评估疗效的间充质干细胞分泌修改的分泌物和感应不同的文化方法,”转化医学杂志》,12卷,不。1,p。260年,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. t·a·韦恩和k . m . Vannella”,巨噬细胞在组织修复、再生和纤维化”免疫力,44卷,不。3、450 - 462年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. m·弗朗索瓦·r·Romieu-Mourez m·李和j·阿斯“人类MSC抑制与细胞因子诱导吲哚胺2,3-dioxygenase和旁观者M2巨噬细胞分化,“分子治疗,20卷,不。1,第195 - 187页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. f . a . Dabrowski a . Burdzinska a Kulesza et al .,“比较的旁分泌活动源自人类脐带间充质干细胞,羊膜和脂肪组织,”妇产科杂志》的研究,43卷,不。11日,第1768 - 1758页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. w·j·杜y Chi, z . x杨et al .,“异质性proangiogenic特征的间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、”干细胞研究与治疗,7卷,不。1,p。163年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. e·拉特克利夫k·e·格伦·m·w·奈,和d·j·威廉姆斯,“现状和观点在干细胞再生医学疗法进行临床试验:案例研究,“英国医学公告,卷108,不。1,第94 - 73页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. j·s·巴·m·l·Alvarenga j·p·h·Pfeifer et al .,“同种异体间充质干细胞移植在健康马肤浅的指屈肌腱:一项研究的局部炎症反应,”兽医科学研究卷,118年,第430 - 423页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. w . c . Prall m·m·萨勒a Scheumaier et al .,“间充质基质细胞的增殖和成骨分化能力:影响收获网站和捐助的时代,“受伤卷,49号8,1504 - 1512年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. a . Burdzinska苗种,w . Zarychta-Wisniewska et al .,”山羊的女性尿道的解剖结构和特点的肌肉和自体骨髓衍生山羊的细胞细胞疗法测试”解剖记录,卷300,不。3、577 - 588年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. b . m . Bolstad r·A·伊·m·搁浅地和t . p .速度,“比较规范化方法高密度寡核苷酸阵列数据基于方差和偏差,“生物信息学,19卷,不。2、185 - 193年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. c . Eisenhart“方差分析的假设基础。”生物识别技术,3卷,不。1、21、1947页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. h . Wegmeyer a . m . Broske m . Leddin et al .,“间充质基质细胞特征取决于他们的起源,”干细胞与发展,22卷,不。19日,2606 - 2618年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 崔j . s . Heo y . h . s . Kim和h o . Kim”比较人类间充质干细胞的分子资料来源于骨髓、脐带血液、胎盘和脂肪组织,”国际分子医学杂志》上,37卷,不。1,第125 - 115页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. e . Havis m·a . Bonnin i Olivera-Martinez et al .,”老鼠四肢腱细胞转录组分析在开发期间,“发展,卷141,不。19日,3683 - 3696年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. 答:a .沙逊y Ozasa, t . Chikenji et al .,“骨骼肌和骨髓基质细胞衍生而来:比较tenocyte分化功能,“骨科研究期刊》的研究,30卷,不。11日,第1718 - 1710页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. 诉Lejard f . Blais m . j . Guerquin et al .,“EGR1, EGR2参与脊椎动物肌腱分化。”《生物化学》杂志上,卷286,不。7,5855 - 5867年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. s . Miyabara y璧,y Kasashima, a . Kuwano和k . Arai”的监管tenomodulin表达式通过Wnt /β连环蛋白信号在马骨骨髓来源间充质干细胞,”马科学杂志》,25卷,不。1、7 - 13,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. a·k·李维j . d .孔雀y陆et al .,“Scleraxis需要细胞谱系分化和细胞外基质重塑在小鼠体内心脏瓣膜形成,”循环研究,卷103,不。9日,第956 - 948页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. 李y . m . Ramcharan z周et al .,“scleraxis角色的命运决心tenocyte间充质干细胞的分化,“科学报告,5卷,不。1,第13149条,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. 江史y, y, y . et al .,“条件tenomodulin超表达支持tenogenic转基因小鼠派生细胞谱系分化,“基因卷。598年,9-19,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. d . w . Youngstrom j . e . LaDow和j·g·巴雷特,“Tenogenesis骨髓、脂肪、tendon-derived干细胞在动态生物反应器,”结缔组织的研究卷,57号6,454 - 465年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. a·罗梅罗l . Barrachina b Ranera et al .,“比较自体骨髓和脂肪组织提取间充质干细胞,和富血小板血浆治疗手术诱导马肤浅的指屈肌腱损伤,”兽医杂志》卷,224年,第84 - 76页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. 侯y、m .镍,美国林et al .,“Tenomodulin高度表达msc作为肌腱损伤的治疗,更好的细胞源”Oncotarget,8卷,不。44岁,77424 - 77435年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. j·p·布朗诉g·芬利,c . k .郭”胚胎机械和可溶性信号调节肌腱祖细胞基因表达的发育阶段和解剖起源,”生物力学杂志卷,47号1,第222 - 214页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. ai Goncalves, m·t·罗德里格斯s . j . Lee et al .,“理解生长因子的作用在调节干细胞tenogenesis,”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。12篇文章e83734 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. j·赛j·s·麦克菲,s .达c·e·斯图尔特和n . Al-Shanti“再生功能的免疫系统:调制的肌肉干细胞”老化的研究评论27卷,第76 - 67页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. s . Thomopoulos w . c .公园、d·b·里夫金和k . a . Derwin“肌腱损伤和修复机制,骨科研究期刊》的研究,33卷,不。6,832 - 839年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. r . Allaoui c . Bergenfelz s Mohlin et al .,“癌症fibroblast-secreted CXCL16吸引单核细胞,促进基质激活三阴性乳腺癌,”自然通讯,7卷,不。1,第13050条,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. a . Collado p品牌,p . Escudero et al .,”功能的作用内皮CXCL16 / CXCR6-platelet-leucocyte轴在血管紧张素II-associated代谢紊乱,”心血管研究,卷114,不。13日,1764 - 1775年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. l, l .跑,g·e·加西亚et al .,“趋化因子CXCL16调节中性粒细胞和巨噬细胞浸润到受伤的肌肉,促进肌肉再生,”美国病理学杂志》上,卷175,不。6,2518 - 2527年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. c·s·张伯伦·e·m·Leiferman k·e·弗里施et al .,“巨噬细胞耗竭对韧带愈合的影响”,结缔组织的研究,52卷,不。3、203 - 211年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. m . de la Durantaye a . b .移液管,n . van Rooijen和j . Frenette“巨噬细胞消耗减少细胞增殖和细胞外基质堆积但增加受伤的跟腱的极限抗拉强度,”骨科研究期刊》的研究,32卷,不。2、279 - 285年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. k . Andreas m .坐,j .吊环”对原位组织工程:chemokine-guided干细胞招聘,“生物技术的发展趋势,32卷,不。9日,第492 - 483页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. w .沈、陈x j . Chen等人”的影响将外源基质细胞衍生因子- 1α在针织silk-collagen肌腱再生海绵支架,”生物材料没有,卷。31日。28日,第7249 - 7239页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. j .太阳,c .备忘录,施问:et al .,“控制释放collagen-binding SDF-1α从一只老鼠的胶原蛋白支架促进肌腱再生跟腱缺损模型,”生物材料卷。162年,22-33,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. p .普拉格m . Kunz r·艾伯特et al .,“间充质干细胞分离前交叉韧带:描述和比较年轻和年老捐赠者的细胞,”膝盖手术及相关研究,30卷,不。3、193 - 205年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. 董h . m . Liu Lei, p . et al .,“脂肪间充质干细胞从老年人表现出迁移和分化能力下降和衰老特性,”细胞移植,26卷,不。9日,第1519 - 1505页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. ai Caplan,”评论:间充质干细胞:细胞重建整形外科治疗,”组织工程,11卷,不。7 - 8,1198 - 1211年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. m . j . Peffers j·柯林斯,j . Loughlin先生c .学监和p·d·克莱格”chondrogenic的蛋白质组学分析,从老化间充质干细胞成骨和tenogenic构造,“干细胞研究与治疗,7卷,不。1,p。133年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2019 Weronika Zarychta-Wiśniewska等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。