雌性生殖道人类胰腺癌瀑样的表达分析图表类型

文摘

背景。瀑样文化人类胰腺导管腺癌(PDAC)已经成为一种很有前途的肿瘤子类型化和个性化的化学敏感性测试的工具。PDACs最近被分组到不同的分子亚型临床影响基于细胞角蛋白- 81 (KRT81)和肝细胞的核因子1 (HNF1A)。然而,一个合适的抗体HNF1A目前不可用。本研究旨在建立子类型化的PDAC瀑样使用另一个标记。方法。生成一个PDAC瀑样生物从人类主要包含22行肿瘤样本。免疫荧光染色和成立十瀑样线为囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道和KRT81。实时定量PCR (qPCR)对雌性生殖道和HNF1A执行。使用吉西他滨化疗药物的反应分析,研究者用,铂,伊立替康。结果。的生物patient-derived PDAC瀑样成立。效率是71%与68%(22/31),手术切除术为83%,细针抱负。瀑样可以分为quasimesenchymal建立,基于KRT81 exocrine-like,古典亚型和雌性生殖道免疫反应性。雌性生殖道蛋白表达在转录水平确认。雌性生殖道和HNF1A转录表达水平呈正相关( ; ; )。PDAC亚型的主要肿瘤和相应的瀑样线是相同的对于大多数的病例分析(6/7)。化疗药物治疗透露关于药物反应倾向,但没有显著差异。结论。人类PDAC瀑样可以分为基于KRT81已知亚型和雌性生殖道免疫反应性。雌性生殖道和HNF1A mRNA水平相关。此外,subtype-specific免疫反应性之间的匹配好PDAC瀑样和各自的原发肿瘤组织。子类型化的人类PDACs使用雌性生殖道可能构成一个替代HNF1A和应进一步调查。

1。介绍

尽管进步与多通道治疗方法如FOLFIRINOX政权,胰腺导管腺癌(PDAC)仍然是癌症预后最差的。今天,在新辅助化疗或辅助设置组合优化的结果是至关重要的(康罗伊et al。1)和Hackert et al。2])。然而,PDAC异构关于其基因改变和分子表达谱导致subtype-specific对单一化疗药物反应和生存3- - - - - -6]。最近,一个使用细胞角蛋白免疫组织化学(包含IHC)子类型化的PDAC - 81 (KRT81)和肝细胞的核因子1 (HNF1A)被发现匹配的转录子类型quasimesenchymal (QM;KRT81⁺HNF1A^{- - - - - -})、古典(KRT81^{- - - - - -}HNF1A^{- - - - - -})和exocrine-like (KRT81^{- - - - - -}HNF1A⁺)[4,5]。手术治疗组的PDAC病人,HNF1A⁺亚型与最好的,而KRT81⁺生存预后最差的亚型(4,5,7]。因此,早期诊断后子类型化基于KRT81 / HNF1A包含ihc PDAC可以指导个性化的联合化疗。

在最近几年,现代patient-derived 3 d细胞培养名叫瀑样已成为一种很有前途的肿瘤个性化分析和药物筛选模型(8- - - - - -11]。瀑样文化使肿瘤种植,传播,和及时的化学敏感性测试12]。此外,由于反复冻融循环的可能性,他们允许建立生活肿瘤药物的生物银行大规模测试板(13]。基于响应评估,个性化治疗策略对个体病人可以设计(14]。迄今为止,人类PDAC immunosubtyping瀑样使用KRT81和HNF1A尚未建立。immunosubtyping进一步变得困难,因为最初描述HNF1A抗体(h - 205;sc - 8986)不再是商用和替代HNF1A抗体未能产生可重复的结果。另一个潜在exocrine-like (HNF1A标志⁺)亚型可能允许亚型分化是囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)[4]。然而,雌性生殖道表达PDAC瀑样及其与HNF1A相关表达式是未知的。在正常胰腺、cAMP-regulated氯通道所表达的是水、导管上皮细胞(15]。雌性生殖道突变与风险增加发展的PDAC [16]。

本研究旨在分析KRT81 HNF1A,雌性生殖道表达在人类PDAC瀑样为了使常规瀑样子类型化的个性化治疗。

2。材料和方法

2.1。人类PDAC样本

执行这项研究与人类标本从患者获得承认的内脏,胸和血管手术或医疗部门我大学医院卡尔·古斯塔夫词Carus德国德累斯顿技术大学。所有样本被诊断为PDAC由董事会根据世界卫生组织的标准认证的病理学家。组织收集、瀑样文化,分析被允许由当地伦理委员会(# EK451122014和# EK68022018)。

2.2。生成和培养人类的PDAC瀑样

肿瘤标本切成块小于1毫米³和消化dispase II(2.5毫克/毫升,罗氏)和胶原酶II(0.625毫克/毫升,Sigma-Aldrich)在DMEM / F12 + + +媒介(DMEM / F12(表达载体)补充1 x玫瑰(表达载体),1 x笔/喉炎的症状(表达载体),和1 x GlutaMAX(表达载体))在37°C根据样本容量为30 - 120分钟。经过几次清洗步骤DMEM / F12 + + +媒介,其余细胞颗粒在肾小球滤过率(GFR) resuspended基底膜基质(康宁)和培养人类PDAC瀑样中等DMEM / F12 + + +补充Wnt3a-conditioned介质(50% ),noggin-conditioned中等(10% ),RSPO1-conditioned中等(10% ),B27 (1 x,表达载体),烟酰胺(10毫米,Sigma-Aldrich),胃泌激素(1纳米,Sigma-Aldrich) N-acetyl-L-cysteine(1毫米,Sigma-Aldrich) primocin(1毫克/毫升,InvivoGen),重组鼠表皮生长因子(mEGF 50 ng / ml,表达载体),重组人成纤维细胞生长因子10 (hFGF10, 100 ng / ml, PeproTech), a - 83 - 01 (0.5μM, Tocris生物科学)和N2 (1 x,英杰公司)。

2.3。(包含IHC)免疫组织化学染色及成像

部分从主PDAC石蜡包埋组织样本所提供的肿瘤和正常组织的病理学研究所卡尔古斯塔夫词Carus大学医院。hematoxylin-eosin())和包含IHC染色KRT81(圣克鲁斯# sc100929 1: 150)和雌性生殖道(Abcam # ab131553 1: 300)根据标准协议进行deparaffinized组织部分。图像是由一个evo FL汽车(技术)显微镜。雌性生殖道表达被认为是积极的,如果一个中等强染色中检测出超过10%的上皮细胞。分析KRT81染色完成的标准Muckenhuber和他的同事们(7]。总之,只有强壮的染色KRT81至少30%的上皮细胞导致的分类“KRT81-positive PDAC。“瀑样线NR002、NR005 NR006来自细针的愿望,所以没有执行包含IHC染色主要肿瘤组织是可用的。

2.4。免疫荧光染色

整个PDAC瀑样收集在15毫升猎鹰,固定在2%甲醛(Sigma-Aldrich)一夜之间在4°C, permeabilized Triton x - 100 0.3% (Sigma-Aldrich) 20分钟,和阻止1% BSA(热费希尔科学)和PBS Triton x - 100 0.1% (Sigma-Aldrich) 1小时。样本然后孵化主要抗体KRT81 CFTR(圣克鲁斯,# sc100929)或检测(Abcam # ab131553),两个稀释1:50阻断缓冲区,在室温下2小时,后跟一个小时孵化与二级goat-anti-rabbit Alexa-Fluor 488抗体(生命技术),稀释1:200年阻止缓冲区。另外PDAC瀑样与DAPI染色(热费希尔科学)和Alexa-Fluor 568 phalloidin(热费希尔科学)。图像是由蔡司LSM 510/880共焦显微镜和分析ImageJ (NIH)。获得的图像都是用相同的设置。

2.5。体外药物化验

在384孔板的机械分离PDAC瀑样被镀在15μl基底膜基质提供40μl PDAC瀑样的媒介。24小时后,与传统化疗药物稀释药物治疗开始如下:吉西他滨(1μ米、200 nM、100 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM,和1海里),5 -氟尿嘧啶(研究者用;50μ25米,μ10米,μ5米,μM, 1μ米、100 nM,和10 nM),草酸铂(500μ米、100μ50米,μ25米,μ10米,μM, 1μM, 100海里),伊立替康(250μ25米,μ10米,μM, 1μ米、100 nM、10 nM, 1海里)。消极的控制和每个药物稀释在一式三份完成。72 h后介质代替。读出了144 h后孵化通过测量使用PrestoBlue细胞的代谢活动可行性试剂(表达载体)后,制造商的协议。短暂,瀑样孵化2小时37°C PrestoBlue和荧光测量560/590 nm使用Varioskan勒克斯(热科学)。相对可行性正常化后空白减法计算的均值-控制。所有药物化验进行了三次。为了解剖亚型特定药物反应quasimesenchymal (KRT81化验结果⁺)和double-positive (KRT81⁺CFTR /检测⁺)瀑样线的总和。同样是做药物试验结果exocrine-like(雌性生殖道⁺)和古典(KRT81^{- - - - - -}CFTR /检测^{- - - - - -})PDAC瀑样线。

2.6。实时定量PCR (qPCR)

总RNA从瀑样文化孤立使用RNeasy迷你包(试剂盒)后,推荐用户指令。0.5的互补脱氧核糖核酸合成μg RNA是完成了qScript cDNA SuperMix (Quantabio)。qPCR进行了使用GoTaq qPCR大师混合(Promega) StepOnePlus实时PCR系统(热费希尔科学)下面的基因表达分析:GAPDH (5 - - - - - -GCA CCA CCA GCT TAG-3行动(感觉),5 - - - - - -ATG ATG TTC TGG AGA GCC CC-3(反义));ACTB1 (5 - - - - - -AAA TCT GGC ACC ACA有条件现金援助TC-3(感觉),5 - - - - - -AGA GGC GTA CAG CA-3 GGA标签(反义));HNF1A (5 - - - - - -ACG ACG ATG GGG亚美大陆煤层气有限公司TC-3行动(感觉),5 - - - - - -广汽TTG ACC ATC TTC GCC AC-3(反义));和雌性生殖道(5 - - - - - -资本利得猫CAA AGC ATG CCA AC-3(感觉),5 - - - - - -TCG TTG ACC苑TG-3 CAG的行动(反义))。计算相对基因表达是描述Hellemans和他的同事们([17])。简单算术方法计算每个基因的分析样本量化周期值转化为相对数量(rq)。接下来,几何均值分别计算两个管家基因的rq导致sample-specific归一化因子(NF)。相对表达式由分裂的RQ NF决定。

2.7。统计分析

相关分析是通过计算皮尔逊相关系数在GraphPad棱镜(版本6.02),假设一个正态分布的数据。置信区间为95%(双尾)值计算。

3所示。结果

3.1。一代的人类胰腺癌瀑样生物

我们收集了31日的人类原发性肿瘤样本PDAC病人首次治疗:25标本从内镜超声外科肿瘤切除术和6——(欧盟)引导细针吸活(FNA)(图1)。瀑样代总效率为71%的22 PDAC瀑样线(FNA)外科切除术为68%和83%)。所有主要的癌症都是组织学证实PDACs。新标准PDAC瀑样线是一个稳定的增长超过10通道和KRAS突变的存在,分析了Sanger测序,当needed-Illumina面板测序,从而排除增长正常胰腺瀑样的,一个常见的问题在PDAC瀑样代(11]。fna标本显示效率更高的结果相比,切除标本。总体而言,经济增长率与以前公布的瀑样生物银行(8,11]。

3.2。雌性生殖道可能构成一个替代HNF1A PDAC图表类型的生物标志物

由于缺少合适的HNF1A抗体,我们寻找一个替代标记子类型化PDAC。雌性生殖道是PDAssigner基因集的一部分定义exocrine-like亚型(4]。因此我们进行免疫荧光CFTR(如果)染色法检测以及KRT81十瀑样线(图2和补充图S1)。瀑样线DD314、DD376 DD385, DD394, DD442雌性生殖道积极(雌性生殖道⁺),而没有显著的表达KRT81 (KRT81^{- - - - - -})被观察到。另一方面,瀑样线DD337, DD439, NR006表现出没有雌性生殖道免疫反应性(雌性生殖道^{- - - - - -}),但一个强大KRT81积极性(KRT81⁺)。没有标记(KRT81的表达式^{- - - - - -}CFTR /检测^{- - - - - -}NR005)是观察,而标记(KRT81 NR002表达⁺CFTR /检测⁺)。因此,雌性生殖道和KRT81显示一个互斥的表达模式,分配几乎所有PDAC瀑样最常出现的描述了两个亚型:exocrine-like(雌性生殖道⁺/ KRT81^{- - - - - -})和quasimesenchymal(雌性生殖道^{- - - - - -}/ KRT81⁺)。此外,一个双重否定“经典”(KRT81^{- - - - - -}CFTR /检测^{- - - - - -})和一个double-positive瀑样被包含在分析群体。

进一步建立雌性生殖道HNF1A的另一个标志,我们分析了这两个基因的信使rna表达水平在所有PDAC瀑样线由qPCR(图3(一个))。

基于截断值2倍超表达的积极性HNF1A和雌性生殖道,瀑样线DD314, DD376, DD385, DD394, DD442,和NR005判断两个基因阳性,而瀑样线DD337, DD439, NR006基因被认为是消极的。瀑样线NR002 HNF1A阳性,而雌性生殖道的负面。强大的线性相关性发现HNF1A和雌性生殖道的表达式( ; ;图3 (b))。

如果和qPCR结果比较,瀑样线DD314, DD376, DD385, DD394,和DD442雌性生殖道积极在mRNA和蛋白水平,而DD337 DD439, NR006 -在两个水平。两种情况(NR002 NR005) mRNA水平不匹配与相应的染色。CFTR NR002显示一个微弱但清晰的表达检测蛋白质水平,虽然基于mRNA水平被判负。NR005相反的是,雌性生殖道的mRNA水平评价是积极的,而没有检测到蛋白表达。

3.3。保护亚型之间瀑样线和相应的主要肿瘤

回答这个问题如果PDAC瀑样表达同一subtype-specific免疫反应性作为相应的原发性肿瘤,我们进行免疫组织化学染色KRT81和雌性生殖道石蜡切片对所有病人的瀑样来自切除标本( ;补充图S2)。雌性生殖道和KRT81表达符合瀑样线DD314瀑样免疫反应性,DD337, DD376, DD385 DD394, DD442。DD439,包含IHC染色呈阳性标记,而相应的瀑样线只KRT81表示。总之,在6/7样品,亚型之间保留主要肿瘤和瀑样线。

3.4。传统化疗药物反应测试

地址不同的分子亚型是否表现出对传统化疗药物反应的微分,PDAC瀑样与吉西他滨单药治疗化合物FOLFIRINOX方案,伊立替康,铂,研究者用(图4(一))。广泛为每个药物药物反应是观察到的变化。为了执行一组比较,KRT81⁺quasimesenchymal / double-positive ( )瀑样线和KRT81^{- - - - - -}exocrine-like /古典( )瀑样线是结合在一起的。一个不重要的( ;图4 (b))1.5倍KRT81阻力较高⁺对研究者用瀑样(平均IC50 KRT81⁺5.01μM;KRT81^{- - - - - -}7.52μM)和铂(意味着IC50 KRT81⁺20.88μM;KRT81^{- - - - - -}30.36μ观察M),同时检测中没有发现区别为吉西他滨(平均IC50 KRT81⁺0.02μM;KRT81^{- - - - - -}0.02μM)和伊立替康(意味着IC50 KRT81⁺7.61μM;KRT81^{- - - - - -}6.33μ米)。

4所示。讨论

多年来,经典的二维细胞培养在塑料盘子是癌症研究的主力。基于识别的标志基因Lgr5就肠道干细胞(18),一种新颖的三维培养系统命名瀑样了,忠实地概括起源的组织19]。这是可能通过使用矩阵(基底膜基质)加上一个鸡尾酒及生长因子抑制剂的定义基于正常肠道干细胞的生长需求(20.]。与此同时,几个不同的瀑样文化协议已发表了许多不同的器官(21]。正常组织瀑样的初始建立文化后,也瀑样来源于人类肿瘤描述(13,22]。这些patient-derived癌症瀑样开辟新的个性化治疗的机会,因为他们模仿在体外的高度响应肿瘤在活的有机体内(14]。

PDAC是一个非常不同的疾病,在组织学和分子水平(23]。然而,目前,几乎所有患者接受相同的化疗、分子亚型尚未进入临床阶段。有一个巨大的需要在定义更好的治疗策略,大多数患者存在严重的疾病阶段,系统性化疗一般只有一个小整体存活率的影响。PDAC分组到不同的分子亚型患者显示区分不同的生存4,7]。Collisson等人描述了三个不同的PDAC亚型:古典,quasimesenchymal, exocrine-like亚型。这个子类型化是基于使用微阵列的激光capture-microdissected mRNA表达分析材料。促进繁琐和容易腐烂mRNA-based子类型化,诺尔等人发现了蛋白质标记HNF1A KRT18,可以分类PDAC到建立“Collisson”子组(5]。在后续的研究中,作者进一步建立的价值HNF1A / KRT81-based子类型化记录治疗反应差的病人的护理标准治疗(7]。

因为所有这些研究病人资料进行回顾性设置,前瞻性临床试验表明,个性化治疗的描述分子亚型PDAC病人受益。为了建立这样一个临床试验,两点的重要性:首先,子类型化需要相当快,其次,非常可再生的。特别是在新辅助设置,只有很少的肿瘤材料是可用的,因为材料主要是收到EUS-guided fna)。这种材料不可以在常规的基础上执行IHC-based子类型化。瀑样可以生成效率高从fna)(83%)在当前队列,因此构成一个可行的方式扩大肿瘤材料体外执行子类型化。第二个重要的一点是IHC染色的重现性。最初使用HNF1A抗体(# sc - 8986,圣克鲁斯生物技术)停止,不再可用。测试替代抗体HNF1A导致矛盾和不确定的结果。因此我们开始建立雌性生殖道作为替代HNF1A PDAC瀑样的文化。雌性生殖道如果染色给很强或很弱或没有染色,允许我们分类瀑样线或正面或负面。 As we could not perform HNF1A IHC to compare side by side HNF1A to CFTR stainings, we performed mRNA expression analyses. This resulted in a highly significant correlation of the transcript levels of the two genes. In line with previously published papers, CFTR expression was mutually exclusive to KRT81 expression in nearly all organoid lines we analyzed. We could therefore assign—assuming that CFTR can indeed substitute HNF1A—our organoid lines into the quasimesenchymal, the exocrine-like, or classical subtype. In addition, one double-positive organoid line was detected. The existence of PDACs expressing both markers was previously observed [5,7]。

然而,exocrine-like亚型的存在最近被质疑和归因于污染正常胰腺组织的分析样本(24]。作为我们的文化只包含肿瘤细胞基于KRAS突变的等位基因频率发现和整个文化的同质积极性如果染色,我们的数据仍然主张这PDAC亚型的存在。值得注意的,我们观察到高一致性PDAC亚型之间的原发肿瘤和各自的瀑样线(6/7)。只在一个情况下(DD439),雌性生殖道的信号和KRT81在原发肿瘤的免疫组织化学染色,而相应的瀑样行只显示一个高KRT81表达蛋白质和mRNA水平。一个可能的解释可能是一个限制单克隆的PDAC瀑样线。原发肿瘤是判断积极如果至少10%的雌性生殖道上皮细胞被染色。因此可能瀑样线从CFTR-negative地区成立,而在这种特殊情况下由原发肿瘤的80%。在任何情况下,一个局限的分析缺少芯片mRNA表达子类型化的瀑样线使用原始PDAssigner基因集Collisson等人的控制。

常用的化疗药物化验执行的PDAC治疗没有显示KRT81之间的显著差异效应⁺(quasimesenchymal /双阳性)和KRT81^{- - - - - -}(exocrine-like /古典)PDAC瀑样线。Collisson等人所描述的quasimesenchymal PDAC 2 d细胞系相比更敏感,吉西他滨古典亚型(4]。Muckenhuber和他的同事建议KRT81⁺肿瘤细胞更耐FOLFIRINOX方案相比exocrine-like亚型(HNF1A⁺)。符合这一点,我们观察到KRT81的倾向⁺PDAC瀑样耐研究者用和铂在我们的群体中,由2/3 FOLFIRINOX疗法的药物,虽然我们可以清楚地文档药物测试的可行性主要patient-derived肿瘤模型如瀑样系统。较大的PDAC瀑样库结合KRT81 / CFTR-based子类型化方法可能揭示未来subtype-specific阻力模式对传统或靶向药物。

总之,子类型化的FNA-derived PDAC瀑样线根据雌性生殖道和KRT81可能构成一个可行的方式进行前瞻性临床试验评估subtype-specific个性化的治疗方案。

数据可用性

定量实时PCR CFTR HNF1A表达分析和检测数据,用于支持本研究的发现可以从相应的作者。由蔡司LSM 510/880共焦显微镜拍摄的图像的雌性生殖道免疫荧光染色法及KRT81从瀑样线D314 DD376, DD394, DD439, DD442, NR002, NR005, NR006包括补充信息文件(补充图S1)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

亚历山大·亨尼希劳拉狼,丹尼尔·e·斯坦格和Thilo Welsch贡献同样这项工作。

确认

我们想要谢谢克里斯汀·史怀哲的优秀的瀑样生物基础设施的维护。提供的资金是德意志Krebshilfe(# 111350)的威廉•桑德Stiftung DES(# 2014.104.1),和赫克托耳Stiftung DES和TW (# M65.2)。

补充材料

补充1。补充图S1: CFTR共焦检测和KRT81免疫荧光分析人类的PDAC瀑样。雌性生殖道和KRT81 immunofluorescent染色8额外的PDAC瀑样线。线路分为雌性生殖道⁺/ KRT81⁻(DD376 DD314 DD394和DD442),雌性生殖道⁻/ KRT81⁺(DD439和NR006),雌性生殖道⁻/ KRT81⁻CFTR (NR005)和检测⁺/ KRT81⁺(NR002)。酒吧代表200μm。

补充2。补充图S2:雌性生殖道/ KRT81包含IHC染色石蜡包埋的主要PDAC部分。相应的原发肿瘤组织的部分瀑样从外科PDAC标本是KRT81和雌性生殖道免疫组织化学染色。线路分为雌性生殖道⁺/ KRT81⁻(DD376 DD314 DD385、DD394 DD442),雌性生殖道⁻/ KRT81⁺CFTR (DD337)和检测⁺/ KRT81⁺(DD439)。酒吧代表1000μ米和200μM。

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