通过HIF1神经分化抑制α/β连环蛋白信号拟胚体

文摘

领域的广泛研究干细胞和发育生物学证据显示缺氧的作用作为一个重要的因素调节自我更新和分化。然而,全面准确的信息hypoxia-mediated干细胞命运调控机制在早期胚胎发育仍下落不明。使用拟胚体的模型(EBs)来源于小鼠胚胎干细胞(ESC),我们在这里试图加密低氧诱导因子1的作用α(HIF1α)神经在自发分化命运。EBs源自ESC HIF1烧灼基因α在分化异常增加神经元的特性。增加神经表型Hif1α^−−/EBs的中断β连环蛋白信号与细胞质降解的增加β连环蛋白。的敲入Hif1α,以及β连环蛋白异位超表达在Hif1α^−−/EBs,诱导减少神经标记在野生型EBs观察到的水平。有趣的是,HIF1之间的直接交互α和β连环蛋白是通过免疫沉淀反应分析野生型EBs的核分数。在一起,这些结果强调HIF1的监管作用α在β连环蛋白稳定在自发分化,这似乎是一个至关重要的过早的自然抑制神经分化的机制。

1。介绍

在哺乳动物早期发育,胚胎细胞局部微环境的子宫,在胚胎能够生存和生长在缺氧(低氧张力)在功能形成血管系统和氧气和营养供给胚胎组织(1]。缺氧的影响(从21.6到36毫米汞柱,3 - 5%₂)正常胚胎发育早期强调了几个研究小组(2,3]。有趣的是,大多数胚胎和成年干细胞数量,包括造血、间叶细胞,神经干细胞,在缺氧条件下自然存在和氧气水平起着至关重要的作用在干细胞命运的决心4- - - - - -6]。除氧梯度,发育形态因子包括Wnt家族的配体产生相关影响时空感应以及规范的胚芽层(7- - - - - -10]。然而,低氧张力和形态因子的影响在干细胞的命运仍有争议,尤其是在ESC自我更新和分化的背景下。

细胞对缺氧的反应主要是通过低氧诱导因子(HIF)介导的。这些转录因子适应过程的主监管机构在应对氧气供应减少,包括血管生成、糖酵解和红细胞生产(11]。除了他们的作用在调节代谢和血管生成反应,低氧诱导因子参与的控制大多数干细胞的增殖和分化人群(12]。重要的是,特定HIF1消融α同种型在ESC分化与受损的血管生成和cardiomyogenesis6,13]。HIF1的监管作用α干细胞和神经分化命运已经建议,主要通过HIF1之间的直接交互α和监管至关重要的发展由Wnt通路激活的元素或切口配体14,15]。然而,仍然有问号HIF1的确切作用α及其相互作用与其他信号通路在干细胞分化,特别是在早期神经分化。

在这项研究中,我们强调HIF1的角色α在早期的神经分化使用EBs来源于小鼠ESC的典范。EB的微环境,ESC进行自发分化成三个胚芽层和概括哺乳动物早期发育7,16]。我们的结果表明,HIF1的稳定αEB的微环境似乎是一个至关重要的监管机制过早神经分化的抑制。我们也解决HIF1之间的串扰α和β连环蛋白信号的影响和评估这种交互在ESC分化神经的命运。

2。材料和方法

2.1。ESC培养和分化

制(R1细胞系;Hif1α^−−/细胞来源于R1被彼得·f·Carmeliet请提供;VIB Vesalius研究中心,3000鲁汶,比利时鲁汶大学)种植在杜尔贝科gelatin-coated菜修改鹰的介质(DMEM;HyClone;美国洛根,UT)补充15%胎牛血清(Gibco;卡尔斯巴德、钙、美国),100国际单位/毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(Sigma-Aldrich;圣路易斯,密苏里州,美国),1 x不必要的氨基酸(Gibco;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德),0.05毫米β巯基乙醇(丙烯酰胺;buch、瑞士)和1000 U /毫升的白血病抑制因子(Chemicon;美国泰梅库拉,CA)。ESC分化为前面描述的(13]。简单地说,暂停ESC (2.5×10⁶细胞表面/毫升)被播种硅胶模制microwells在1.5%琼脂糖(VWR)形成拟胚体(EBs)。24小时后的聚合形成(0),EBs被转移到一个agar-coated菜没有白血病抑制因子的补充和培育。所有转染程序进行EBs在这一点上,他们之前转移琼脂板上。神经分化,5-day-old EBs (5 d)被播种在DMEM / F-12 gelatin-coated菜(1:1)介质(Gibco;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)补充insulin-transferrin-selenium (Gibco)和抗生素(规范)和EBs种植了10天(5 + 10 d)在贴壁培养。

2.2。定量实时聚合酶链反应

总RNA提取ESC和EBs使用超净组织和细胞RNA隔离设备(莫生物实验室;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。0.5μ克总RNA与Mu-MLV逆转录酶用于cDNA合成装备和益生元(dT)引物根据制造商的指示(美国热费希尔科学Inc .)。qPCR反应进行的LightCycler480仪器使用LightCycler®480 DNA SYBR绿色我主人(瑞士罗氏公司)。程序步骤是前面描述的17]。数据被规范化glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) mRNA表达和表现为2^−∆cq。用于个人标记的引物序列如下:

巢蛋白:

F-CATACAGGACTCTGCTGGAGG R-GAGAAGGATGTTGGGCTGAG;

Ascl1 / Mash1:

F-GGTCTCGTCCTACTCCTCCG R-GCTGCCATCCTGCTTCCAAA;

Hif1α:

F-TTCTGGATGCCGGTGGTCTA R-AAACCATGTCGCCGTCATCT;

Tcf1 / Tcf7:

F-CAGCTCCCCCATACTGTGAG R-TGCTGTCTATATCCGCAGGAA;

Lef1:

F-TCCTGAAATCCCCACCTTC R-ACCCGTGATGGGATAAACAG;

Tcf3 / Tcf7like1:

F-CTGAGCAGCCCGTACCTCT R-AGGGGCCATTTCATCTGTAG;

Tcf4:

F-ATTTGTGGCCATTGAAGGTT R-GTCCCTAAGGCAGCCATTC;

Axin2:

F-GCGCTTTGATAAGGTCCTGG R-TCATGTGAGCCTCCTCTCTTTT;

NeuroD1:

F-AACCTTTTAACAACAGGAAGTGGA R-CTCATCTGTCCAGCTTGGGG;

Gapdh:

F-AAGGGCTCATGACCACAGTC R-CATACTTGGCAGGTTTCTCCA。

2.3。免疫印迹、免疫沉淀反应和免疫组织化学

细胞细胞溶解使用SDS缓冲区(50毫米Tris-HCl, 100毫米氯化钠,10%甘油、1% SDS, 1毫米EDTA,蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏公司;瑞士巴塞尔)pH值7.4)在特定时间间隔(ESC 5 d 5 + 5 d,和5 + 10 d)。蛋白质分离使用8%或10% sds - page凝胶,然后转移到一个聚乙烯二氟化物膜(默克密理博;达姆施塔特,德国),阻止了5%的低脂牛奶TBS-T缓冲区(Tween20三,0.05%)。选择蛋白的检测是使用以下具体表现主要抗体:鼠标单克隆anti-TUJ1 (Sigma-Aldrich T5076),鼠标单克隆anti-PAX6 (DSHB,爱荷华大学,沉积Kawakami a),兔多克隆anti-BLBP (Abcam, 27171),兔多克隆anti-HIF1α(127309)Genetex鼠单克隆anti-vinculin (Sigma-Aldrich V9264),鼠标单克隆抗β连环蛋白(BD, 610153),兔多克隆anti-phospho -β连环蛋白(CS,编号为9561),山羊多克隆抗β肌动蛋白(Santa Cruz),山羊多克隆anti-laminB (Santa Cruz),兔单克隆anti-AKT (CS,号码4691),和鼠标单克隆anti-LewisX / Forse1 (DSHB,爱荷华大学,由帕特森由P.H.沉积)。下面的二次抗体(所有从Sigma-Aldrich抗免疫球蛋白)与过氧化物酶共轭使用:山羊anti-mouse (A4416),山羊anti-rabbit (A0545)抗体和兔(A4174)。神经标记的蛋白质含量都规范化vinculin信号;磷酸化水平β连环蛋白被规范化β连环蛋白的信号。蛋白质的光学密度乐队被ImageJ量化软件(https://imagej.net/Contributors美国国家卫生研究院)使用凝胶分析功能,和峰面积外推值进行统计分析。

免疫沉淀反应分析中,我们使用一个修改协议受雇于Bryja博士的研究小组。三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.4;50毫米三,150毫米氯化钠,1毫米EDTA, NP-40 0.5%, 5%的甘油,1毫米德勤,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏公司;瑞士巴塞尔)用于温柔细胞溶菌作用和蛋白质复杂的保护。两岁EBs细胞溶解45分钟在冰,混合,离心10分钟1500在上层清液分离细胞质分数。结果颗粒溶解在裂解缓冲,用6 s(低密度),离心10分钟上层清液分离核酸蛋白质分数。分数与抗原样本与anti-HIF1孵化α(或兔多克隆抗体为非特异性免疫球蛋白结合控制,细胞信号编号为3900),添加到洗满磁珠/ G蛋白混合物,并在4°C孵化过夜。第二天,所有的样品都洗彻底去除游离蛋白质分数,珠子煮5分钟在Laemmli缓冲区,并通过免疫印迹变性样本进行了分析。每个分数采样前的磁珠为后续世行分析和总蛋白的评估。

免疫组织化学分析之前,细胞/ EB殖民地附着在玻璃表面在PBS洗2次,(wt / wt)固定在4%多聚甲醛(PFA) 15分钟/ 4°C,在PBS再次清洗,孵化1% BSA / 0.3% Triton X 1小时/ RT。阻止反应后,主要的抗体被溶解在1% BSA / 0.3% Triton一夜之间X 4°C。第二天,样本洗3次在PBS和孵化二级抗体为1小时/ RT。在这之后,样本洗3次在PBS和样本安装使用VectaShield H1000(向量实验室,伯林盖姆)。免疫荧光可视化是一个奥林巴斯样品形貌共焦显微镜。主要抗体TUJ1为西方墨点法是一样的;二次抗体anti-rabbit Alexa萤石568头驴。

2.4。细胞转染和荧光素酶记者分析

EBs转染0天使用聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich裴,408727)。使用下面的质粒dna(浓度为0.8μg / 12-well板),单独或通过cotransfection,如果需要:质粒表达非降解性βS33连环蛋白突变(H.R. Korswagen教授、乌得勒支大学、荷兰),质粒overexpressing鼠标Hif1α(瑞典卡罗林斯卡医学院Poelinger实验室教授),和空pcDNA3控制转染质粒。荧光素酶报告实验被用来量化β-catenin-mediated转录激活幼童EBs的TCF / LEF结合位点。聚集在琼脂培养microwells (12-well板)转染0和0.8天μg Super8XTOPflash / Super8XFOPflash荧光素酶质粒(美国华盛顿大学教授R.T.月球)与0.4μg Renilla荧光素酶报告质粒(WI Promega,麦迪逊,美国)。转染后48小时,记者活动测量使用Dual-Luciferase记者分析系统工具包(Promega)。分析每个实验条件进行了一式三份。荧光素酶活性Renilla SuperTOP / FOPflash规范化的荧光素酶信号。

2.5。统计分析

结果进行统计分析(学生的t以及;单向方差分析与图基的多重比较期末测验),和统计上显著的差异定义如下: (), (), ()。结果意味着+ SEM。

3所示。结果

3.1。Hif1α缺乏与异常的神经发生在体外

我们首先探讨了发展命运的首选Hif1α^−−/EBs在自发分化。RT-qPCR EBs分化了10天的分析贴壁培养(5 + 10 d)揭示了大幅增加在早期神经发生,相关基因的表达等巢蛋白,Neurogenin 1,ASCL1(图1(一))。神经谱系分化的转变Hif1α^−−/EBs也证实了在蛋白质水平,显示出显著增加neuroectodermal BLBP标志和未成熟神经元TUJ1(图的标记1 (b))。免疫组织化学染色证实增强表达式内TUJ1有区别的Hif1α^−−/EB殖民地(补充图一个)。我们也检查的形态分化使用光学显微镜,观察到很多EB殖民地Hif1α^−−/从外围殖民地发芽多个神经突预测,相比之下wt殖民地,我们发现几乎没有探明(图1 (c)C;补充图B)。这些结果强调EBs源自ESC缺乏这一事实Hif1α基因通常更喜欢在自发分化神经家族的命运。

3.2。稳定HIF1α在EBs阻止神经分化

经过一天的细胞聚集形成(图1 (c)),骨料形状在球形瀑样和种植agar-coated板(图5天1 (c)B)。我们没有观察到显著差异在形态或大小Hif1^−−/EBs相比wt(补充图C)。有趣的是,我们观察到神经在5-day-old表型的变化Hif1α^−−/EBs。利用免疫印迹分析,我们发现的转录因子PAX6显著增加Hif1α^−−/EBs,早期神经发生的一个重要和具体监管机构,和相同的增长趋势也显示了神经标记BLBP和TUJ1(图2(一个))。重要的是,瞬态敲入Hif1α期间的形成Hif1α^−−/EBs导致PAX6明显降低,BLBP, TUJ1蛋白质水平(图2 (b))。这清楚地表明,HIF1的缺失α引起的浓缩neuroectodermal /神经元自发分化期间人口和HIF1的招聘α这一时期是阻止这种异常表型的足够的冲动。我们另外检查是否增加的神经发生中观察到Hif1α^−−/EBs会导致别人的表达下调血管内皮生长因子(VEGF),一个强有力的血管生成和神经营养因子,和下游HIF1的目标α信号(18,19]。我们发现VEGF增加EBs在分化十天(6-13d)部分降低neurophenotypeHif1α^−−/EBs,尤其是LewisX水平,神经干细胞/祖细胞的标记;然而,我们很难看到减少神经标记Hif1α^−−/EBs VEGF时添加在EBs(补充图的形成D)。这使我们坚信一定有另一个信号通路依赖HIF1α占在EB形成神经表型的封锁。

3.3。增加Neurophenotype在Hif1α^−−/EBs与减少核相关联β连环蛋白活性

的参与β连环蛋白通路在自发分化和神经发生早期已经证明了作者(《et al ., (8];Naito et al ., (9];十Berge et al ., (10])。然而,缺氧/ HIF1之间的直接连接α和β连环蛋白在这一过程中尚未彻底调查。我们使用TOP-FLASH荧光素酶测定来监测核的活动β连环蛋白,这是基于的能力β连环蛋白激活几个TCF / LEF绑定在荧光素酶基因启动子区域20.]。首先,我们监控β在ESC连环蛋白活性在低氧条件下与TOP-FLASH质粒转染。24小时后的增长在缺氧条件下(1%啊₂),我们观察到的荧光素酶活性显著高于ESC在常氧条件下培养(图3(一个));更重要的是,荧光素酶活性的增加是HIF1显然依赖于稳定α在缺氧。进一步调查HIF1之间的联系α和β连环蛋白在自发分化内生的水平,我们关注幼童EBs (2 d)的分析,我们清楚地发现HIF1的稳定α蛋白,这表明缺氧环境(图3 (b))。自然缺氧条件在EBs已经演示了在其他地方(6]。在EBs缺乏Hif1α基因,内生β连环蛋白信号作用明显降低Hif1α敲入了荧光素酶活性控制水平(图3 (c))。我们还执行RT-qPCR分析基因的TCF / LEF蛋白质家族,这是直接参与coactivation /镇压β连环蛋白下游靶基因(图3 (d))。我们观察的差别明显对这些Lef1在Hif1α^−−/EBs,虽然结果并没有显示出任何实质性的变化Tcf1,Tcf3,或Tcf4基因的表达。另一方面,Hif1α^−−/EBs体现明确upregulation颈板转录因子的重要NeuroD1。总的来说,这些结果表明,稳定HIF1α在EBs明显活跃β连环蛋白的抑制信号以及proneuronal细胞程序在第一天的自发分化。

3.4。HIF1α变弱的神经表型的稳定β连环蛋白在EBs

因为以前的结果建议HIF1的参与α在神经血统的转变以及上游的监管β连环蛋白,我们与质粒转染增长EBs包含构造的组成型表达β连环蛋白和分析5-day-old EBs的蛋白质参与神经分化。我们观察到的总体抑制神经发生Hif1α^−−/EBs后β连环蛋白异位超表达(图4(一))。PAX6蛋白质nontransfected相比减少了近3倍Hif1α^−−/EBs。同时,BLBP蛋白质显著降低Hif1α^−−/EBs后β连环蛋白转染。TUJ1的水平,一个明确的指标未成熟神经元,减少5倍以上β连环蛋白转染,不像BLBP和PAX6,明显低于HIF1之后α转染,显示相关的影响β连环蛋白在神经元的命运。这也证实,β连环蛋白,在缺乏稳定HIF1,期间能够衰减neurophenotype自发分化。

然后,我们旨在搜索深入HIF1之间的联系α和β连环蛋白在自发分化处理的退化状态β连环蛋白在Hif1α^−−/EBs。令人惊讶的是,我们发现Hif1α^−−/EBs明显更高级别的β连环蛋白磷酸化Ser33/37 / Thr41,修改目标蛋白的泛素化,从而降低在细胞质中21]。重要的是,敲入的Hif1α在Hif1α^−−/EBs p水平的下降β连环蛋白,甚至低于(图的控制水平4 (b))。检查是否HIF1α直接绑定到β连环蛋白,我们进行免疫沉淀反应分析核分数的幼童EBs,稳定HIF1的地方α已经被证明是参与β连环蛋白信号(图3)。核分数分析显示清晰的HIF1共同沉淀α和β连环蛋白相比,免疫球蛋白输入控件(图4 (c)),建议直接相互作用的蛋白质。我们也没有观察到细胞质中的任何差异β连环蛋白水平HIF1α淘汰赛表明神经表型的观察到的变化有关,而与核β连环蛋白功能(图4 (c),B)。从这些结果,我们得出这样的结论:稳定HIF1α在细胞内生长EBs能够稳定和绑定β连环蛋白,从而导致增强的核β连环蛋白信号在自发分化。

4所示。讨论

在这项研究中,我们目前的证据表明,转录因子HIF1α在神经中起着基础性作用在ESC的自发分化命运。我们发现EBs源自ESC烧灼Hif1α基因进行了异常发展转向分化的神经血统后十天贴壁培养。重要的是,增加神经分化中出现Hif1α^−−/EBs后只有5天的培养和敲入Hif1α在EB形成了神经表型观察野生型EBs。西蒙教授的小组的研究表明,EBs HIF1复杂表现出不适当的中胚层的中断和hemangioblast分化(5]。这是最近发现EBs缺乏支持Hif1α基因表现出重要的内胚层的放松管制和中胚层的谱系标记和受损cardiomyogenesis [13]。李等人提出的证据表明,EBs自然可以维持一个低氧环境调节内胚层、中胚层的标志而不是外胚层;这种表型甚至加强了EBs影射的额外缺氧时两天的混战Hif1α废除这种血统转移(6]。总的来说,这些结果支持我们的结论HIF1α是一个关键的转录因子参与决定十字路口的ESC在自发分化,其稳定导致优惠内胚层的/中胚层的命运而抑制分化成neuroectoderm。

我们没有观察到神经异常表型的回归VEGF治疗后恢复正常的生理条件Hif1α^−−/ESC在EB的形成。VEGF被形容为主要HIF1α端依赖效应负责vascular-lineage承诺在EBs影射缺氧(1%6]。我们假设长期孵化1%低氧可以人为地增加HIF1的稳定α随后引发强烈的VEGF的表达,进而影响更高vascular-lineage承诺,与我们的实验条件,反映了EBs的自然“semihypoxic”微环境。

在这项研究中,我们显示了HIF1之间的联系α和β连环蛋白调控的神经血统EB成熟期间封锁。我们证明了稳定HIF1α在EBs自然保护β连环蛋白的降解,增加其核活动与神经有关家族命运的封锁。此外,免疫印迹清晰识别β-catenin-HIF1α蛋白质相互作用在wt EBs的核分数。有很多证据HIF1发育和癌症生物学α在缺氧条件下伴随着Wnt信号通路β连环蛋白,具有实质性影响细胞命运和生存。在结肠癌和肝癌,HIF1α被发现与TCF-4争夺直接绑定吗β连环蛋白增强转录HIF1α活动(22,23]。在肌肉缺血性损伤后再生,HIF1α负调控骨胳肌发生通过规范化的抑制Wnt信号(24]。然而,多个发展研究的结果,而缺氧后的激活规范Wnt信号HIF1a稳定。ips的衍生胚胎尸体影射在缺氧表现出受损的心肌细胞的成熟;这样的EBs增加HIF1展出α信号和Wnt正则表达式和两HIF1 colocalization目标α和β连环蛋白在核分数(25]。在ESC受到缺氧条件下,HIF1α发现提高Wnt /β连环蛋白信号通过绑定在启动子区域的元素一定是β连环蛋白下游效应器LEF-1和TCF-1 [15]。不同的是,我们在这里表明增强β连环蛋白信号活动,而出现在增加β由HIF1连环蛋白核易位后稳定α蛋白质在细胞质中。这些结果表明,细胞的结果β连环蛋白和HIF1α交互是高度依赖于组织类型、发展阶段,以及病理生理条件下,氧气水平。甚至可以推测HIF1之一α似乎有抑制作用在致癌作用的Wnt典型信号,而它不支持β连环蛋白信号和下游目标在早期胚胎发生和神经发生。

的作用β连环蛋白在神经在EB分化表型转变证明了几种结果。的淘汰赛Hif1α基因在神经表型的诱导的差别以及对这些β连环蛋白信号。重要的是,短暂的增加β连环蛋白表达是一个足够的信号抑制的神经分化Hif1α^−−/EBs。看来的影响β连环蛋白超表达的减少神经元标记TUJ1似乎高于HIF1之后α重新引入。这些结果,而支持β连环蛋白在HIF1α作为最终监管效应神经命运封锁。的参与β连环蛋白在神经命运封锁在ESC分化和发展已经被几个作者。预防β连环蛋白信号损失后Wnt1 / pLRP6受体或之后添加Wnt /β连环蛋白通路抑制剂DKK1导致增加neuroectodermal分化和人口TUJ1阳性细胞在分化ESC (26]。治疗可溶性SFRP2蛋白质、规范化的拮抗剂Wnt信号,刺激神经祖标记等的表达Pax6或Ngn2的出现,以及在EB TUJ1蛋白形成的细胞免疫反应性的;治疗Wnt1配体或GSK3抑制剂抑制神经元分化(8]。焦消除β连环蛋白在神经前体细胞胚胎的大脑皮层心室区在活的有机体内导致过早神经元分化(27]。其他研究直接证明了核之间的联系β连环蛋白和神经分化在EBs和鼠标的发展。海尔哥哥从ESC废除核形成β连环蛋白信号伴随着增加分化成神经元,如图所示,大量的TUJ1-positive总量。此外,胚胎来自ESC线异常发达,增加神经前体细胞和神经元的标志物如PAX6和N-CAM内胚胎层(28]。神经细胞表型的诱导与废除核EBsβ连环蛋白与我们的研究结果是一致的Hif1α^−−/EBs的表达下调β连环蛋白信号表现出显著增加在几个神经元标记在EB形成贴壁分化期间以及之后。在我们的例子中,我们假设的观察效果β连环蛋白在神经封锁在早期自发分化命运,而由于其作用于一个内生/生理水平的衰减β连环蛋白信号Hif1α^−−/EBs导致增加神经发生。

总的来说,我们的数据清楚地表明,HIF1的稳定α结果颈板封锁的基因,包括NeuroD1,以及在增强β连环蛋白下游效应Lef1。类似的规定在缺氧胰腺被发现β肽的表达NeuroD1基因被稳定HIF1镇压α,而击倒的Hif1α导致其upregulation [29日]。此外,β连环蛋白可能积极调节HIF1α信号通过直接互动,也是记录在其他地方(22- - - - - -24]。然而,正如上面提到的,我们的数据的可能性β连环蛋白单独有潜力在EBs缺乏HIF1调节干细胞的命运α。转录因子的upregulation PAX6在早期神经祖细胞与重要proneuronal基因的表达增加有关,包括Ascl1或NeuroD1(30.]。因此,我们考虑PAX6水平中的观察到的变化作为一个早期和至关重要的监管一步确定后续的神经在EBs的命运。转录因子的upregulation PAX6的差别后,对这些基因β连环蛋白被其他作者记录(8,28]。更重要的是,的异位表达β连环蛋白/ LEF1皮质神经前体细胞融合蛋白的小鼠胚胎延迟几个神经源性基因的表达,包括PAX6,虽然条件消融β连环蛋白加速PAX6[的表达31日]。因此,激活Lef1基因表达受β连环蛋白似乎是至关重要的上游刺激在EBs抑制神经元的激活项目。然而,神经的确切分子机制HIF1的抑制作用α和/或β连环蛋白在EBs应该被进一步研究阐明。

5。结论

总之,我们特此证明HIF1的稳定α块的退化β连环蛋白在细胞质和增加β连环蛋白核活动,导致神经分化的自然发育封锁ESC(图5)。这些结果带来强有力的证据表明,内生缺氧利基在EBs增长有着至关重要的影响在自发分化干细胞发育命运。因为HIF1α和β连环蛋白基本因素在发育和癌症生物学,我们相信这些在体外研究结果有助于理解神经分化的机制在生理和病理生理条件下。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

确认

这项研究受到了捷克科学基金会(GACR)(项目15 - 13443 - y)(首席研究员:约瑟夫Večeřa)和程序部分的“新毕业的就业医生的科学科学卓越”(批准号CZ.1.07/2.3.00/30.0009) (Josef Večeřa),由教育部青年和体育部长的捷克共和国(项目号LQ1605转2)(LukašKubala)。作者感谢博士Vitězslav Bryja教授和他的团队在理学院,马萨里克大学,布尔诺,为他们提供大多数质粒和有价值的建议在实验。

补充材料

补充数据:(A)免疫组织化学染色(A)紧凑的EBs殖民地或(b) EBs resuspended单个细胞显示增加TUJ1的表达式Hif1α^−−/10天后贴壁培养的分化。(B)详细的图像捕获光显微镜下显示Hif1α^−−/EBs分化了10天。有几个神经突预测从殖民地指示出成熟的神经元。(C)代表光学显微镜图像显示了5天EBs培养琼脂。没有明显的大小或形态学差异wt和Hif1α^−−/EBs观察。酒吧规模:200μm。(D)免疫印迹分析EBs分化在贴壁培养10天。重组VEGFα也添加到细胞在EBs (0-5d)期间或之后分化形成贴壁培养(6-13d)。神经干细胞标记LewisX和早期神经元标记TUJ1进行分析。一种蛋白激酶作为蛋白质加载控制。(补充材料)

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