通过细胞间黏附到牙周韧带来源的成纤维细胞增强间充质干细胞的抗炎和成骨能力

摘要

间充质干细胞(MSCs)参与抗炎事件和组织修复;这些功能是通过它们在各种趋化因子的作用下迁移或归巢到炎症组织而被激活的。然而，炎症组织中MSCs与其他类型细胞相互作用的机制尚不清楚。我们研究了牙周韧带成纤维细胞(PDL-Fs)在调节骨髓源性(BM-)间充质干细胞的抗炎和成骨能力中的作用。炎性细胞因子刺激PDL-Fs可显著增强单核细胞趋化蛋白- (MCP-)1的表达。MCP-1可诱导骨髓间充质干细胞的迁移能力，但对PDL-Fs无诱导作用。MSCs与PDL-Fs直接接触共培养后，抗炎细胞因子和炎症细胞因子的表达水平分别升高和降低。此外，直接接触共培养增强了MSC标记物的表达，这些标记物在MSCs的自我更新和多能性维持中发挥重要作用，进而诱导细胞成骨能力。这些结果提示MCP-1诱导骨髓间充质干细胞向PDL炎症组织迁移和归巢。随后MSCs与PDL- fs的粘附发挥免疫调节作用，在伤口愈合过程中终止炎症，并上调干细胞标志物的表达，增强MSCs的干性，从而促进受损PDL组织的成骨。

1.介绍

间充质干细胞（MSCs）是成型干细胞，其能够区分中的间充质细胞，例如成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞和成纤维细胞，同时保留自我更新和迁移能力[1］．Friedenstein等人最初在骨髓中发现了间充质干细胞[2，3.］．随后，从脂肪组织中分离出间充质干细胞[4，胎儿肝[5]、脐带血及动员外周血[6，胎儿肺[7),胎盘(8，脐带[9，10、牙髓[11，滑液膜[12]、牙周韧带(PDL) [13),子宫内膜14，小梁和致密骨[15，16］．

MSCs在体内被组织损伤激活后，通过自我更新、迁移和分化等多种过程促进组织修复。细胞迁移与干细胞归巢密切相关。干细胞治疗依赖于干细胞适当的归巢和移植能力。趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1/CCL2)和/或基质细胞源性因子-1 (SDF-1/CXCL12)及其受体如CCR2和CXCR4促进MSCs的有效归巢。CXCR4配体SDF-1对人及小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)迁移具有剂量依赖效应[17- - - - - -19］．Kanbe等人[20.]显示骨关节炎和类风湿关节炎中滑膜成纤维细胞分泌高水平的SDF-1。这增加了在关节炎关节中分泌的SDF-1及其作为间充质干细胞趋化剂的作用，指导间充质干细胞归巢的可能性。此外，我们之前的研究表明，牙髓和PDL细胞分泌的SDF-1保留了促进骨髓间充质干细胞募集的能力[21- - - - - -23］．MCP-1是氧化应激条件下诱导的趋化因子[24］．最近，我们提出了一种新的机制，通过瘙痒反应基因1 (SCRG1)/骨髓基质细胞抗原1 (BST1)轴，通过自分泌/旁分泌方式激活FAK/PI3K/Akt信号通路，促进BM-MSCs的迁移[25］．我们的结果还表明，scg1 /BST1轴通过刺激和维持MSCs的干细胞活性来促进MSCs的组织再生能力。

最近的许多研究表明MSCs具有免疫调节特性[26，27］．移植间充质干细胞的免疫抑制作用也在急性严重移植物抗宿主病中得到证实[28]及多系统萎缩[29］．此外，MSCs可以诱导外周耐受并迁移到受损组织，在那里它们可以抑制促炎细胞因子的释放，促进受损细胞的存活[26］．例如，MSC移植在急性肺损伤中的疗效已被观察到[30.，心肌梗塞[31]， 急性肾功能衰竭 [32]，脑缺血[33和阿尔茨海默氏症[34］．MSCs可直接抑制T淋巴细胞和小胶质细胞的增殖，并可负向调节树突状细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的细胞因子分泌谱[35- - - - - -38］．

之前，我们报道了与MCP-1相关的炎症相关趋化因子的表达水平因IL-1的刺激而增强β和/或牙龈成纤维细胞中的IL-6/sIL-6R [39］．本研究旨在探讨pdl -成纤维细胞(PDL-Fs)对骨髓间充质干细胞抗炎和成骨能力的调控机制。我们检测了炎性细胞因子白细胞介素-1刺激的PDL-Fs中MCP-1的表达β、IL-6/可溶性IL-6受体(sIL-6R)或肿瘤坏死因子(TNF)-α，及其对体内MSCs向PDL炎症组织募集的影响。此外，我们使用了MSCs和PDL-Fs之间的直接接触共培养系统来检测抗炎和炎症细胞因子以及已知在MSCs自我更新和多能性维持中发挥重要作用的干细胞标志物的表达。这些结果可为进一步了解骨髓间充质干细胞向PDL炎症组织迁移和归家的分子机制和关键因素提供依据，为干细胞治疗促进受损PDL组织的骨再生提供参考。

2.材料和方法

2．1．细胞因子

重组人il - 1β、il - 6、TNF -αMCP-1和SDF-1α均购自Miltenyi Biotec(德国Bergisch Gladbach公司)。用10 ng/mL的IL-1处理细胞β、il - 6、TNF -αMCP-1和SDF-1α在不同的时间点。可溶性IL-6受体(sIL-6R)由prospect - tany TechnoGene (Ness Ziona, Israel)提供。IL-6与10 ng/mL的sIL-6R一起加入[39］．

2.2。细胞培养

我们之前报道了从表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠骨髓源自骨髓的MSC线（GFP）的制定和培养方法的进程[40，41］．SG2细胞是一种转化生长因子(TGF)β-responsive MSC line, were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; BI Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) at 37°C under hypoxic conditions (5% O₂, 5%的公司₂和90％n₂)．大鼠PDL-Fs的分离和单细胞源性培养(SCDCs)的建立已在前面进行了描述[42］．SCDC2细胞在含有2 mM谷氨酰胺(100x溶液;Gibco)， 10%胎牛血清，10 ng/mL成纤维细胞生长因子(FGF)-1 (R&D Systems Inc.， Minneapolis, MN, USA)， 15μg/mL肝素(Sigma-Aldrich)和青霉素(Gibco, Carlsbad, CA, USA)在5% CO的湿化气氛中₂在37°C。人牙龈成纤维细胞(HGFs)在添加了10%胎牛血清(BI生物工业)的DMEM (Sigma-Aldrich)中培养，37°C, 5% CO₂根据我们以前的报告[39］．

2．3.Coculture系统

SG2细胞和SCDC2细胞或HGFs分别在直接共培养和间接共培养体系中培养。直接共培养(CC)以50:50 (4.0 × 10)的比例在单层细胞中进行⁵cell/well)在六孔板(summilon) [43］．在transwell共培养系统(TW)中进行间接共培养[44］．TW共培养系统由一个聚碳酸酯跨孔室组成，该跨孔室可插入标准24孔板的孔中。SG2细胞(1.0 × 10⁵细胞/孔)播种于24孔培养板的底部。然后，SCDC2细胞或HGFs (1.0 × 10)⁵细胞/孔)播种于上膜(孔径为0.4μM)跨井室。细胞保存在含2 mM谷氨酰胺(100x溶液)、10%胎牛血清、10 ng/mL fgf - 1,15的Ham’s F-12中μg/mL肝素和青霉素在5% CO的湿化气氛中₂在37°C。

2.4。定量逆转录 - 聚合酶链反应（RT-QPCR）

根据制造商的说明，用ISONogen试剂（Nippon Gene，Toyame，Japan）和第一站CDNA分离出全rNA与ISOGEN试剂（Nippon Gene，富山，日本）和第一支代CDNA合成。RT-QPCR在热循环仪骰子实时系统（Takara Bio）上进行Sybr Premix ExTaq II（Takara Bio）和特定的寡核苷酸引物（表1)使用两步循环程序(95°C变性5 s和60°C退火和拉伸30 s) 40个循环。每一次PCR，以50 ng总RNA为模板，0.4 ngμ每个引物对的M。将mRNA表达量归一化至甘油醛3-磷酸脱氢酶水平(Gapdh)，用ΔΔCq法计算每个样本中各mRNA的相对含量。相对于对照组，mRNA的相对表达量随fold的增加或减少而增加。

2．5．酶联免疫吸附试验(ELISA)

使用或不使用10 ng/mL IL-1刺激SCDC2细胞βIL-6或TNF-α48 h。用夹心ELISA试剂盒测定大鼠MCP-1 (R&D Systems Inc.)和大鼠SDF-1分泌的趋化因子的数量α(台北市亚诺瓦)。SG2细胞与SCDC2细胞直接共培养48 h。SG2细胞产生的细胞因子通过小鼠IL-10 (R&D Systems Inc.)、小鼠TGF-的夹心ELISA试剂盒进行量化β(Abcam, Cambridge, UK)和小鼠IL-6 (R&D Systems Inc.)的特异性抗体，不与大鼠IL-10、TGF-发生交叉反应β, il - 6。根据制造商的说明测量目标蛋白。采用MPR-A4i酶标仪(Tosoh Corp, Tokyo, Japan)测定吸光度。

2．6．流式细胞术分析

SG2细胞直接或间接与SCDC2细胞共培养，悬浮于含0.5%胎牛血清和2 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。用藻红蛋白- (PE-)偶联的抗小鼠SCA-1、CD44和CD90抗体(Miltenyi Biotec)在4°C黑暗中孵育细胞1小时。采集采用EPICS XL ADC系统(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)。门控后根据GFP的荧光测定SG2细胞相对于PE的荧光强度。

2.7。Transwell迁移分析

迁移分析如前所述进行[25]，采用直径6.5 mm的细胞培养插片(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)μ米孔隙过滤器。电池(5.0 × 10⁴细胞/孔）暂停在350 μL含0.1%牛血清白蛋白的无血清DMEM (Sigma-Aldrich)，并放入上孔;600年μ将10% fbs补充的DMEM(含或不含10 ng/mL MCP-1和100 ng/mL抗MCP-1中和抗体(Abcam))置于transwell板下孔。37℃缺氧条件下孵育6 h后，用棉签刮去未从滤器上侧迁移的细胞，用4%多聚甲醛PBS固定膜。PBS洗涤后，将迁移到膜下侧的细胞用DAPI (1: 1000;Kirkegaard & Perry实验室，Gaithersburg, MD, USA)，并在5个高倍场的荧光显微镜下计数(400倍放大;奥林巴斯IX70;奥林巴斯公司，东京，日本)。

2.8。具备干细胞调查

SCDC2细胞作为喂养细胞，预培养融合后用甲醇固定。SG2细胞在固定饲料SCDC2细胞上共培养。

成骨和成脂分化在我们之前的论文中有报道[25］．CC共培养的SG2细胞在成骨诱导培养基中孵育10天。茜素红S (Sigma)染色评价骨基质矿化。茜素红S在8 mM Na中加入10%氯化十六烷基吡啶(Sigma)提取₂HPO₄(默克密理博，达姆施塔特，德国)和150毫米KH₂阿宝₄采用MPR-A4i酶标仪在540 nm处测定吸光度(Tosoh Corp.)。为了诱导成脂分化，将CC共培养的SG2细胞在成脂分化培养基中培养5天。脂滴用Oil Red O (Sigma-Aldrich)染色。油红O染色采用二甲基亚砜(DMSO, Sigma)从脂滴中提取定量，在540 nm处测定吸光度。

使用比色测定分析细胞增殖，用于在活细胞中通过线粒体脱氢酶切割四唑鎓盐WST-1（Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）。将CC共培养的SG2细胞在生长培养基中培养6天。根据制造商的说明书测量MPR-A4I微板读取器（Tosoh Corp.）对450nm的吸光度来评估细胞增殖。

SG2细胞CC共培养48 h，用含1 mM EDTA的0.25%胰蛋白酶剥离细胞，如前所述考察细胞的迁移能力。

2.9。统计分析

所有实验至少重复三次。显示有代表性的图像或数据。数值数据用平均值±标准差表示。对照组和治疗组之间的平均值和百分比差异使用成对双尾学生进行统计分析测试,被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.炎症因子促进SCDC2细胞中MCP-1的产生

如图所示1， IL-1等炎性细胞因子刺激可显著促进MCP-1 mRNA表达和蛋白分泌βIL-6和TNF-α在PDL-F SCDC2单元格(图1(一)和1 (b))．相反，SDF-1的分泌α与MCP-1类似，MCP-1是参与MSCs迁移的趋化因子。在SCDC2细胞中，这些细胞因子的刺激并没有增强(图)1 (c)和1 (d))．这些结果表明炎性细胞因子特异性地促进了PDL-Fs中MCP-1的产生。

３．２．MCP-1特异性诱导SG2细胞而非SCDC2细胞的迁移

MCP-1是一种已知的趋化因子，可以通过与其独特的受体CCR2相互作用而强烈地吸引MSCs。因此，我们研究了MCP-1刺激小鼠骨髓间充质干细胞系SG2的迁移活性。MCP-1刺激的跨well迁移的SG2细胞数量是对照细胞的两倍多(图)2(一个)）;这种诱导被抗mcp -1中和抗体完全抵消。相比之下，MCP-1没有诱导SCDC2细胞的迁移活性(图)2 (b))．这些结果表明MCP-1特异性诱导MSC的迁移活性而不是PDL-FS的迁移活性。

3．3．与SCDC2细胞直接共培养可增加SG2细胞中抗炎因子的表达

由于炎性细胞因子的刺激增加了PDL- fs分泌的MSC趋化剂MCP-1，我们假设MCP-1迁移的MSCs会回到炎性PDL组织，并与PDL- fs直接接触。在MSCs和PDL-Fs共培养体系下，利用小鼠特异性引物和抗体，采用RT-qPCR和ELISA检测SG2细胞中细胞因子的产生水平。抗炎细胞因子IL-10、TGF-的mRNA和蛋白表达水平β在CC与SCDC2细胞共培养时显著高于单独培养的SG2细胞(图3(一个)，3 (b)，3 (c),3 (d))．有趣的是，在CC共培养因HGF下没有观察到这些抗炎细胞因子的表达的增加。在TW Coculture System中未观察到来自SG2细胞的抗炎细胞因子的表达的这种促进。相反，在CC与SCDC2细胞的CC共培养物下，SG2细胞中炎性细胞因子IL-6的mRNA和蛋白表达水平明显低于单独培养的SG2细胞中的mR-6（图3 (e)和3 (f))，在TW共培养中未观察到。在CC与HGFs共培养下，IL-10的表达也受到抑制。这些结果表明，MSCs的抗炎活性是由MSCs与PDL-Fs之间的细胞间接触诱导的。然而，在任何培养条件下均未检测到另一种抗炎细胞因子IL-4的表达(数据未显示)。

3．4．与SCDC2细胞直接共培养可增强SG2细胞的MSC Stemness

已知MSCs上的细胞表面标志物CD44、CD90和SCA-1在维持MSCs干性方面独立或合作发挥重要作用[45- - - - - -47］．因此，我们检测了这些MSC标记在直接接触SCDC2细胞的SG2细胞中的表达。如图所示4(一)- - - - - -4 (c)，小鼠MSC标记物SCA-1，CD44和CD90在CC共培养系统下的SG2细胞中剧烈地表达，但不在单独培养的SG2细胞中。此外，骨质发生和脂肪发生分化的可能性（图4 (d)- - - - - -4 (f))以及迁移能力(图4 (g))在CC共培养体系下增强。有趣的是，与SCDC2细胞共培养降低了SG2细胞的增殖(图)4 (h))．一般而言，细胞增殖与不同细胞类型的分化及增殖/分化开关不兼容[48- - - - - -50］．因此，这些结果提示MSCs可通过直接粘附受损PDL组织中的PDL- fs而增强干细胞的干性。

4.讨论

我们之前的研究表明，IL-1刺激可促进促炎基因的表达β牙龈成纤维细胞中的IL-6 / SIL-6R [39］．此外，通过IL-1的共同刺激增强了炎症相关趋化因子如MCP-1的表达β和IL-6/sIL-6R在牙龈成纤维细胞中的表达。MCP-1由多种细胞类型产生，包括成纤维细胞和内皮细胞、上皮细胞、平滑肌、系膜细胞、星形细胞、单核细胞和小胶质细胞[51- - - - - -54］．在这里，我们聚焦于炎症细胞因子对PDL-Fs的影响，PDL-Fs是口腔组织的另一种组成细胞类型。结果表明，炎性细胞因子如IL-1的刺激可显著促进MCP-1的生成β、IL-6/sIL-6R和TNF-α在PDL-Fs和SCDC2细胞中。MCP-1通过趋化因子受体CCR2转导信号，CCR2主要参与单核细胞向炎症部位的募集，也在MSCs上表达[17，55］．以往的研究表明MCP-1通过transwell迁移实验诱导人及小鼠骨髓间充质干细胞的迁移[56，57]以及体内实验[58］．最近的一些研究表明MCP-1是与MSCs引起的免疫调节相关的因子之一。特别是MSCs分泌的MCP-1诱导了T淋巴细胞的fasl依赖性凋亡，而凋亡的T细胞又刺激巨噬细胞分泌更高水平的TGF-β它与CD4的生成有关⁺Foxp3.⁺调节性T细胞(treg) [59］．MSCs分泌的MCP-1也被证明通过抑制caspase 3对胚胎心肌细胞具有抗凋亡作用[56］．因此，有证据表明MCP-1的双重功能(促凋亡或抗凋亡)，这可能取决于msc靶向细胞周围的微环境。MCP-1已被证明以自分泌的方式诱导MSCs向不同的位点home，包括炎症、缺血性损伤、创伤或正在发展的恶性过程的位点，并且细胞在home后表现出免疫调节特征[56］．有趣的是，在本研究中，MCP-1特异性地诱导了BM-MSCs的迁移，而没有诱导PDL- fs的迁移，这表明MCP-1特异性地将MSCs招募到炎症部位，而不是受损PDL组织中的正常成纤维细胞。为了回应这一提议，我们通过RT-qPCR研究了CCR2在SG2和SCDC2细胞中的mRNA表达。虽然由于种类和引物不同，无法比较表达水平，但在两个细胞中都检测到了CCR2的mRNA(数据未显示)。因此，mcp -1诱导的迁移活性在SG2细胞和SCDC2细胞之间的差异状态可能是由于这些细胞之间在CCR2下游的细胞内信号转导机制的差异。我们假设PDL组织中迁移和归家的骨髓间充质干细胞与PDL炎症组织中的PDL- fs进行积极和直接的接触。MCP-1还参与免疫相关细胞(如巨噬细胞和T细胞)中炎症组织的归巢[24］．另一方面，MSCs通过对这些细胞的免疫抑制来抑制炎症[26，27］．因此，MCP-1诱导的归属于炎症组织的MSCs可以抑制炎症的慢性。

许多最近的研究表明，MSCs通过细胞间接触以及分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子的作用表现出免疫调节特性[26，27］．在本研究中，我们证明了抗炎细胞因子如IL-10和TGF-的产生β而炎症细胞因子IL-6的产生则减少。我们研究了SG2细胞与HGFs作为其他细胞类型共培养时产生的细胞因子。结果IL-10和TGF-的mRNA表达β与HGFs共培养的SG2细胞的抗炎细胞因子没有增强。而IL-6作为炎症因子的mRNA表达在HGFs和与SCDC2细胞共培养时均受到抑制。这些结果强烈提示牙周成纤维细胞SCDC2通过细胞间的细胞间粘附特异性地增强了抗炎细胞因子在MSCs中的表达。因此，粘附于PDL-Fs的MSCs可能在创面愈合过程中发挥免疫调节作用，促进炎症终止。TGF-是MSCs产生和组成性分泌的最显著的免疫调节细胞因子之一β．TGF-是一种多效细胞因子β调节多种基本细胞功能，包括增殖、分化、迁移、粘附和凋亡，这些功能影响许多生物过程，如发育、伤口愈合、癌变、血管生成和免疫反应[60.］．此外，IL-10是最常被讨论的与MSCs免疫调节能力有关的细胞因子。虽然MSCs最可能分泌IL-10的条件尚不明确，但已有研究表明MSCs分泌的因子可上调外周血单核细胞分泌IL-10的水平[61.]，以及致耐受性巨噬细胞[62.]和树突细胞[63.- - - - - -65.］．Yan等人[66.]报道了msc暴露的treg比未与MSCs共培养的treg具有更强的免疫抑制能力。他们进一步提出IL-10可能与mscs暴露的Treg细胞抑制能力增强有关。IL-6最近被证明是一种多效细胞因子，在许多过程中发挥关键作用，如调节免疫反应、造血、炎症、细胞存活、凋亡、细胞增殖和肿瘤发生[67.，68.］．表达gp130的细胞可以与IL-6/sIL-6R复合物结合，这一过程被称为转信号，这使得许多细胞群体容易受到IL-6的影响[69.，70］．小鼠和人的MSCs中均已证实IL-6分泌[71.，72.]， TNF诱导后检测α, il - 1β,干扰素γ，或自发地[63.，71.，73.- - - - - -76.］．

此外，小鼠MSC标记物SCA-1、CD44和CD90在骨髓间充质干细胞中表达水平因其与PDL-Fs的细胞间接触而上调。如上所述，在小鼠骨髓间充质干细胞中已鉴定出多种细胞表面标记物，包括CD44、CD90和SCA-1 [77.］．已知CD44正调控MSCs的生存和迁移[45］．先前的一份报告表明，CD90在MSCs承诺的衰减中发挥重要作用，可能导致其多能性的维持[46］．此外，已知SCA-1正调控MSCs的自我更新和生存[47］．因此，CD44、CD90和SCA-1在维持MSCs干性方面独立或合作发挥重要作用。事实上，在本研究中，直接与PDL-Fs共培养的BM-MSCs的成骨和成脂分化状态以及迁移能力都得到了增强。在被组织损伤激活后，MSCs通过迁移和分化等多种特性参与组织修复过程。在归巢到受损组织后，间充质干细胞和其他类型细胞之间的细胞-细胞粘附是体内间充质干细胞依赖性组织再生的必要条件。我们最近的研究表明，SCRG1/BST1轴维持了人骨髓间充质干细胞的干性和MSC标记物CD271的表达[25］．此外，我们证明另一个MSC标记CD106的表达依赖于细胞密度[78.，79.］．在这里，我们证明了MSCs与PDL- fs的直接粘附增强了MSCs的干性，从而导致受损PDL组织的修复和再生。

因此，我们证明了间充质干细胞可以通过直接粘附PDL-Fs而增强其抗炎和分化能力。我们的研究结果为利用间充质干细胞治疗牙周炎提供了新的临床策略。

5.结论

我们的研究结果为MSCs在PDL组织修复和再生中的作用机制提供了线索。简而言之，MCP-1是由成纤维细胞在PDL炎症病变炎性细胞因子刺激下分泌的，诱导骨髓间充质干细胞向PDL炎症组织迁移和归巢。这些黏附于PDL-Fs的间充质干细胞在创面愈合过程中发挥免疫调节作用，促进炎症终止。此外，MSCs与PDL- fs之间的这种黏附上调了MSCs中干细胞标记物的表达，可能导致MSCs的干细胞性增强，促进受损PDL组织的修复和再生。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

Keita Suzuki和Naoyuki Chosa对这篇论文贡献相同。

致谢

本研究部分由JSPS KAKENHI资助(nos. JP25463053和JP16K11654给Naoyuki Chosa, JP25893221和JP15K20633给Shunsuke Sawada, JP26670852和JP16H05534给Akira Ishisaki);2010-2014年，日本文部科学省为战略医学科学研究中心提供补助金;以及Keiryokai研究基金会的资助(批准号:120给Naoyuki Chosa和Shunsuke Sawada)， 2013。

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