比较微阵列分析增殖和分化的小鼠实体祖细胞

文摘

产后肠神经系统的神经祖细胞是未来的潜在来源细胞替代疗法的发展发育异常如巨结肠病。然而,对体内平衡和分化的分子机制推动这个细胞池。在这项工作中,我们进行了Affymetrix GeneChip实验来确定基因调控差异从新生儿肠神经祖细胞的增殖和分化早期老鼠。我们发现总共有1333调控基因与不同组的细胞机制参与细胞周期、细胞凋亡、神经细胞增殖和分化。正如预期的那样,我们发现了一个增强基因表达的抑制细胞周期进展以及一个增强的神经元和神经胶质的mRNA表达分化标记。我们进一步发现明显失活后的规范Wnt通路诱导细胞分化。综上所述,这些数据证明了各种分子机制发生在肠神经祖细胞的增殖和早期分化。

1。介绍

肠神经系统(ENS)基本上是一个独立的和高度复杂的神经网络在胃肠道中找到。其两大丛集成到肠道壁的分层结构,连同中央调制的影响,控制胃肠道蠕动,分泌,ion-homeostasis和免疫机制(1]。为了实现多种功能,存在由大量不同的神经元和神经胶质细胞类型和密切与平滑肌细胞和肌原性的起搏器卡哈尔间质细胞。此外,人口的存在神经干细胞或祖细胞已被确定在啮齿动物2,3]和保持增殖能力的人类,甚至在成年到老年(4,5]。因此不足为奇的正确功能实体以及监管肠神经祖细胞受到的影响无数的发射器,神经营养和生长因子的信号分子,细胞外基质成分,不完全表达的神经细胞类型6]。同样,控制实体的发展同样是复杂和突变的遗传程序可能导致致命的发育异常如巨结肠病(HCSR) [7,8]。

HSCR由aganglionic品质远端肠道导致危及生命的障碍在肠道蠕动。今天的治疗的黄金标准,手术切除肠段的影响,仍然是与问题相关的长期结果对自制(9]。为了提高治疗成功,提出了使用自体肠神经干细胞(10]。这依赖于概念在体外扩大肠神经干细胞来自小活检材料。然而,我们刚刚开始了解背后的分子机制神经干细胞生物学和如何将这些知识用于优化在体外培养条件(11,12]。

全基因组基因表达分析是一个有用的工具来检查遗传程序和细胞间的相互作用,广泛用于识别潜在的标记或信号机制特别是中枢神经系统neurospheres或癌症组织。此外,基因表达分析也有助于解开基因介词与HSCR [13,14),虽然努力迄今为止投入描述肠神经干细胞的基因档案在体外(15]。

在这里,我们使用了一个Affymetrix评估增殖的基因表达谱芯片分析小鼠肠神经干细胞及其分化早期变化在体外。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

细胞培养进行了如前所述[15]。动物的处理是根据机构图宾根大学的指导方针,符合国际准则。

新生儿(P0) C57BL / 6小鼠没有对性别被斩首,整个内脏都被删除。清除附着肠系膜后纵向含有肌间神经丛和圆形肌肉层会从小肠被剥夺了作为一个整体。组织碎和孵化胶原酶类型XI (750 U /毫升;Sigma-Aldrich Taufkirchen、德国)和dispase II (250μg / mL;罗氏诊断,德国曼海姆)溶解在汉克斯与Ca平衡盐溶液^{2 +}/毫克^{2 +}(哈佛商学院;PAA、派斯克、奥地利)30分钟在37°C。在酶解离组织精心磨碎每10分钟火抛光1毫升吸管小费。磨碎的第一步之前,细胞悬液处理0.05% (w / v) DNAse我(Sigma-Aldrich)。30分钟后,组织分裂停止增加胎牛血清(FCS);PAA)的最终浓度10% (v / v)的媒介。未消化的大组织40块被移除μm细胞过滤器(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。残余酶两个清洗步骤中被哈佛商学院在200 g。分离后,细胞在增殖培养基resuspended(杜尔贝科修改鹰的媒介与火腿的F12培养基(DMEM / F12;1:1;PAA)含N2补充(1:100;表达载体,达姆施塔特,德国)、青霉素(100 U /毫升;PAA),链霉素(100μg / mL;PAA)、谷酰胺(2毫米;PAA)、表皮生长因子(EGF);20 ng / mL;Sigma-Aldrich)和纤维母细胞生长因子(FGF;20 ng / mL;Sigma-Aldrich)。细胞被播种到6-well板块(BD生物科学)的浓度为2.5×10⁴细胞/厘米²。只有一次在播种之前,中补充了B27 (1: 50;英杰公司)。添加EGF、FGF日报和培养基交换每3天。所有种植步骤进行湿润孵化器在37°C和5%的公司₂。以下概述细胞培养协议如图1。细胞在增殖阶段的文化,形成称为enterospheres spheroid-like尸体。经过5天的增殖,自由漂浮enterospheres选择和转移到培养皿(Ø60毫米;Greiner生物1 Frickenhausen德国)在5毫升新鲜增殖培养基和扩散是进一步持续了4天。

单身自由浮动enterospheres (50 enterospheres /盘)再次挑选,三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗3次,转移到新的培养皿包含扩散介质或分化培养基。分化培养基由含N2的DMEM / F12补充(1:100),青霉素(100 U /毫升),链霉素(100μg / mL)、谷酰胺(2毫米)和抗坏血acid-2-phosphate (200μM;Sigma-Aldrich)。

Enterospheres扩散或分化为2天,从而形成两个实验团体“扩散”和“分化。“这两组之间的差异表达相比(分化与增殖)先后通过微阵列分析如下所述。

2.2。Affymetrix微阵列分析

Affymetrix微阵列分析进行类似于先前公布的数据在三个独立的实验中,每个细胞培养准备从2幼崽从相同的垃圾15]。在每个实验中,自由漂浮enterospheres如上所述,为了降低胶粘剂的分数成纤维细胞和平滑肌细胞。

enterospheres两组的总RNA提取使用RNeasy微工具包(试剂盒)。与RNA RNA质量评估在安捷伦2100生物分析仪完整性数字(RIN)的样本在这个研究中被从8到10。RIN数字高于8被认为是最佳的下游应用程序(16]。

双链cDNA总RNA的合成从100 ng,随后线性放大,生物素化的使用GeneChip WT互补脱氧核糖核酸合成和放大工具包(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA)根据制造商的指示。15μg标记和支离破碎的cDNA杂化GeneChip老鼠基因第1.0位数组(Affymetrix)。杂交后,数组被染色,洗一个流体站450 (Affymetrix)推荐的清洗过程。生物素化的cDNA绑定到目标分子检测与streptavidin-coupled藻红蛋白,生物素化的anti-streptavidin免疫球蛋白抗体和再次streptavidin-coupled藻红蛋白根据协议。数组进行扫描使用GCS3000 GeneChip扫描仪(Affymetrix)和显示3.0软件。扫描图像受到目测检查杂交工件和适当的网格对齐和分析与表达控制台1.0 (Affymetrix)来生成报告文件质量控制。

原始数据是由正常化Partek软件6.6,应用一个RMA(健壮的多片平均)算法。计算使用意义以及没有多个测试校正(Partek),选择所有记录的最小变化一起表达水平的1.5倍值小于0.05。

3所示。结果

在这项研究中,我们调查了基因表达谱的变化,发生在从对区分肠神经祖细胞增殖在体外。因此,我们enterospheres生成9天在体外文化,然后可以选择和扩散或分化两天(图1)。信使rna随后提取和基因表达的分析了这两组Affymetrix微阵列分析。

mRNA表达进行分析GeneChip老鼠基因第1.0位数组决定28.853基因的表达谱。每个基因被审问中传播的27个探针以及完整的基因。

总的来说,基因芯片检测到1454年记录至少1.5倍增殖和分化enterospheres之间的差异表达。1333个记录代码已确定蛋白质。541个基因被认为是调节和发现了792个基因表达下调与增殖enterospheres(见补充表网上的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9695827)。

我们用智慧通路分析软件(IPA)与科学文献搜索引擎和数据挖掘http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/基因划分成不同的组根据它们的功能在细胞的发展。最大的功能组包含171个基因与细胞周期和细胞凋亡相关(表1补充表)。在这里,我们发现特别是不同的细胞周期蛋白的蛋白质和细胞分裂周期蛋白主要表达下调。进一步,我们发现几个基因与神经发育以及神经干细胞增殖和分化基因调控。此外,我们还发现神经元和神经胶质分化标记和许多基因参与突触的形成(表2)。值得注意的是,我们还发现了一组基因被认为与平滑肌细胞的分化(表3)以及细胞外基质成分(表4)。此外,我们发现调控基因相关规范Wnt信号指示的失活途径在实体祖细胞分化(图2、表5)。

4所示。讨论

肠神经祖细胞的增殖和分化胚胎和产后发展是由各种内在和外在因素之间复杂的相互作用。具体时间是至关重要的适当的神经嵴细胞的迁移和增殖和分化为各种神经细胞的组成的复杂的神经结构ENS.虽然研究近年来扩展我们对存在的理解发展及其病理(13),仍有许多未知基因和流程。特别是因素调节神经祖细胞增殖和分化发展中以及产后肠道细胞和分子相互作用系统在很大程度上仍难以捉摸。在这里,我们使用在体外文化肠神经祖细胞来源于小鼠膜肌层扫描分子程序和信号通路作用于细胞增殖和分化。

我们的实验旨在阐明基因规定enterospheres存在时发生的祖细胞离开他们的增殖状态并开始分化成更多的定义和特定的细胞类型。Affymetrix基因表达分析显示的结果整体上的差别,对这些基因的1333个已知基因代码已确定蛋白质。171这些基因可能与细胞增殖(表1补充表)。其中我们发现基因编码的蛋白质与着丝粒复杂(如NSL1 [17],NUF2 [18],SKA1-3 [19],ZWILCH [20.]),细胞周期蛋白的蛋白质(21),细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) [22),和几种类型的着丝粒蛋白。145个基因的调控强烈表明经济放缓的细胞周期进展,因为它的目的是通过实验剥夺生长因子补充年底扩散阶段(见部分3)。有趣的是,betacellulin (BTC)是调节近3年来尽管据报道促进细胞增殖的神经干细胞利基(23]。尽管如此,绝大多数的基因包括所有细胞周期蛋白,调节细胞分裂周期蛋白,着丝粒蛋白表达下调。

我们也检查了细胞凋亡调节基因标记是否停止增殖与细胞死亡(补充表)。因为只有12 3凋亡基因调控的方向,表明细胞凋亡,细胞凋亡不太可能中断的扩散中扮演主要角色。不过,在肠细胞凋亡和监管的影响范围文化理解的一个重要基石在文化和肠神经祖细胞在活的有机体内,需要进一步调查。在一起,在广泛的基础上,这个数据集提供了强有力的证据表明,这种细胞培养设计适用于降低肠神经祖细胞的增殖率没有诱导细胞死亡和细胞凋亡数量可观。

进一步评估细胞的增殖条件存在于enterospheres,我们专注于不同细胞特定的标记的神经祖细胞和神经元,神经胶质或平滑肌细胞。我们认为这个复杂的细胞成分enterospheres优势相比,更净化神经嵴派生neurospheres我们能够捕获的细胞类型之间复杂的相互作用和分泌机制也可能发挥重要作用在活的有机体内。有趣的是,我们发现8基因参与成人中心或胚胎神经干细胞体内平衡(表2)。大多数像EPHA2基因24)监管的方式表明,神经干细胞增殖细胞周期进入分化程序退出。这个想法得到了众多基因驱动神经元和神经胶质的upregulation分化像NEUROD425通过简单地去除OLIG1[]或26]。在这种背景下,我们确定了几种调节基因参与适当的髓鞘形成。肠和中央神经胶质细胞被暂时表达myelin-related蛋白质在开发期间,可想而知,这种调节是神经胶质分化早期计划的一部分(27]。此外,也分化的典型标记神经元(第三类beta-tubulin, CALB2 [28])和肠神经胶质(GFAP [29日])是调节。有趣的是,S100B,一种常见的神经胶质细胞标记,是表达下调的对比数据。再一次,这可能是由于复杂的肠神经胶细胞分化程序,在后期S100B在其中扮演的角色。

此外,建立神经元细胞通讯是强烈的监管。在这里,我们发现基因的表达增加有关突触发生(LRRTM2和3 (30.],neurotrimin [31日])和陷阱或囊泡蛋白功能(STXBP3, SV2C [32],SYT6 [33])。我们还发现了许多基因参与了发射机的新陈代谢(COMT的监护系统)以及神经递质受体5、谷氨酸和肾上腺素能受体。然而,这些基因是高度可变的规定揭示突触形成错综复杂的发展中肠神经系统。这种复杂性是由基因进行相关轴突发芽和指导像semaphorins34]或RGMa [35]。

此外,我们发现调控基因直接参与肌肉细胞的分化和/或肠起搏器的卡哈尔间质细胞(表3)。特别有趣的是许多基因的upregulation开车平滑肌分化像ARID5B36],FOSL2 [36)和基因表达分化的平滑肌细胞在小肠AFAP1 [37],ENPP2 [38],CNN1 [39)以及各种肌球蛋白和肌动蛋白异型体。这些数据证实这一事实的球状体是由不同的细胞类型中肠膜肌层,进一步表明,剥夺生长因子诱导分化的平滑肌细胞类似的分子过程发展中肠道。事实上,我们在以前能够证实平滑肌细胞的存在来源于enterosphere文化BrdU-immunolabeling costudies [4]。然而,值得注意的是一些肌肉分化相关基因(endoglin [40],smoothelin [41],NUP210 [42],caldesmon 1 [43],ACTN1 [44])下调对比调节基因的表达模式中观察到大多数。这提示复杂的监管机制控制肌原性的分化程序不需要这些基因,或者在不同的时间序列不映射我们的实验设计。进一步显著,五个标记表示在卡哈尔间质细胞(ICC)包括设备(45]表达下调。

此外,监管43细胞外基质蛋白的胶原蛋白,整合蛋白,蛋白聚糖,矩阵metallopeptidases指出重建细胞外环境,讨论影响神经干细胞的行为(46)(表4)。总的来说,这些结果说明enterospheres的正在进行的遗传程序在早期分化。

在数据集内,这是特别感兴趣的发现尤其许多监管规范化Wnt通路相关的基因(表5)。规范的参与Wnt信号经常在各种干细胞利基市场的规定,如肠上皮或中枢神经系统神经干细胞。然而,这些研究表现出不同,部分矛盾结果强烈提示变量函数的正则Wnt信号在不同组织在胚胎和产后发展。在以往的研究中,我们发现监管的几个Wnt-related基因在甲状腺激素依赖的背景下肠神经祖细胞的分化指示的潜在作用规范Wnt通路激活在这祖细胞的扩散池(15]。规范Wnt信号经常被圈了文学大家最近et al。47]。总之,Wnt分泌蛋白质绑定到卷曲的受体(FZD)与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP5/6) coreceptors 5/6。此后,脚手架蛋白被发现(DVL)招募FZD和抑制β连环蛋白破坏复杂(AXIN2、APC和GSK-3β)。因此,β连环蛋白在细胞质中积累,把原子核结合TCF / LEF转录因子启动Wnt目标基因的表达。有趣的是,我们目前的数据强烈表明,规范Wnt通路关闭在肠的头两天祖在几个层面上分化的信号级联(图2)。一方面我们激活部分差别确定了对这些信号级联本身的受体蛋白FZD7和LRP5或转录因子TCF19 TCF7L1, LEF1。另一方面,灭活的途径等部分的元素β连环蛋白破坏体内基因LRRK2复杂AXIN2和(48被调节。我们还发现了许多信号级联的调节器。感兴趣的是,据报道,大多数的这些基因抑制信号过程细胞外地或在受体水平(动物的背部49],FRZB [50],DKK2 [51],LRP4 [52在细胞质(NEDD4L []),53],NKD1 [54],PRICKLE1 [55,11月56)、载脂蛋白e [57(TLE3[]),或者在细胞核58],EDIL3 [59])。此外,我们确定目标基因的规范化Wnt通路要么调节(例如,AXIN2施加负面反馈通路)或下调细胞周期进展基因CCND1和SPRY4 [60]。我们还发现低表达SPRY2 [61年),Wnt目标基因和已知的抑制剂GDNF信号(62年),分化组。连同一个强大upregulation GDNF本身的4.325倍,这可能推动肠祖细胞进入神经分化(12]。

综上所述,可想而知,规范Wnt信号有助于维护肠道祖池在扩散和关闭的分化情况。实际上,我们之前的基因表达分析(15)以及最近出版的细胞培养实验(63年),尚未出版的在体外分析强烈支持这一假设。

5。结论

这项研究集中在肠神经祖细胞基因表达的改变发生的头两天内从增殖状态过渡到分化在体外。使用微阵列分析,我们发现显著抑制细胞周期进展一般以及强有力的证据神经干细胞分化成肠神经元和神经胶质细胞。这些发现证实了upregulation突触形成相关的基因和神经连接。最有趣的,我们发现这种转变从肠神经祖细胞增殖分化伴随着相当规范Wnt信号通路的失活。加之以前的工作,强烈表明,规范Wnt驱动机制的激活是肠神经祖细胞增殖和因此可能扮演一个角色在这个细胞的体内平衡池在活的有机体内和在体外。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

彼得·赫尔穆特•Neckel和罗兰·莫尔同样这项工作。

确认

支持的项目的资助德国联邦教育和研究(01 gn0967)。作者要感谢安德里亚·Wizenmann Andreas Mack,斯文Poths有用的建议。

补充材料

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