白血病干细胞Cell-Released微泡促进骨髓白血病细胞的存活和迁移,这些影响可以通过MicroRNA34a抑制过度

文摘

白血病干细胞(lsc)扮演的主要角色在复发的急性髓系白血病(AML)。最近的证据表明,微泡(MVs)释放癌症干细胞可以促进肿瘤的生长和入侵。在这项研究中,我们调查是否LSCs-released MVs (LMVs)可以调节AML细胞的恶性肿瘤抑制微rna (miR)的过度表达,是否miR34a,能够中断这一过程。lsc转染了microrna的控制(miRCtrl)或miR34a模仿生产LMVs,分别定义为和。miR34a转染的影响在LSC扩散的影响或在扩散、迁移和细胞凋亡的AML细胞(LSC耗尽之后)测定。miR34a的水平目标,caspase-3和T细胞免疫球蛋白mucin-3 (Tim-3)进行了分析。结果表明,(1)促进增殖和迁移和抑制细胞凋亡的AML细胞,这与miR34a有关赤字;(2)转染miR34a模仿抑制LSC扩散和miR34a水平增加;(3)相比之下,产生相反的效果,与caspase-3和Tim-3水平的变化有关。总之,LMVs支持AML细胞恶性和调制miR34a可能为AML的管理提供一种新方法。

1。介绍

急性髓系白血病(AML)是一种激进的疾病特点是快速扩散的不成熟骨髓髓系细胞导致不正常的造血作用[1]。尽管目前的治疗可以诱导缓解,许多AML患者最终复发由于休眠白血病干细胞的存在(lsc)对化疗产生抗药性。lsc能够自我更新、增殖和分化广泛AML的启动和维护的关键。众所周知,癌症干细胞通过分泌因素影响癌症恶化部分(2]。微泡(MVs)膜囊泡释放细胞接受压力,激活,或细胞凋亡,从而调节细胞间通信通过转移蛋白mrna,小分子核糖核酸(大鹏)和细胞间脂质(3,4]。最近的证据表明,MVs从癌症干细胞分泌可能与周围的肿瘤细胞和基质细胞相互作用,可能参与肿瘤进展和转移(5,6]。例如,胃癌干细胞细胞分泌MVs被证明促进胃癌细胞增殖和迁移5]。此外,MVs分泌肾癌干细胞诱导体外和体内血管生成和青睐肺转移6]。然而,未知是否以及如何LSCs-derived MVs (LMVs)调节AML的恶意。

大鹏是小非编码rna转录后的基因调控的功能作为主要参与者在不同的细胞类型。失调的肿瘤抑制miR34a AML[都会涉及到7]。被迫表达miR34a AML爆炸导致粒细胞分化,表明增加miR34a水平可能成为治疗对AML[有用8]。此外,一些miR34a下游目标基因在AML被确定。例如,caspase-3报道作为程序性细胞死亡的重要分子,分化,和生存的AML [9,10]。T细胞免疫球蛋白mucin-3 (Tim-3)是人类AML细胞中高度表达,这可能触发prosurvival和proinvasive信号(11,12]。因为MVs可以作为旁分泌或内分泌介质水平遗传信息转移到受体细胞(13),我们建议过度miR34a lsc可能在LMVs同步增加miR34a的水平,这可能是能够废除LMVs-induced对AML的影响。

在这项研究中,我们旨在调查LMVs对扩散的影响,移民和AML细胞的凋亡。相关的miR34a caspase-3和Tim-3通路LMVs-mediated效果也被调查。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和排序

人类AML细胞株KG1a(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)是维护在悬浮培养与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫和100 U /毫升的青霉素和链霉素。自lsc被定义为CD34 + CD38−分数KG1a细胞和所有KG1a CD34 +细胞,丰富了lsc间接标记CD38-FITC抗体和anti-FITC微根据制造商的指示(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。简单地说,细胞悬浮液在125 g离心10分钟,洗在磷酸盐(PBS)。然后,细胞颗粒在分离resuspended缓冲区(PBS包含0.5%牛血清白蛋白)和孵化CD38-FITC抗体为30分钟。与PBS洗涤后,细胞颗粒在分离resuspended缓冲区包含Anti-FITC微15分钟。经过几次清洗步骤,滤液(CD34 + CD38−细胞)收集LD列使用MidiMACS分离器系统。整个排序过程,细胞保持在4°C和立即通过流式细胞术分析。剩下的电池耗尽后lsc被定义为AML细胞,用于coculture研究。

2.2。流式细胞术分析

1×10⁵细胞在PBS和孵化resuspended LSC表面抗原抗体包括CD34和CD38 30分钟在4°C。担任负控制免疫球蛋白g同形像。lsc被用来生成LMVs coculture与AML细胞。

2.3。细胞转染

5×10⁵细胞悬浊液被播种在6-well板块和转染miR34a模仿(σ,100海里)或米尔控制(miRCtrl;σ,100海里)使用Lipofectamine 2000转染试剂(表达载体,CA) 2天。转染效果检测实时定量逆转录聚合酶链反应(存在)。

2.4。中存在

总RNA提取试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成使用miScript逆转录工具包(试剂盒)。进行了定量实时PCR miR34a特定的引物和miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)实时PCR系统(Bio-Rad)。小核RNA U6作为内部控制。所有的实验都进行了一式三份。相对表达miR34计算使用方法(14]。

2.5。分离和鉴定和

MVs产生lsc转染miRCtrl或miR34a模拟,分别定义为和。MVs收集从细胞培养基和差速离心纯化,之前报道(15]。分泌MVs的粒子数量和规模分布是衡量NanoSight NS300仪器(莫尔文乐器,据英国)根据制造商的指示16]。

2.6。与车辆Coculture AML细胞,,或

孤立的或(50μg) resuspended新鲜培养基。AML细胞分别处理车辆(veh新鲜培养基),,24小时在一个孵化器(37°C, 5%的公司₂)。AML细胞被收集并受到细胞凋亡、增殖和迁移化验。

2.7。细胞凋亡检测

终端原位dUTP-digoxigenin尼克结束标记(TUNEL)分析了根据制造商的指示(勃林格曼海姆,德国)。总之,细胞与4%多聚甲醛固定30分钟,随后permeabilized Triton x - 100 0.1% 0.1%柠檬酸钠为2分钟。这些细胞被孵化与50μL TUNEL反应混合物1 h在37°C。标记细胞被流式细胞术分析。

2.8。细胞增殖实验

细胞被播种在96孔板和添加10μL甲基噻唑基四唑(麻省理工,12毫米;表达载体,纽约)的解决方案。4小时的潜伏期后,二甲亚砜(DMSO)异丙醇(1:1)溶剂直接添加到细胞悬液,孵化了30分钟。吸光度测量570海里。

2.9。细胞迁移试验

细胞悬浮在无血清培养基,添加到商会24-well transwell板块(纽约康宁Inc .)。下室挤满了500μL完全培养基。Transwell盘子被孵化24小时37°C细胞孵化器。细胞迁移和4%多聚甲醛固定,沾0.1%结晶紫,列举十光显微镜下随机选择的字段。

2.10。免疫印迹

提取蛋白质从细胞裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂(罗氏诊断)。蛋白质是由sds - page分离和转移到PVDF膜。PVDF膜阻止了5%脱脂牛奶1 x Tris-buffered盐水Tween-20 (TBST, pH值7.6)在室温下(RT) 1 h,然后孵化主要抗体Tim-3 (1: 200;圣克鲁斯在一夜之间)在4°C。β肌动蛋白(1:40000;σ)是用于正常蛋白质加载。TBST三次,清洗后膜是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭免疫球蛋白g(1: 40000年,杰克逊实验室)1小时在rt,屁股然后发达与发展中解决方案增强化学发光和量化。

2.11。酶联免疫吸附试验(ELISA)

Caspase-3活动AML细胞不同群体使用Quantikine化验Caspase-3(研发系统)如前所报道(17]。总之,AML细胞收获,在PBS洗,resuspended在提取含有蛋白酶抑制剂的缓冲区。标准和样品提取物添加到微型板块预镀caspase-3特定抗体。合底物被添加到每个。在450 nm caspase-3水平测定。

2.12。统计分析

统计分析是使用SPSS软件16.0版本完成的。所有实验进行了至少三次。数据显示为±SEM,除非另有注明。比较了两组学生的t以及。多个由单向方差分析进行比较。所有情况下,设置为统计学意义。

3所示。结果

3.1。表征lsc

确定lsc KG1a细胞的比例和lsc是否成功地从KG1a分离细胞,KG1a细胞和microbeads-isolated lsc沾CD34-PE CD38-FITC抗体(18,19),通过流式细胞术分析。如图1(一),KG1a细胞含有约32.8%的CD34 + CD38−细胞。microbead排序过程后,95%以上的细胞CD34 + CD38−和考虑lsc。

3.2。在LSC miR34a超扩散的影响

miR34a模仿的转染效率是评价中存在(图1 (b))。正如所料,miR34a水平lsc miR34a模仿转染后显著升高与miRCtrl相比转染或阿明费。这一发现表明成功的过度的miR34a lsc。过度的miR34a lsc显著抑制增殖能力(与控制,;与miRCtrl,;图1 (c))。

3.3。粒子浓度和miR34a LMVs的水平,,

如图2(一个),NTA分析显示的数量高于LMVs还是,虽然没有明显的大小分布的变化。更有趣的是,在LMVs miR34a的表达是显示在相同的模式作为他们的父母lsc。如图2(一个),存在试验表明miR34a水平远远高于LMVs还是。没有显著差异miR34a LMVs与水平。

3.4。的影响和在细胞凋亡、增殖和迁移的AML细胞

AML细胞凋亡(图3)是被TUNEL染色和流式细胞术分析。AML细胞的凋亡是coincubation后下降相比与阿明费或(%与%,与阿明费;%与%,与;和)。细胞凋亡veh-treated之间没有显著差异治疗AML细胞(%与%,;)。此外,扩散(图4(一)(图)和迁移能力4 (b))的AML细胞增强coincubation后(与阿明费;),而这些影响在AML细胞coincubated缺席(与阿明费;)。

3.5。的影响和Caspase-3活动与Tim-3表达AML细胞

coincubated caspase-3减少在AML细胞的活动(与阿明费;图5(一个))。显著增加的活动caspase-3 AML细胞(与阿明费;图5(一个))。Tim-3表达的调节治疗AML细胞(与阿明费;图5 (b)),但中表达下调治疗AML细胞(与阿明费;图5 (b))。

4所示。讨论

有几本研究的主要发现。首先,我们证明了LMVs促进扩散、迁移,和生存的AML细胞,这与miR34a赤字因为过度miR34a lsc抑制其增殖。其次,lsc miR34a模仿转染生成含有高水平的miR34a LMVs(例如,),这对AML细胞相比LMVs起到相反的作用。第三,LMVs的不同影响对AML细胞与不同调节能力有关miR34a-targeted caspase-3和Tim-3通路。

癌症干细胞的概念已经提出多年,近年来受到越来越多的关注。有确凿的证据,AML的lsc包含一个族群主要负责AML的耐火材料和抵抗化疗和免疫治疗(18,20.,21]。然而,潜在的机制尚未完全了解。在我们的研究中,我们孤立CD34 + CD38−分数(lsc) KG1a细胞通过immune-magnetic microbead方法之前报道(18用于生成MVs)和培养。高水平的MVs被发现在各种疾病包括癌症,表明他们可能作为诊断和预后的工具(22]。此外,MVs可以作为自分泌或旁分泌介质,因为他们可以合并与靶细胞发挥广泛的行为(13]而LMVs是否影响AML的生存和恶意仍然未知。在我们的研究中,我们首次发现LMVs能促进增殖和migrative能力,防止AML细胞的凋亡。最近的一项研究表明,MVs源自肾癌干细胞诱导内皮细胞生长异常,入侵矩阵,和抗细胞凋亡6]。因此,我们的研究结果提供了新的见解之前的观点(5,6),这表明MVs源自癌症干细胞可以改变周围的肿瘤和间质细胞的表型,创造良好的肿瘤微环境。

接下来,我们检查的潜在机制LMVs-induced影响AML细胞。最近提议,癌症干细胞不仅引发癌症,还支持癌症的发展由于其致癌的内容(23]。MVs被认为是理想的车辆将癌症干细胞的内容转移到旁观者的细胞。以前的研究也表明RNA内容(主要是大鹏和mrna) MVs扮演关键角色,因为MVs的核糖核酸酶治疗显著抑制了MVs的生物效应(6]。因此,我们假设重组的米尔内容LMVs能够改变LMVs在AML细胞的影响。肿瘤抑制miR34a在大多数癌症,据报道已经表达下调和恢复miR34a可以诱导细胞凋亡,增强癌细胞的化学敏感性24,25]。我们目前的研究发现,过度的miR34a lsc不仅显著抑制其增殖能力也产生LMVs含有高水平的miR34a可以抑制LMVs在AML细胞的影响。这些数据表明miR34a的潜在作用维护lsc LMVs-mediated效应,这可能提供了一个新的目标的方式lsc调节lsc之间的交互以及AML细胞。

下游靶基因miR34a caspase-3和Tim-3等已确定在AML [9- - - - - -12]。的主要效应细胞死亡,caspase-3活动是生存在AML的预测9,10]。一项研究报道,过度的miR34a显著诱导胰腺β细胞凋亡伴随着caspase-3活动增加(26]。在我们的研究中,我们发现LMVs AML细胞,可以显著减少caspase-3活动由miR34a抑制过度。Tim-3人类AML细胞中高度表达,可以作为一种很有前途的候选人AML疗法(11,12]。之前的一份报告表明,Tim-3的高表达与高转移潜能和总生存期宫颈癌(短27]。寻找米尔目标通过使用TargetScan证实Tim-3有一个假定的miR34a绑定网站在其3′utr。我们发现LMVs显著调节Tim-3 AML细胞和蛋白表达的这些影响被LMVs携带高水平的miR34a逆转。然而,我们并没有直接测试miR34a是否可以通过绑定到目标Tim-3 mRNA 3′UTR并调查是否过度Tim-3蛋白质可以挽救miR34a进行靶向治疗的影响。我们承认有一些限制在我们的研究中,有必要把这些问题融入我们的未来的工作。特别注意,miR34a过度可能部分块LMVs在AML细胞增殖的影响,移民,和扩散,尽管它能够显著提升caspase-3活动和减少Tim-3 AML细胞中表达;这些数据表明,其他大鹏和相关机制也可能参与LMVs-induced效果。的责任人,miR34a LMVs及其下游目标,caspase-3 Tim-3,恶意的AML都在我们的研究中显示了。然而,LMVs的角色的详细机制需要进一步调查。

5。结论

我们的数据表明,LMVs能够促进AML细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡,这是与miR34a的赤字。恢复miR34a不仅抑制了LSC扩散,还能抑制这些LMVs对AML细胞通过调节caspase-3和Tim-3水平。这些发现表明LMVs支持AML细胞的恶性肿瘤和定位的miR34a LMVs可以提供治疗AML的新方法。

相互竞争的利益

作者宣称没有一个任何形式的利益冲突与工作有关。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委,不。81560032分钟盾)。

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