Wnt受体卷曲-4在婴儿肠道神经系统中的表达

摘要

WNT信号通路在神经系统的发展中起着至关重要的作用。该信号传导级联在分泌的Wnt配体与细胞系列的成员的结合后开始。在本研究中，我们分析了人类婴儿的肠道神经系统中毛毡的存在。可以通过免疫组织化学在小而大肠中的肠道神经元和胶质细胞亚群中鉴定Frizzled-4。RT-PCR检测Tunica Muscularis中的Frizzled-4证实了该受体对mRNA水平的表达。有趣的是，我们观察了与中间丝蛋白巢蛋白和神经营养蛋白受体共表达毛细胞群的不同细胞群据报道，已经在神经祖细胞中表达。流式细胞术分析显示60％肌层细胞中卷曲蛋白-4阳性。此外，在Hirschsprung病的病理样本中，Wnt受体的表达与肠肌神经节细胞的数量相关，并从正常神经节区到大肠的神经节区表达减少。卷曲-4的表达模式表明Wnt受体可能参与了出生后肠神经系统的发育和/或功能。

1.介绍

外周神经系统的神经元和胶质细胞来源于神经嵴干细胞[1]．NCSCs遵循一种明确的时空模式，从神经管迁移到胚胎组织，包括发育中的肠道。在小鼠胚胎日(E) 9.5时，它们进入原始前肠，并在E14.5时向喙部-尾部方向迁移，以便在整个肠道定植[2，3.].在人类中，肠神经嵴细胞的迁移发生在妊娠第4周和第7周之间[4]．在它们沿着肠道的过程中，一部分细胞继续增殖，而另一部分细胞开始分化[5，以产生一个复杂的神经网络，协调肠道运动，并参与调节其分泌活动、血液流动和免疫系统的调节[6，7]。ENS发育障碍导致NCSCs对肠道的不完全定植，导致肠蠕动失调、肠梗阻和小肠结肠炎，正如在先天性巨结肠（HSCR）中观察到的那样[8- - - - - -10]．近几十年来，人们对神经嵴发育及其衍生物的遗传调控进行了大量的研究。这导致了几个主要途径的识别，调节NCSC的诱导，迁移，分化，和发展中的神经元和胶质细胞的互连[3.，11]．据报道，Wnt信号在许多模式生物的这些发育过程中发挥了核心作用。与骨形态发生蛋白(BMP)家族成员和成纤维细胞生长因子一起，Wnts调节神经嵴诱导和规范。此外，神经嵴细胞的迁移依赖于Wnt信号通路[12，13]．

Wnt信号级联是由Wnt与卷曲跨膜受体家族的成员结合而启动的，并导致诸如β-catenin依赖通路或平面细胞极性- (PCP-)依赖通路，这两种通路都被证明参与早期神经嵴发育。最近，PCP通路已被证实在ENS发育过程中额外参与调节神经连接[14]．然而，虽然wnt -卷曲相互作用对早期神经嵴发育的重要性已被证实，但其在调节出生后神经嵴衍生物中的作用在很大程度上尚不清楚。

有趣的是，有证据表明神经发生在出生后的小鼠中继续体内刺激血清素或伤害后[15- - - - - -17]．出生后ENS的一个细胞亚群被认为具有干细胞样的特性，尽管这个生态位还没有很好地描述。Nestin，低亲和力神经生长因子受体，而CD49b (α 2-整合素)已被认为是这一肠道神经干和祖细胞群体的标志物[18]．

在卷曲受体家族成员中，卷曲-4在中枢神经系统中调节干细胞维持、神经保护和细胞迁移方面的作用已被证明特别有趣[19- - - - - -21]在本研究中，我们通过免疫组织化学、RT-PCR和流式细胞术分析检测了这种Wnt受体在婴儿肠道神经系统中的表达。为了描述frizzled-4阳性细胞群的特征，我们使用在ENS的神经和假定祖细胞中表达的各种神经标记物进行了共标记实验。

2.材料和方法

2．1．人类肠道样品

从4周到10个月的婴儿男性和女性患者的小肠和大肠中提取人类肠道样本，这些患者在坏死性小肠结肠炎或肛肠畸形治疗后接受手术切除小肠造口。此外，我们收集了Hirschsprung病患者的组织，这些患者接受了经肛门直肠内拉入手术(见表)1所有样本均按指南收集，经丁宾根大学地方伦理委员会批准，并经患者家长同意。

2.2.免疫组织化学

14例进行免疫组化μm厚的冷冻乳糖。将组织载玻片在室温下以磷酸盐缓冲的盐水（PBS，pH 7.4）中的4％（w / v）多聚甲醛（PBS，pH7.4）固定在20分钟，随后在PBS中漂洗三次。用ABC检测系统（Vector Labs，彼得伯勒，英国）染色的载玻片在3％（v / v）过氧化氢PBS溶液中含有10分钟以阻断内源过氧化物酶。与含有血清的血清孵育（含有0.1％（w / v）bsa的PBS，4％（v / v）山毛细血清和0.3％（v / v）triton x-100）进行30分钟，培养部分在PBS，0.1％（w / v）bsa和0.1％（v / v）triton x-100中稀释的初级抗体在4℃下过夜。表中列出了一抗抗体和浓度2．在用PBS进行三次洗涤后，将该部分在相同缓冲液中在室温下与二抗30分钟温育30分钟。用荧光铬缀合的二抗进行检测（1：400，山羊抗兔IgG-Cy3（Dianova，汉堡，德国）;山羊抗小鼠Igg-Cy3（Dianova，汉堡，德国）;山羊抗小鼠IgG- 使用ABC检测时，alexa 488（Life Technologies，Darmstadt，德国））或生物素化的二抗（1：400，猪抗兔IgG-Biotin（Dako抗小鼠Igg-Biotin（Dako，Hamburg，德国））系统。根据制造商孵育AB试剂，并用3-3'Diamobendine（DAB，Sigma，Taufkirchen，德国）和过氧化氢溶液进行ABC系统的可视化。对于荧光检测，将部分和细胞在PBS中洗涤三次，并另外用DAPI染色（4'-6-二脒基-2-苯基吲哚，0.2 μG / ml）PBS溶液10分钟。干燥染色部分，嵌入Kaiser的明胶（Merck，Darmstadt，Germany），并拍摄在倒置显微镜（Axiovert，Zeiss，Jena，德国）。

2．3.RNA分离和RT-PCR

在立体显微镜的视觉帮助下，对人体肠道样本进行机械解剖。在处理残余脂肪和肠系膜组织后，将粘膜下和粘膜层的肌层剥离并彻底切碎。使用RNeasy Mini Kit（德国希尔登Qiagen）从人体肌层分离总RNA根据制造商的说明。通过DNase I（德国达姆施塔特生命技术公司）处理去除可能污染的基因组DNA。含有寡核苷酸的逆转录酶PCR（RT-PCR）反应-（dT）₂₃根据供应商的协议(Life Technologies, Darmstadt, Germany)，进行anchor mRNA引物(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)、Superscript II逆转录酶和RNase Out。

为了扩增卷曲-4受体和管家基因GAPDH，使用了以下引物对(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)。卷曲-4(产品尺寸:605 bp):5“-CTCGGCTACAACGTGACCAAGAT-3”,5“-AATATGATGGGGCGCTCAGGGTA-3”;GAPDH（产品尺寸：452 BP）：5“-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3”,5“-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3”。

PCR反应混合物在95℃下培养5分钟 分钟，然后在95℃下进行35次循环，持续30分钟 s、 退火温度()， 72°C为40 s, 72°C为40 s，并在72°C延长延伸时间10 min。底漆特定的退火温度如下:(卷曲-4)= 58°C和（GAPDH）=60°C。扩增的PCR产物在1%的温度下进行电泳分析 （w/v）琼脂糖凝胶（Roth，Karlsruhe，德国）在1x TBE缓冲液（Tris碱、硼酸和EDTA）中，温度为100℃ V.使用溴化乙锭（2）对产品进行可视化 μg/mL)。采用100 bp DNA阶梯标准(Life Technologies, Darmstadt, Germany)估计每个PCR产物的大小。省略了RT步骤，作为残留基因组DNA可能污染dnase处理样品的对照(阴性对照)。

2.4.流式细胞术

流式细胞术分析所用的细胞是用750%葡萄糖从人体组织中消化肌层获得的 U/ml胶原酶席（西格玛，陶夫基兴，德国）和0.5% 在哈佛商学院，w/v Dispase II（罗氏，曼海姆，德国）与．为避免表面抗原表位的酶切，在37℃下酶切时间最长为1 h。弃去组织残留，上清210 g离心7 min, HBSS洗涤2次，40滤液过滤μm细胞过滤器。产生的细胞颗粒在20分钟内重新悬浮 μL封闭缓冲液（polyglobin（Talecris Biotherapeutics，法兰克福美因河畔，德国）稀释1 : 10单位DPBS/0.5%牛血清白蛋白（0.5% （w/v）杜尔贝科PBS中的BSA不含))在冰上孵育10分钟 随后，用DPBS/0.5%稀释细胞 （w/v）浓度为2×10的BSA⁵细胞每50μL和抗体冰封15分钟。兔抗-APC (CD271, Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany, 1:50)。卷曲-4的染色是通过小鼠抗卷曲-4抗体孵育获得的(25μ信用证10⁴细胞，未稀释杂交瘤上清)，然后用兔抗小鼠IgG-FITC二抗(Dako, Hamburg, Germany, 1:15)或使用小鼠抗毛毛-4 pe标记抗体(Biolegend, San Diego, USA, 1:50)。与同型对照(兔IgG- apc (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany, 1:50)、小鼠IgG (Biozol, Eching, Germany, 1:1000)和小鼠IgG- pe (biolegenen, San Diego, USA, 1:50))进行比较。两种染色方法的卷曲-4染色量和强度均无差异。抗体孵育后，用DPBS/0.5% (v/v) BSA洗涤细胞，4℃离心7分钟，210 g。所得颗粒在DPBS/0.5%BSA中重悬，在FACSCanto II系统上获得(BD Bioscience, Heidelberg, Germany)。使用FlowJo软件分析数据。

结果

在本研究中，我们分析了在4周和10个月之间的人婴儿的肠道神经系统中蜂鸣器的WNT受体毛毡的表达。首先，对来自小肠和大肠的低温恒温杆切片进行毛细胞化化学染色方法。可以在齿轮壁的所有层中观察阳性细胞（图1，2,3.）.从肌膜分离的mRNA的RT-PCR分析证实了卷曲-4受体mRNA的存在(图4）.为了进一步鉴定阳性细胞群，我们用外周蛋白和GFAP对卷曲蛋白-4进行了共免疫染色。如图所示2和7这种Wnt受体在肠神经元和胶质细胞亚群中以不同强度表达(图)2和7）.在肌层、粘膜下层和固有粘膜层观察到卷曲的4免疫阳性神经延伸(图)1，2,3.）.值得注意的是，上皮隐窝基底部也被卷曲的-4阳性神经延伸区包围(图)3.）.此外，Wnt受体在表达中间丝束和神经营养蛋白受体的细胞群中占有污染（数字1，2,7）.有趣的是每个神经节共表达frizzled-4的阳性细胞是高度可变的，即使在相同的肠道区域也是如此。在肌层、粘膜层或血管壁的平滑肌细胞中未发现Frizzled-4，Cajal间质细胞中也未发现Frizzled-4，c-kit染色（图1）2）.

总之，我们已经通过免疫组织化学表现出来，在肠道神经系统细胞的亚群中表达了Frizzled-4，这对于外周，GFAP和和．

为了量化frizzled-4阳性细胞群，用frizzled-4抗体对分离自肌层的酶消化和免疫标记细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析（图1）5）.使用这种方法，在6个独立的实验中可以检测到不同的细胞群:12.3%±5.9%(平均±SD)的分析细胞染色为卷曲-4阳性，而19.7%±9.2%(平均±SD)的细胞染色为神经营养因子受体阳性. 事实上，Collabeling实验表明，60.0%  的±16.2%（平均值±标准差）阳性细胞表达Wnt受体，而几乎所有卷曲蛋白4阳性的细胞也有表达(93.3%±8.9%(均值±SD))。因此，我们可以鉴定一个双阳性的亚群卷曲-4⁺细胞，这是明显区别于卷曲-4阴性人群。

接下来，我们研究了3例先天性巨结肠患者肠道样本中Wnt受体的表达模式。在图6，展示了具有代表性的外周蛋白染色冷冻切片，该切片取自巨结肠病的“瑞士卷”组织(图)6）.在这些部位，神经节的大小和数量通常从口腔到肛门减少。在肛门(神经节)端肌肠丛中外周蛋白的基本表达代表肌肠神经纤维中外周蛋白的表达[22]．与nestin相比，卷曲-4的免疫组化分析、外周蛋白和GFAP显示，与其他标记物一致，卷曲蛋白-4在大肠从正常神经节区到神经节区表达下降(图)7和8）.

4.讨论

Wnt信号在周围神经系统的发育中起着重要作用。它诱导和指定神经嵴，并参与调节神经嵴细胞迁移和发育中肠道中神经元互连形成的过程[12- - - - - -14]．

在这10个已确认的卷曲的wnt受体中，只有卷曲的4受体能够强结合Norrin。Norrin被认为可以调节内耳和视网膜的血管发育[23，但也被认为是介导视网膜神经节细胞的神经保护作用[20.].在人类中，它与诺瑞病有关，诺瑞病是一种主要影响眼睛的遗传性疾病，在一定比例的患者中会导致失明和进行性听力损失。尽管在受影响的人类中没有描述胃肠道症状，但诺瑞素-frizzled-4相互作用被怀疑在结肠粘膜中起重要作用再生与结肠肿瘤发生[24]．

此外，Frizzled-4敲除小鼠患有食管功能障碍，除了渐进的小脑和听觉变性之外[25]．虽然作者将食管运动的变化归因于肌肉发育不良，并描述了在卷曲-4基因敲除小鼠中，下消化道ENS未受影响，但ENS结构的细微变化和对胃以外的肠道功能的影响没有被详细研究。事实上，敲除卷曲基因可导致胃肠道运动严重的神经源性异常，而ENS结构似乎几乎是正常的，这一事实已被Sasselli等人令人印象深刻地证明[14]．在这些实验中，毛躁-3的缺失导致ENS网络的发育缺陷，并导致胃肠道运动障碍。虽然Wnt信号在神经嵴和ENS发育中的重要性已经被证实，但这一通路在出生后ENS中的作用仍是未知的。最近，初步数据表明Wnt信号在大鼠出生后肠神经系统中具有抗炎活性[26]．

在我们的研究中，我们分析了正常婴儿肠道组织以及先天性巨结肠患者组织中卷曲蛋白4的表达模式。免疫组化分析显示，卷曲蛋白4在胃肠道神经细胞中表达。表达外周蛋白的神经元和GFAP阳性的胶质细胞的亚群被不同强度的染色。相比之下，卷曲-4既不在肠平滑肌中表达，也不在Cajal的间质细胞中表达。有趣的是，在中间丝巢和细胞表面抗原染色阳性的细胞群中也观察到卷曲-4的表达．这些蛋白与CD49b一起被提议在ENS祖细胞或干细胞中表达[18]．事实上，一些证据支持神经发生也发生在出生后的肠道。ENS的再生已经被证明发生在小鼠身上体内在5-HT刺激或肠道损伤后[15- - - - - -17]．此外，啮齿动物和男性出生后ENS细胞的分离和繁殖能力表明，如神经细胞类型的祖细胞或干细胞在出生后的肠道中存在[27- - - - - -30.]．在这种背景下，识别合适的标记物来分离这些神经前体细胞对细胞治疗的发展至关重要。有趣的是，我们的流式细胞术实验显示，93%的卷曲-4表达细胞>也呈阳性而卷曲-4阳性细胞仅占60%左右细胞池。因此，卷曲-4抗体识别的亚群阳性细胞，并可能代表一个有趣的标记，用于分离和表征这些不同的细胞群。然而，需要进一步的实验来研究和比较Fzd4的细胞生物学特性⁺/和Fzd4⁻/细胞。

有趣的是，我们的免疫组织学发现表明上皮隐窝被frizzled-4阳性神经延伸所包围。肠隐窝中含有由Wnt信号通路强烈调节的上皮干室[31]．ENS细胞延伸至该腔室的紧密定位表明，上皮干细胞龛可能通过分泌Wnt通路激动剂(如Wnt3a或R-spondin)影响肠神经系统。

诊断程序使用特定的抗体来识别疾病，如巨结肠病。然而，在人体组织中识别肠神经节细胞可能是具有挑战性的，特别是如果在新生儿中存在未成熟的神经节细胞，这些细胞很容易与内皮细胞和间充质或免疫来源的细胞混淆[32]．此外，在初次诊断的吸引活检中，标本通常只包括粘膜下丛，而且往往体积小，很难作出准确的诊断。因此，免疫组化分析，使用针对各种神经元和胶质抗原的抗体，已被提出，以增加诊断程序的敏感性和特异性。在本研究中，我们评估了卷曲-4的表达模式，并将其与结肠不同部分的其他细胞标志物进行了比较。免疫组化在正常神经节化的肠道、过渡区和结肠的无神经节细胞段，GFAP、外周蛋白和frizzled-4。在检查的组织中，frizzled-4阳性细胞的数量从大肠的正常神经节细胞区下降到无神经节细胞区，与其他神经标记物一致。frizzled-4是否可能作为诊断先天性巨结肠的假定诊断标志物，必须在更大的患者队列中进行研究。

5.结论

在本研究中，我们分析了人类小和大肠肠道神经系统中WNT受体的表达-4。在肠道神经元和峡谷的不同亚群和巢蛋白中发现了Frizzled-4。肠壁各层均有阳性细胞．在Hirschsprung病的病理人类样本中，Wnt受体的表达从大肠正常神经节区到神经节区下降。卷曲-4的表达模式表明Wnt信号通路可能参与了肠神经系统的发育和/或功能。需要更多的研究来更详细地描述卷曲-4阳性细胞群的特征，并阐明这种Wnt受体在出生后人类肠道系统中的生物学作用。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Katharina Nothelfer和Florian Obermayr对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

作者要感谢Susanne Stachon提供的出色技术援助。该项目得到德国联邦教育和研究部（01GN0967）的资助。

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