SCIgydF4y2Ba 干细胞国际gydF4y2Ba 1687 - 9678gydF4y2Ba 1687 - 966 xgydF4y2Ba Hindawi出版公司gydF4y2Ba 10.1155 / 2016/9076823gydF4y2Ba 9076823gydF4y2Ba 研究文章gydF4y2Ba Wnt Frizzled-4受体的表达在人类婴儿的肠神经系统gydF4y2Ba NothelfergydF4y2Ba 凯瑟琳gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba ObermayrgydF4y2Ba 弗洛里安gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 茨gydF4y2Ba 纳丁gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba ReinartzgydF4y2Ba 艾伦gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba BareissgydF4y2Ba 佩特拉。gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 布尔gydF4y2Ba Hans-JorggydF4y2Ba 3gydF4y2Ba BeschornergydF4y2Ba 鲁迪gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 只是gydF4y2Ba 洛萨gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba NalapareddygydF4y2Ba KodandaramireddygydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 研究所的临床解剖学与细胞分析gydF4y2Ba 图宾根大学gydF4y2Ba 图宾根gydF4y2Ba 德国gydF4y2Ba uni-tuebingen.degydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 小儿外科和儿科泌尿外科gydF4y2Ba 图宾根大学儿童医院gydF4y2Ba 图宾根gydF4y2Ba 德国gydF4y2Ba uni-tuebingen.degydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 血液学分工gydF4y2Ba 免疫学gydF4y2Ba 肿瘤学gydF4y2Ba 风湿病和肺学gydF4y2Ba 内科二世gydF4y2Ba 图宾根大学gydF4y2Ba 图宾根gydF4y2Ba 德国gydF4y2Ba uni-tuebingen.degydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 病理学和神经病理学研究所gydF4y2Ba 部神经病理学gydF4y2Ba 图宾根大学gydF4y2Ba 图宾根gydF4y2Ba 德国gydF4y2Ba uni-tuebingen.degydF4y2Ba 2016年gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 2015年gydF4y2Ba 2016年gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba 05年gydF4y2Ba 2015年gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 07年gydF4y2Ba 2015年gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 2015年gydF4y2Ba 2016年gydF4y2Ba 版权©2016 Katharina Nothelfer et al。gydF4y2Ba 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。gydF4y2Ba

Wnt信号通路中起着至关重要的作用在神经系统的发展。这个信号级联发起在绑定Wnt配体分泌的卷曲的受体家族的成员。在目前的研究中,我们分析了存在frizzled-4人类婴儿的肠神经系统。Frizzled-4可以被免疫组织化学分组人口肠神经元和神经胶质细胞在小和大肠。检测膜肌层的frizzled-4 rt - pcr证实了这种受体的表达在mRNA水平。有趣的是,我们观察到明显的细胞群中的frizzled-4巢蛋白中间丝蛋白和生成受体gydF4y2Ba 我gydF4y2Ba NTRgydF4y2Ba 据报道,神经祖细胞中表达。流式细胞仪分析显示,60%的gydF4y2Ba 我gydF4y2Ba NTRgydF4y2Ba 阳性细胞的膜肌层frizzled-4是积极的。此外,在巨结肠病的病理样本,这个Wnt受体的表达与肠肌神经节细胞的数量和减少从normoganglionic aganglionic大肠的领域。frizzled-4表明该Wnt受体的表达模式可能参与产后发展和/或肠神经系统的功能。gydF4y2Ba

 1。介绍gydF4y2Ba

周围神经系统的神经元和胶质细胞来源于神经嵴干细胞(成都市)gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba]。一个独特的和良好定义的时空模式后,成都市新迁移的神经管在胚胎组织,包括发展中肠道。他们进入原始胚胎9.5天(E)前肠的老鼠和迁移方向rostral-to-caudal为了征服整个肠道E14.5 [gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba]。在人类肠神经嵴细胞的迁移发生在妊娠周4和妊娠7周gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba]。在他们旅行沿着肠道细胞的比例继续增殖,而另一些人则开始分化(gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba)在神经元和胶质细胞为了产生一个复杂的神经网络,坐标肠蠕动和参与监管的分泌活动,血液流动,免疫系统的调制(gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba]。存在发展的障碍会导致不完整的殖民成都市的肠道,导致蠕动失调,肠梗阻,小肠结肠炎中观察到巨结肠病(HSCR) [gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba]。投入了大量精力研究调查神经嵴的遗传调控发展及其衍生物在过去几十年。这导致识别的几个主要途径调节成都市感应、迁移、分化、和互连的神经元和胶质细胞(gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba]。Wnt信号已经被报道在这些发展过程中发挥核心作用在许多生物模型。与骨形态发生蛋白(BMP)的家人和纤维母细胞生长因子,实际上wnt调节神经嵴感应和规范。此外,神经嵴细胞的迁移取决于Wnt信号通路(gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Wnt信号级联是由绑定的Wnt卷曲的跨膜受体家族的成员和结果等通路的激活gydF4y2Ba βgydF4y2Ba-catenin-dependent通路或平面细胞极性(PCP)依赖的途径,这两个已经被证明参与早期神经嵴的发展。最近,卡式肺囊虫肺炎通路已被证明是另外参与调节神经互连在实体开发(gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba]。然而,尽管Wnt-frizzled交互的重要性也建立了早期神经嵴的发展,它的作用在调节产后神经嵴衍生品在很大程度上是未知的。gydF4y2Ba

有趣的是,有证据表明,神经发生在产后继续老鼠gydF4y2Ba 在活的有机体内gydF4y2Ba与5 -羟色胺在刺激或损伤后gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba]。产后存在的分组人口的细胞被认为干细胞像属性一样,虽然这个利基市场还没有好的特点。巢蛋白,低亲和力神经生长因子受体gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 已经提出,CD49b (alpha2-integrin)来表示标记为这个人口肠神经干细胞和祖细胞(gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

卷曲的受体家族的成员,frizzled-4曾被证明是特别感兴趣的关于它的作用在干细胞的规定维护、神经保护、细胞迁移在中枢神经系统(gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba]。在目前的研究中,我们检查了这个Wnt受体的表达在婴儿的肠神经系统,免疫组织化学,rt - pcr和流式细胞术分析。为了描述frizzled-4积极与各种神经细胞群我们colabelling执行实验标记表达在神经和假定的祖细胞的存在。gydF4y2Ba

 2。材料和方法gydF4y2Ba 2.1。人类肠道样品gydF4y2Ba

人类肠道大肠和小样本来自婴儿年龄的男性和女性患者10个月4周,接受手术enterostoma切除后治疗坏死性小肠结肠炎或肛门直肠畸形。此外,组织收集从巨结肠病的病人,他们接受了transanal endorectal度过难关过程(表gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba)。根据指导方针和所有样本收集当地伦理委员会批准后在图宾根大学和病人的父母的同意。gydF4y2Ba

人类肠道样本。gydF4y2Ba

样本数量gydF4y2Ba 性别gydF4y2Ba 病人的年龄gydF4y2Ba 组织gydF4y2Ba 病理学gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 5个月gydF4y2Ba 结肠gydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
2gydF4y2Ba 女gydF4y2Ba 2个月gydF4y2Ba 回肠gydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
3gydF4y2Ba 女gydF4y2Ba 5个月gydF4y2Ba σgydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
4gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 2个月gydF4y2Ba 回肠gydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
5gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 10个月gydF4y2Ba 结肠gydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
6gydF4y2Ba 女gydF4y2Ba 3个月gydF4y2Ba σgydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
7gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 6个月gydF4y2Ba σgydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
8gydF4y2Ba 女gydF4y2Ba 4个月gydF4y2Ba IleocaecalgydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
9gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 7个月gydF4y2Ba 结肠gydF4y2Ba NormoganglionicgydF4y2Ba
10gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 4周gydF4y2Ba 结肠gydF4y2Ba 巨结肠gydF4y2Ba
11gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 6周gydF4y2Ba 结肠gydF4y2Ba 巨结肠gydF4y2Ba
12gydF4y2Ba 男性gydF4y2Ba 7个月gydF4y2Ba 结肠gydF4y2Ba 巨结肠gydF4y2Ba

2.2。免疫组织化学gydF4y2Ba

免疫组织化学进行14gydF4y2Ba μgydF4y2Ba米厚cryosections。组织幻灯片固定在4% (w / v)多聚甲醛在磷酸盐(PBS, pH值7.4)20分钟在室温和随后在PBS冲洗三次。幻灯片,沾ABC-detection系统(向量实验室,彼得伯勒、英国),另外在预处理3% (v / v)过氧化氢PBS溶液10分钟阻止内生氧化酵素。孵化后血清含有阻止缓冲区(PBS含有0.1% (w / v) BSA, 4% (v / v)山羊血清,和0.3% (v / v)特里同x - 100) 30分钟,部分是孵化主要抗体在PBS稀释,0.1% (w / v) BSA, 0.1% (v / v)特里同x - 100一夜之间在4°C。表列出主要抗体和浓度gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba。三个洗PBS, 30分钟的部分和二次孵化抗体室温相同的缓冲区。检测与执行fluorochrome-conjugated二级抗体(1:400年,山羊anti-rabbit IgG-Cy3 (Dianova,汉堡,德国);山羊anti-mouse IgG-Cy3 (Dianova,汉堡,德国);山羊anti-mouse IgG-Alexa 488(生活技术,达姆施塔特,德国))或生物素化的二次抗体(1:400年,猪anti-rabbit IgG-biotin和兔anti-mouse IgG-biotin (Dako,汉堡,德国))当使用ABC-detection系统。孵化的AB试剂进行根据制造商和ABC系统的可视化进行了3 - 3′diaminobenzidine(轻拍,σ,Taufkirchen,德国)和过氧化氢的解决方案。荧光检测,部分细胞被洗了三次在PBS和另外与DAPI染色(4′6-diamidino-2-phenylindole, 0.2gydF4y2Ba μgydF4y2Bag / mL) PBS溶液10分钟。彩色部分是干,嵌入在凯撒的明胶(默克公司,达姆施塔特,德国),在倒置显微镜和拍照(Axiovert,蔡司,耶拿,德国)。gydF4y2Ba

主要抗体用于细胞分析。gydF4y2Ba

主要的抗体gydF4y2Ba 物种gydF4y2Ba 稀释gydF4y2Ba 制造商gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba光滑的肌肉肌动蛋白gydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:100gydF4y2Ba 春天生物科学,美国普林斯顿gydF4y2Ba
c - kitgydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:500gydF4y2Ba Dako,德国汉堡gydF4y2Ba
Fzd4(克隆CH3A4)gydF4y2Ba ∗gydF4y2Ba 鼠标gydF4y2Ba 未搀水的gydF4y2Ba 内部(HJB)gydF4y2Ba
Fzd4 PE(克隆CH3A4)gydF4y2Ba ∗gydF4y2Ba 鼠标gydF4y2Ba 1:50gydF4y2Ba 美国圣地亚哥BiolegendgydF4y2Ba
GFAPgydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:400gydF4y2Ba Dako,德国汉堡gydF4y2Ba
巢蛋白gydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:1000gydF4y2Ba Abcam,英国剑桥gydF4y2Ba
我gydF4y2BaNTRgydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:500gydF4y2Ba Promega,麦迪逊,美国gydF4y2Ba
我gydF4y2BaNTRgydF4y2BaAPCgydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:50gydF4y2Ba Miltenyi Bergisch格拉德巴赫,德国gydF4y2Ba
PeripheringydF4y2Ba 兔子gydF4y2Ba 1:200gydF4y2Ba 默克密理博,达姆施塔特,德国gydF4y2Ba

∗gydF4y2Ba 单克隆鼠标反抗体CH3A4对frizzled-4提出与视网膜母细胞瘤细胞系WERI-RB-1和特异性免疫frizzled-4被选择性的识别与人类frizzled-4 hek - 293细胞转染。这个分子是集群CD344 HCDM车间在魁北克,加拿大(gydF4y2Ba http://www.hcdm.org/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

 2.3。RNA隔离和rt - pcrgydF4y2Ba

人类肠道样本机械切割立体显微镜的视觉教具。处理后的残余和肠系膜脂肪组织,膜肌层剥落黏膜下和粘膜层和彻底剁碎。总RNA从人类分离膜肌层使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。可能污染基因组DNA被治疗DNase我(生活技术,达姆施塔特,德国)。逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)反应含有益生元- (dT)gydF4y2Ba23gydF4y2Ba锚定信使rna引物(Sigma-Aldrich、Taufkirchen、德国),上标二世逆转录酶酶和核糖核酸酶进行根据供应商的协议(生活技术,达姆施塔特,德国)。gydF4y2Ba

放大frizzled-4受体和管家基因GAPDH,以下引物对(Sigma-Aldrich Taufkirchen,德国)。gydF4y2Ba

Frizzled-4(产品尺寸:605 bp):gydF4y2Ba

5′-CTCGGCTACAACGTGACCAAGAT-3′,gydF4y2Ba

5′-AATATGATGGGGCGCTCAGGGTA-3′;gydF4y2Ba

GAPDH(产品尺寸:452 bp):gydF4y2Ba

5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,gydF4y2Ba

5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。gydF4y2Ba

PCR反应混合物是5分钟在95°C的环境,其次是35周期95°C的30年代,退火温度(gydF4y2Ba TgydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba ngydF4y2Ba )40年代和72°C 40年代,和最后一个周期的长时间的延长时间10分钟在72°C。primer-specific退火温度如下:gydF4y2Ba TgydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba ngydF4y2Ba (frizzled-4) = 58°C和gydF4y2Ba TgydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba ngydF4y2Ba (GAPDH) = 60°C。放大PCR电泳分析的产品1% (w / v)琼脂糖凝胶(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)1 x此种缓冲(硼酸三基地和EDTA)在100 v。溴化乙锭(2的产品可视化gydF4y2Ba μgydF4y2Ba在紫外线g / mL)。每个PCR产物的大小估计通过使用100个基点DNA梯标准(生活技术,达姆施塔特,德国)。RT一步是省略了作为可能的污染控制DNase-treated与剩余样品基因组DNA(负控制)。gydF4y2Ba

 2.4。流式细胞术gydF4y2Ba

细胞用于流式细胞术分析获得人体组织的消化膜肌层与750 U /毫升胶原酶XI(σ,Taufkirchen,德国)和0.5% w / v Dispase II(罗氏,曼海姆,德国)在哈佛商学院gydF4y2Ba CgydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba +gydF4y2Ba /gydF4y2Ba 米gydF4y2Ba ggydF4y2Ba 2gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 。消化是最大的1 h在37°C,为了避免消化表面抗原表位。组织残留被丢弃和上层清液离心机7分钟210 g,与哈佛商学院洗两次,透过一个40gydF4y2Ba μgydF4y2Bam细胞的过滤器。结果细胞颗粒是resuspended 20gydF4y2Ba μgydF4y2BaL阻断缓冲区(polyglobin (Talecris Biotherapeutics,法兰克福,德国)稀释1:10 DPBS / 0.5% BSA (0.5% (w / v) BSA在杜尔贝科的PBSgydF4y2Ba CgydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba +gydF4y2Ba /gydF4y2Ba 米gydF4y2Ba ggydF4y2Ba 2gydF4y2Ba +gydF4y2Ba ))和孵化冰10分钟。随后,细胞被稀释DPBS / 0.5% (w / v) BSA浓度2×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞每50gydF4y2Ba μgydF4y2BaL和抗体增加15分钟在冰上。gydF4y2Ba PgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 与兔抗检测gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba apc (CD271 Miltenyi Bergisch格拉德巴赫,德国,1:50)。染色的frizzled-4实现通过孵化用鼠标anti-frizzled-4抗体(25gydF4y2Ba μgydF4y2BaL / 10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞,未稀释的杂种细胞上清液)后面跟着一只兔子anti-mouse IgG-FITC二级抗体(Dako,汉堡,德国,1:15)或使用鼠标anti-frizzled-4 PE-conjugated抗体(美国圣地亚哥Biolegend, 1: 50)。所有染色比较根据同形像控件(兔子IgG-APC (Miltenyi Bergisch格拉德巴赫,德国,1:50),小鼠免疫球蛋白(Biozol、决定、德国,1:1000),和鼠标IgG-PE(美国圣地亚哥Biolegend, 1: 50)),并且没有差异的数量和强度frizzled-4染色观察之间的两个不同的染色过程。孵化后的抗体,细胞被洗DPBS / 0.5% (v / v) BSA和离心机7分钟和210克在4°C。由此产生的颗粒在DPBS resuspended / 0.5% bsa和收购FACSCanto II系统(BD生物科学、海德堡、德国)。数据分析使用FlowJo软件。gydF4y2Ba

 3所示。结果gydF4y2Ba

在目前的研究中,我们分析了Wnt受体的表达在人类婴儿的肠神经系统frizzled-4 4周和10个月之间。首先,免疫组织化学染色过程frizzled-4糖蛋白进行低温恒温器部分从小型和大肠。阳性细胞可以观察到在肠道壁的所有层(数据gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba)。rt - pcr分析,信使rna分离膜肌层frizzled-4受体信使rna的存在(图确认gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba)。进一步描述积极的细胞群,coimmunostaining过程frizzled-4 peripherin和GFAP进行。如数据所示gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba这个Wnt受体表达在不同强度在肠神经元和神经胶质细胞的亚种群(数字gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba)。Frizzled-4 immunopositive神经扩展观察膜肌层,粘膜下层,固有层粘膜(数字gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba)。值得注意的是,上皮隐窝的底部也包围frizzled-4积极神经扩展(图gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba)。此外,Wnt受体在细胞群表达costained中间丝巢蛋白和生成受体gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (数据gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba)。有趣的是,的数量gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 阳性细胞,coexpressed frizzled-4 / ganglia是高度可变的,即使在相同的肠道。Frizzled-4并不存在于平滑肌细胞的膜肌层,膜粘膜,或血管壁,也没有在卡哈尔间质细胞,沾染了c - kit(图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Wnt受体frizzled-4表达神经细胞在所有层的肠道壁。免疫组织化学分析frizzled-4 (Fzd4),gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba ,巢蛋白表达在低温恒温器的部分人类结肠(示例1)。((a1) - (a3))的概述的总和gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (绿色)和Fzd4(红色)疣状;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (a1);Fzd4 (a2);合并(a3);DAPI(蓝色);膜肌层(TM);粘膜下层(TSM);酒吧规模:200gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。((b1) - (b3))更高放大的总和gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (绿色)和Fzd4(红色)肠肌神经节组织化学染色;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (b1);Fzd4 (b2);合并(b3);DAPI(蓝色);酒吧规模:50gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。((c1) - (c3))结合巢蛋白(绿色)和Fzd4(红色)肠肌神经节组织化学染色;巢蛋白(c1);Fzd4 (c2);合并(c3);DAPI(蓝色);酒吧规模:50gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

Frizzled-4检测到在一个族群的神经细胞。免疫荧光的frizzled-4 (Fzd4),gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 巢蛋白,peripherin、GFAP和c - kit低温恒温器部分的人类回肠(样品号2)。((a1) - (a3))的总和gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (绿色)和Fzd4(红色)肠肌神经节组织化学染色;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (a1);Fzd4 (a2);合并(a3);DAPI(蓝色)。((b1)——(b3)结合巢蛋白(绿色)和Fzd4(红色)肠肌神经节组织化学染色;巢蛋白(b1);Fzd4 (b2);合并(b3);DAPI(蓝色)。((c1) - (c3)结合peripherin(绿色)和Fzd4(红色)肠肌神经节组织化学染色; peripherin (c1); Fzd4 (c2); merge (c3); DAPI (blue). (d1–d3) Combined GFAP (green) and Fzd4 (red) immunostaining of myenteric ganglia; GFAP (d1); Fzd4 (d2); merge (d3); DAPI (blue). ((e1)–(e3)) Combined c-kit (green) and Fzd4 (red) immunostaining of myenteric ganglia; c-kit (e1); Fzd4 (e2); merge (e3); DAPI (blue); scale bar (a–e): 100  μgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

粘膜上皮隐窝的包围frizzled-4积极神经扩展。免疫荧光的frizzled-4 (Fzd4)低温恒温器的部分人类回肠;(样品号2)。((a1) - (a3))矢状切面。结合Fzd4(红色)和DAPI(蓝色)荧光染色(a1);结合Fzd4荧光(红色)和brightfield视图(a2);合并(a3)。马克的虚线边界隐窝上皮细胞之间的基础和固有层粘膜。白色箭头指示板的边界(LMM)粘膜固有层粘膜和粘膜下层(TSM);酒吧规模:50gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。((b1) - (b3))地下室的水平部分地区。结合Fzd4(红色)和DAPI(蓝色)荧光染色(b1);结合Fzd4(红色)荧光和brightfield视图(b2);合并(b3)。马克的虚线之间的边界一些隐窝上皮细胞和固有层粘膜;比例尺(a, b): 50gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

rt - pcr鉴定frizzled-4 (Fzd4) mRNA。总RNA分离膜肌层。各自的引物对用于检测Fzd4(605个基点)和管家基因GAPDH(452个基点)。孤立的RNA没有后续的逆转录酶步骤作为消极的控制。gydF4y2Ba

总之,我们通过免疫组织化学方法显示,frizzled-4肠神经系统细胞表达族群,peripherin阳性,GFAP和gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

为了量化frizzled-4积极的细胞群,保持酶的消化和immunolabeled细胞分离膜肌层与frizzled-4抗体染色和流式细胞术分析(图gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba)。使用这种方法,可以检测到不同的细胞群在六个独立实验:12.3%±5.9%(平均±SD)分析细胞染色阳性frizzled-4相比19.7%±9.2%(平均±SD)生成受体阳性的细胞gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 。事实上,colabelling实验表明,60.0%±16.2%(平均±标准差)gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 阳性细胞表达Wnt受体,而几乎所有细胞发现阳性frizzled-4也表达了gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba (93.3%±8.9%(平均±SD))。因此,我们可以确定一个double-positive族群gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba +gydF4y2Ba frizzled-4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,这是清晰可辨的frizzled-4消极的人口。gydF4y2Ba

一个明显的frizzled-4积极用流式细胞仪观察细胞群。流式细胞术分析gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 和frizzled-4 (Fzd4)表达在细胞分离膜肌层(样本数量3,5 - 9)。(a, b)直方图gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba apc和Fzd4-FITC相比各自的同形像控制。同形像控制染色显示为灰色的直方图。(c)代表点的情节gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba apc和Fzd4-FITC costained细胞。数据显示在每个门染色细胞的百分比。(d)的百分比量化清白的,gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba Fzd4正,gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba / Fzd4 costained细胞从六个独立的实验。数据表示为均值±SD总细胞数的百分比。gydF4y2Ba

接下来,我们调查了肠道的Wnt受体表达模式的样本三个有巨结肠病的病人。在图gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba代表peripherin cryosection染色法显示的概述,这是切片的“瑞士卷”组织巨结肠病(图gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba)。在这些章节中,神经节的大小和数量会从口腔到肛门的减少。肌间神经丛的基本表达peripherin肛门(aganglionic)一端代表peripherin表达肠肌神经纤维(gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba]。免疫组织化学分析frizzled-4巢蛋白相比,gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 、peripherin和GFAP透露,与其他标记,frizzled-4拒绝的表达从normoganglionic aganglionic大肠(数字领域gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

从“Swiss-rolled”应用的概述部分切片组织巨结肠病。低温恒温器部分大肠确诊为巨结肠病(样本10号)为peripherin应用;比例尺:5毫米。“Swiss-rolled”组织的中心标志的远端切除肠段。在左上角的微观normoganglionic, hypoglanglionic,和aganglionic地区,是一个完整的,坏了,和虚线。gydF4y2Ba

frizzled-4在巨结肠病的表达减少从口腔到肛门。免疫组织化学分析frizzled-4 (Fzd4)相比gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 在低温恒温器、巢蛋白和peripherin部分大肠确诊为巨结肠病(样品号10)。微观brightfield观点来自normoganglionic、hypoganglionic和aganglionic区域,分别;酒吧规模:200gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

Coimmunostaining过程的并行减少与其他神经标记frizzled-4巨结肠病。免疫荧光的frizzled-4 (Fzd4、红色)结合gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 巢蛋白,peripherin, GFAP(绿色)在低温恒温器部分大肠确诊为巨结肠病(样本10号);细胞核与DAPI可视化(蓝色)。荧光的观点来自normoganglionic、hypoglanglionic aganglionic区域,分别;酒吧规模:100gydF4y2Ba μgydF4y2Bam。gydF4y2Ba

 4所示。讨论gydF4y2Ba

Wnt信号中扮演一个重要的角色在周围神经系统的发展。诱发和指定神经嵴和参与过程调节神经嵴细胞的迁移和神经连接的形成发展中肠(gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在十frizzled-Wnt受体识别,只有frizzled-4能够强烈Norrin绑定。Norrin是调节血管发展的内耳和视网膜gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba),但也被归因于调解神经影响视网膜神经节细胞(gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba]。人类与Norrie疾病有关,是一种遗传性疾病,主要影响眼睛和导致失明和进步听力损失患者中所占的比例。虽然没有描述的胃肠道症状影响人类,Norrin-frizzled-4交互怀疑发挥重要作用在结肠粘膜再生和结肠肿瘤发生[gydF4y2Ba 24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

此外,frizzled-4基因敲除小鼠患食管功能障碍,除了进步小脑和听觉退化(gydF4y2Ba 25gydF4y2Ba]。而作者认为食管蠕动的变化,而肌肉发育不良和描述的胃肠道存在低影响frizzled-4基因敲除小鼠,细微变化存在体系结构和对肠道功能的影响超出了胃没有详细调查。卷曲的基因的敲除这一事实可能导致深远的胃肠道蠕动的神经源性异常,而实体建筑似乎几乎正常,已经令人印象深刻的证明了Sasselli et al。gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba]。在这些实验中,失去frizzled-3导致实体网络和发育缺陷导致胃肠蠕动障碍。Wnt信号在神经嵴的重要性和存在发展很成熟,这在产后实体通路的作用在很大程度上是未知的。最近,初步数据显示抗炎活性Wnt信号在老鼠的产后肠神经系统(gydF4y2Ba 26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在我们的研究中,我们分析了frizzled-4的表达模式在正常婴儿人类肠道组织,以及组织收集从巨结肠病病人。免疫组织化学分析显示,frizzled-4表达在胃肠道内的神经细胞。亚种群peripherin表达神经元和GFAP阳性神经胶质细胞被染色的各种强度。相比之下,frizzled-4表达在肠平滑肌和卡哈尔间质细胞。有趣的是,frizzled-4表达式也观察到细胞数量呈阳性中间丝巢蛋白和细胞表面抗原gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 。CD49b一起提出了这些蛋白表达存在祖或干细胞(gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba]。事实上,一些证据支持神经发生也发生在产后肠。再生的存在已被证实在小鼠gydF4y2Ba 在活的有机体内gydF4y2Ba经肠道[5 -刺激或损伤后gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba]。此外,产后的隔离能力和传播细胞存在的啮齿动物和男性表示祖的持久性或干细胞就像产后肠神经细胞类型(gydF4y2Ba 27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba]。在这种背景下,合适的标记的识别隔离这些神经祖细胞至关重要的发展基于细胞疗法。有趣的是,我们的流式细胞仪实验显示,> 93%的frizzled-4表达细胞也呈阳性gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba ,而frizzled-4阳性细胞仅占约60%的gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 细胞池。因此,frizzled-4抗体识别的族群gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 阳性细胞和可能代表一个有趣的标志的隔离和表征不同的细胞群。然而,需要进一步的实验研究和比较Fzd4的细胞生物学性质gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba +gydF4y2Ba 和Fzd4gydF4y2Ba−gydF4y2Ba/gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba +gydF4y2Ba 细胞。gydF4y2Ba

有趣的是,我们的immunohistological发现证明上皮隐窝是frizzled-4包围阳性神经扩展。肠道隐窝港口的上皮干细胞间强烈受Wnt信号通路(gydF4y2Ba 31日gydF4y2Ba]。存在的密切本地化细胞扩展这个舱表明上皮干细胞利基可能通过分泌Wnt通路影响肠神经系统受体激动剂如Wnt3a或R-spondin。gydF4y2Ba

诊断程序使用特定的抗体识别巨结肠病等疾病。然而,肠道神经节细胞的识别可以在人体组织是一个挑战,尤其是不成熟的神经节细胞存在于新生儿,这些细胞可以容易混淆与内皮细胞和细胞间质或免疫的起源gydF4y2Ba 32gydF4y2Ba]。此外,在主要诊断抽吸活检标本通常只包括黏膜下神经丛和通常体积小,做出精确的诊断困难。因此,使用几个抗体免疫组织化学分析,针对各种神经元和神经胶质的抗原,提出了提高敏感性和特异性的诊断过程。在这项研究中,我们评估了frizzled-4表达式模式相比其他细胞标记的各个段结肠的病人患有巨结肠病。免疫组织化学进行了gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 巢蛋白,GFAP、peripherin frizzled-4通常ganglionated肠道,过渡区和aganglionic段结肠。检查组织,从normoganglionic frizzled-4阳性细胞的数量下降到大肠aganglionic地区,依照其他神经标记。frizzled-4是否可能是有用的作为一个公认的诊断标记巨结肠病的诊断调查在一个更大的患者群。gydF4y2Ba

 5。结论gydF4y2Ba

在目前的研究中,我们分析了Wnt受体的表达frizzled-4肠神经系统的人类小和大肠。Frizzled-4被发现在一个不同的族群肠神经元和神经胶质和巢蛋白gydF4y2Ba pgydF4y2Ba 75年gydF4y2Ba NgydF4y2Ba TgydF4y2Ba RgydF4y2Ba 阳性细胞在肠道壁的所有层gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba在人类病态样本巨结肠病这个Wnt受体的表达减少从normoganglionic aganglionic大肠的领域。frizzled-4的表达模式表明,Wnt信号通路可能参与了产后发展和/或肠神经系统的功能。更多的研究是必要的”来形容frizzled-4阳性的细胞群,详细阐明这个Wnt受体的生物学作用在产后人类肠道系统。gydF4y2Ba

 利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

 作者的贡献gydF4y2Ba

凯瑟琳Nothelfer和Florian Obermayr贡献了同样的工作。gydF4y2Ba

 确认gydF4y2Ba

作者要感谢Susanne Stachon为她优秀的技术援助。支持的项目的资助德国联邦教育和研究(01 gn0967)。gydF4y2Ba

 Le DouaringydF4y2Ba n·M。gydF4y2Ba 杜宾gydF4y2Ba E。gydF4y2Ba Multipotentiality神经嵴gydF4y2Ba 当前在遗传学和发展意见gydF4y2Ba 2003年gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 529年gydF4y2Ba 536年gydF4y2Ba 10.1016 / j.gde.2003.08.002gydF4y2Ba 他gydF4y2Ba C。gydF4y2Ba UesakagydF4y2Ba T。gydF4y2Ba ManabegydF4y2Ba T。gydF4y2Ba 并gydF4y2Ba Y。gydF4y2Ba NagasawagydF4y2Ba T。gydF4y2Ba NewgreengydF4y2Ba d F。gydF4y2Ba 年轻的gydF4y2Ba h . M。gydF4y2Ba 榎本失败gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba Trans-mesenteric神经嵴细胞的主要来源是结肠肠神经系统gydF4y2Ba 自然神经科学gydF4y2Ba 2012年gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 1211年gydF4y2Ba 1218年gydF4y2Ba 10.1038 / nn.3184gydF4y2Ba ObermayrgydF4y2Ba F。gydF4y2Ba HottagydF4y2Ba R。gydF4y2Ba 榎本失败gydF4y2Ba H。gydF4y2Ba 年轻的gydF4y2Ba h . M。gydF4y2Ba 发展和肠神经系统的发育障碍gydF4y2Ba 自然评论胃肠病学和肝脏病学gydF4y2Ba 2012年gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 43gydF4y2Ba 57gydF4y2Ba 10.1038 / nrgastro.2012.234gydF4y2Ba 华莱士gydF4y2Ba 答:S。gydF4y2Ba 伯恩斯gydF4y2Ba a·J。gydF4y2Ba 肠神经系统的发展,平滑肌和卡哈尔间质细胞在人的胃肠道gydF4y2Ba 细胞和组织的研究gydF4y2Ba 2005年gydF4y2Ba 319年gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba 367年gydF4y2Ba 382年gydF4y2Ba 10.1007 / s00441 - 004 - 1023 - 2gydF4y2Ba 年轻的gydF4y2Ba h . M。gydF4y2Ba 伯格纳gydF4y2Ba a·J。gydF4y2Ba 辛普森gydF4y2Ba m·J。gydF4y2Ba 部gydF4y2Ba 美国J。gydF4y2Ba 郝gydF4y2Ba M . 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H。gydF4y2Ba 王gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba 母鸡gydF4y2Ba R。gydF4y2Ba 革顺gydF4y2Ba m D。gydF4y2Ba 5-HT4受体介导神经保护和神经发生在成年小鼠的肠神经系统gydF4y2Ba 《神经科学杂志》上gydF4y2Ba 2009年gydF4y2Ba 29日gydF4y2Ba 31日gydF4y2Ba 9683年gydF4y2Ba 9699年gydF4y2Ba 10.1523 / jneurosci.1145 - 09.2009gydF4y2Ba 贝克尔gydF4y2Ba lgydF4y2Ba 彼得森gydF4y2Ba J。gydF4y2Ba KulkarnigydF4y2Ba 年代。gydF4y2Ba PasrichagydF4y2Ba p . J。gydF4y2Ba 体外神经发生肠神经节内发生PTEN依赖的方式gydF4y2Ba 《公共科学图书馆•综合》gydF4y2Ba 2013年gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba e59452gydF4y2Ba 10.1371 / journal.pone.0059452gydF4y2Ba 洛根gydF4y2Ba c . 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