文摘

转录因子是工具重复使用的胚胎产生各种各样的血统。因此,他们的激活是一个重要的决定因素的能力特别是触发某些细胞的命运,而不是他人。上下文也间接当考虑指导胚胎干细胞的分化(ESCs)。在这项研究中,我们试图评估胰腺中转录因子1 (PTF1a)激活在引用其propancreatic影响鼠标的ESCs(制)。我们假设一个丰富内胚层的人口将更有效地应对PTF1a和触发胰腺程序比自发分化人口。使用一个在体外我们最近建立了胰腺的发展模式,我们发现,高纯度的诱导PTF1a内胚层没有促进胰腺分化但诱导更多的差异化内胚层,特别是后前肠内胚层,胰腺祖细胞。这些祖细胞从不接受终端分化内分泌或腺泡的表型。然而,一个简短的3 d文化时期,PTF1a感应之前,导致monohormonal胰岛素的生成⁺细胞和amylase-expressing细胞。我们的研究表明,浓缩后前肠内胚层是主管应对PTF1a propancreatic活动;但是一个3 d的文化环境对终端分化的胰腺祖细胞至关重要。

1。介绍

ESCs再生医学由于其蕴含着巨大的潜力无限的自我更新能力和分化的曲目血统,因此被许多分化研究的焦点得到移植细胞类型。例如,制作功能β细胞成功地治愈1型糖尿病的承诺。明确的内胚层(DE)是gastrulation-derived细胞群,最终引起的呼吸道和消化道器官,包括胰腺。因此,努力生成功能β涉及细胞定向分化的ESCs德紧随其后逐步分化胰腺细胞,灵感来自正常的胰腺发育的过程。

几项研究已经使用TGF -β家庭分子如苯丙酸诺龙、节点和BMP4 [1- - - - - -6)或小分子(7,8)模拟内源性节点信号来指定在老鼠和人类的ESCs内胚层的命运。转录因子激活的节点信号包括如homeodomain蛋白质,叫锌指因素,袜HMG蛋白质域,和福克斯forkhead因素(9]。许多基因表达在中胚层德也表示,neuroectoderm,胚胎外的内胚层(EE)。例如,Foxa2表示在德和中胚层;袜17是表达和情感表达,因此没有单一的标记来识别DE。尽管如此,德人口的coexpression FOXA2的10]和SOX17 [11]虽然分别这两个标记并不是专门针对DE。由于ESC分化的异质性文化,德标记和标记的缺席的存在不属预定目标的细胞类型是用来确定DE-enriched人群。DE胰腺细胞进一步分化报道使用生长因子的鸡尾酒,包括FGF10 FGF7、RA,关键信号通路抑制剂,包括‘诺金’,KAAD-cyclopamine, SANT-1, Alk5抑制剂(12- - - - - -16]。

然而,当前的ESCβ细胞分化协议受制于低效率和一代的不成熟polyhormonal细胞以及形成not-so-robust葡萄糖响应性细胞(12,17- - - - - -21]。这让我们相信,一些重要的转录事件是必要的适当的胰腺癌发展人失踪。PTF1a,胰腺的命运的一个关键决定因素,不是缺乏严格表达/分化发表的许多协议(12,13,18,20.,22]。PTF1a所扮演的角色的重要性在提交前肠内皮细胞,胰十二指肠命运的血统被收购阐明胰腺祖细胞在小鼠缺乏PTF1a转基因血统追踪系统(23]。我们曾表明,异位表达PTF1a ESCs鼠标可用于胰腺发展模式在体外和结果的一代monohormonal内分泌细胞嵌入外分泌组织(24]。PTF1a信号的正确的上下文,就足以直接分化ESCs的胰腺血统没有研究到目前为止,并将感兴趣的测试如果PTF1a信号可以克服缺陷在当前方法的区别。在这项研究中,我们使用我们的解决这个问题在体外胰腺的发展模式,其中PTF1a在人口专门的细胞分化诱导或其衍生品。

2。材料和方法

2.1。细胞系

的生成和特征Tet-Ptf1a线是用于描述本研究[24]。

2.2。公司的维护和分化

Tet-Ptf1aESCs维护处于未分化状态在MEF支线层与生活DMEM-high葡萄糖15%的边后卫,100 U青霉素和链霉素,L-glut 2毫米,2毫米NEAA,丙酮酸钠1毫米和0.05毫米β巯基乙醇和培养分化媒体如前所述26),有以下修改。媒体组成的各种差异化协议测试表所示1。初始细胞播种密度还表示对于每一个协议。生长因子是缩写为苯丙酸诺龙(A)、(B) BMP4, bFGF (F)和各自的浓度表示的数字跟随ng / mL。诱导PTF1a表达,文化被暴露于1μg / mL强力霉素(阿霉素)每24小时更新3或4天为个人实验表明。细胞被播种在两个不同的ECM基质、人工基底膜和凝胶的一些实验。协议在图的方法8:细胞被播种密度60000细胞/厘米²制媒体包含岩石抑制剂(y - 27632)在明胶或基底膜基质。细胞在一夜之间被允许附加和德治疗第二天开始。通过添加1 PTF1a被诱导μg / mL阿霉素4天重叠的原始年底前肠内胚层阶段(PF)和胰内胚层阶段(PE)。PE后阶段,文化进一步接受Alk5抑制剂和烟酰胺(一个成熟因素)8天。生长因子的来源/抑制剂,用于这些实验是补充表3表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6939438。

2.3。定量实时聚合酶链反应

细胞被解散和均化在不同阶段收获0.5毫升的缓冲RLT(试剂盒)和RNA分离和纯化使用试剂盒RNAeasy迷你包。QPCR使用应用生物系统公司进行基因表达分析。分析IDs补充表1中给出。Gapdh作为一个内部控制和比较阈值方法被用来量化转录丰度。

2.4。Immunofluorescent染色

疣状如前所述执行由卡亨et al。27]。抗体和稀释补充表2中列出。二次抗体是488、568和647 Alexa萤石的抗体,anti-mouse, anti-rabbit提高山羊或驴。用DAPI标记核细胞复染色。盖玻片与附着彩色细胞被安装在玻片延长黄金不变色试剂(表达载体)。图像生成使用A1R-Si尼康共焦或蔡司显微镜Axiovert 200。

Immunofluorescent染色也用于定性测量关键转录因子的表达在分化。流式细胞术在许多不相容样本包括3 d结构很难消化,单个细胞进行流式细胞仪分析。因此,它决定costaining和手工计算方法将用于量化所有样品保持一致性。区分使用多种协议制后,文化是costained Foxa2和Sox17的内胚层阶段和Pdx1 Nkx6.1在胰腺内胚层阶段。单一的表达和coexpressing细胞数生物复制和列在下表中1。表1也表明播种密度、格式的文化板块、聚集或分散的表达标记的存在。

3所示。结果

3.1。对确定的内胚层细胞播种密度有重要影响的一代

我们发表EB-based差异化协议涉及到培养ESCs鼠标悬浮拟胚体,镀1% SR结果在异质文化,只有一些细胞coexpressing SOX17 FOXA2,德(补充图的两个标记)[24]。探索的问题PTF1a感应内胚层上下文,我们追求发电效率。众多DE-induction协议测试使用生长因子的TGF -β家庭,包括节点、苯丙酸诺龙,BMP4和小分子(表1)。各种协议中一个普遍的主题是播种密度对细胞分化的影响结果。低细胞密度提升DE分化无关的协议或用于细胞培养板的格式。适应工厂的协议(17],最初设计为,24-well板块公司的差异化是更有效的在生成的初始细胞播种100000细胞/好与300000细胞/好(对应于一个~ 50000细胞的细胞密度/厘米²和~ 150000细胞/厘米²、职责),评估Foxa2,T,Sox17成绩单,染色FOXA2和SOX17(表1)。AB10(苯丙酸诺龙100 ng / mL, BMP4 10 ng / mL)和FAB10 (bFGF 100 ng / mL,苯丙酸诺龙100 ng / mL, BMP4 10 ng / mL)产生更多的条件Foxa2,T,Sox17成绩单在文化与100000细胞/播种比播种与300000细胞/(图1(一))。同样,另一个协议由汉森et al。5]利用苯丙酸诺龙一分之一定义N2B27媒介更成功在96 -孔板细胞密度较低的1000细胞/(~ 3000细胞/厘米²)与5000年相比细胞/(15000细胞/厘米²)。这种模式是,观察两种不同浓度的苯丙酸诺龙(图1 (b))。Immunofluorescent costaining FOXA2和SOX17符合记录概要文件显示,较低的文化开始形成的细胞密度比高密度德文化。此外,SOX17⁺FOXA2⁺细胞总是在殖民地的边缘(图观察1 (c))可能表明DE形成需要较少的信息联系。

3.2。在单层Endodermal-Derived细胞诱导PTF1a Pdx1生成⁺Nkx6.1⁺胰腺祖细胞

实现DE来自公司的单层文化的分化与低收益率具有挑战性和糟糕的细胞生存。Tet-Pt1a制受到几个DE差异化协议发表在数年。最初的协议测试形成S0X17效率很低⁺FOXA2⁺细胞。后续协议做了修改基底媒体和添加剂和/或生长因子的浓度和改善德报道形成(5,17),这也导致健壮的德的一代Tet-Ptf1a细胞。总结了这些协议的结果表1。治疗与苯丙酸诺龙、节点和IDE1催生了DE SOX17为标志⁺FOXA2⁺细胞(补充图)和ECADH⁺FOXA2⁺细胞和一些ECADH⁻FOXA2⁺中胚层细胞(补充图在不同的频率。节点是最有效的在大多数细胞转化为德表示SOX17的数量⁺FOXA2⁺和ECADH⁺FOXA2⁺细胞。异位PTF1a表达诱导在德从许多这些协议来测试假设PTF1a活动触发胰腺发育程序更有效地在一个内胚层丰富人口相比,自发分化EB文化,最终导致增强胰腺分化。Pdx1激活被指定为第一个里程碑的胰腺分化,特别是胰腺天真的内胚层的规范。短PTF1a归纳为3天(1μg / mL强力霉素),德代后按顺序或重叠的最后2天德代,。PDX1表达评估(从3到4天)后不久PTF1a归纳。分散Pdx1⁺细胞被发现在文化发展使用汉森协议(5),而nodal-generated德(7)生产Pdx1⁺后开花如集群顺序PTF1a感应(数据没有显示)。然而,当这些文化分析了一周后,PDX1表达式没有(编译表结果1)。这些观察表明,未成形的SOX17⁺FOXA2⁺德人口没有正确的细胞环境应对PTF1a活动。

因此,我们追求天真的内胚层的进一步分化成原始消化管(PG)和后验前肠内胚层(PF)(修改Melton协议)诱导PTF1a之前建立正确的细胞类型。苯丙酸诺龙(50 ng / mL)或节点在低血清(1000 ng / mL)媒体被用来生成内胚层。标记,Sox17和Foxa2,明显调节激活素A -和Nodal-DE相比控制文化(没有收到生长因子的细胞,但在相同的培养基地媒体表明自发分化)(图2(一个))。苯丙酸诺龙——和Nodal-DE SOX17⁺FOXA2⁺细胞比控制文化,和控制文化也大量SOX17⁻FOXA2⁺中胚层细胞(图2 (b))。作为这两个转录因子也存在于胚胎外的内胚层(EE),重要的是要确定的表达Sox7情感表达的一个标志。值得注意的是,Sox7在德文化中表达降低。此外,Sox1监管机构的外胚层血统Meox1中胚层分化的一个指标,显著降低在苯丙酸诺龙,Nodal-DE比控制(图2(一个))。在后续分化PG和PF之后,分析了文化对PF的标志。有显著较高的Hlxb9和Hnf6成绩单在苯丙酸诺龙A-PF (和、职责)和Nodal-PF (和、职责)相比,控制文化,没有收到任何生长因子。Hnf4a肝脏祖制造商,在激活素表达下调A-PF和Nodal-PF文化表明他们已经指定胰腺血统()。Hnf1B和Pdx1在节点文化(显著升高)(图3(一个))。Immunofluorescent Nodal-PF文化的染色证实了基因表达谱(图3 (b))。PDX1⁺地区,然而,很少,通常出现在HNF6的子集⁺域(图3 (b))。

FGF10参与胰腺祖细胞的增殖(29日,30.),在维护PTF1a表达式的背胰芽(31日]。因此,我们把苯丙酸诺龙A-PF和Nodal-PF FGF10 PTF1a的感应中。PTF1a感应在苯丙酸诺龙A-PF和Nodal-PF文化导致了许多PDX1⁺NKX6.1⁺区域。例如,大域包含小集群NKX6.1 PDX1表达⁺细胞(图可以看出4(一))。Nkx6.1最初胰腺上皮细胞中表达,但它是一个标记的树干域将成为内分泌/管在后期血统。接下来,我们想调查是否胰腺上皮细胞的形成是特定于PTF1a-induced文化还是FGF10所致。与阿霉素诱导Nodal-PF文化,但不是PDX1 FGF10同样对待⁺NKX6.1⁺细胞,尽管人数低于联合治疗(图4 (b)上面一行)。更重要的是,Nodal-PF文化对待FGF10本身不产生任何NKX6.1⁺细胞(图4 (b)第二行)。这些结果表明PTF1a感应很重要来生成一个真正的胰腺上皮祖表型(PDX1⁺NKX6.1⁺),它与FGF10行为表现为协同作用。最重要的是,要注意到诱导PTF1a non-Nodal-PF文化(即。,而不是内胚层的丰富文化)导致一些小PDX1孤立⁺集群和广泛分散NKX6.1表达式(图4 (b)与PDX1,第三行)⁺与许多NKX6.1细胞表达NKX6.1但⁺PDX1⁻细胞。这些NKX6.1⁺PDX1⁻细胞不是胰腺癌和可能的神经血统,高浓度的Sox1如图所示的控制(没有生长因子治疗)文化早期分化(图2(一个))。换句话说,PTF1a活动在内胚层的上下文,具体可在预制的后在前肠内胚层,改善胰腺祖细胞的形成而在自发分化诱导文化。

3.3。成人胰腺细胞类型分化是增强了三维培养德/ PE阶段

进一步分化的单层文化PTF1a-induced激活素A / Nodal-PF,我们没有观察到相应增加胰腺细胞终末分化类型,包括胰岛素⁺胰高血糖素⁺,生长激素抑制素⁺、淀粉酶⁺细胞;事实上,只有罕见的胰岛素⁺细胞被发现。单层文化同质,但缺乏复杂的形态发生和旁分泌信号出现在3 d文化(32,33),因此可能不是最优的方式有效地直接分化为成熟细胞类型。在测试时单层区别在两个不同的ECM基质,明胶或人工基底膜,使用一个协议改编自Sneddon et al。25)(图5),我们观察到一个有趣的现象。浮动EB-like亚种群出现在德和PG阶段Gelatin-coated菜肴。这些球体只源于Gelatin-coated菜可能由于调解cell-ECM交互信号转导过程的差异,这两种基质。它已经表明,钙粘蛋白是更稳定的细胞在基底膜基质比明胶导致人工基底膜更稳定的依恋(34]。意外地是,收集浮动球体,山肩,按协议直到最后阶段分化。

要指出的是,两个ecm倾向的差异产生DE:种子细胞在凝胶表达更多Foxa2对基底膜基质比播种,而Sox17表达两组(补充图之间的可比性)。PTF1a诱导4天重叠与PF的结束阶段,胰腺内胚层的开始(PE)分化,如图5。细胞进一步培养8天在Alk5抑制剂和烟酰胺,成人胰腺细胞类型和终端分化是评估。内分泌激素的记录档案,即胰岛素,Gcg和风场外分泌消化酶,Amy2a,分析了在不同的文化。PTF1a感应后,亚种群在悬架(浮动)或PG阶段(Suspension-DE / Suspension-PG)内分泌和exocrine-specific基因表达比那些在附着文化(图是有区别的6)。Suspension-DE组的最大水平胰岛素,Gcg,Amy2a,而Suspension-PE组最高风场表达式(图6)。文化在悬挂的短暂时间回应更好PTF1a活动和增强显示终端分化。附着的文化中,我们发现,明胶表现好于基底膜基质作为一个ECM衬底Dox-treated分化的细胞的表达明显高于根据Amy2a,Gcg,风场,胰岛素。基底膜基质,然而,似乎促进uninduced内分泌成绩单的表达文化(补充图)。

与基因表达,对淀粉酶和hormone-expressing细胞染色(抗体鸡尾酒对胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素)还透露大量分化PTF1a-induced Suspension-DE / Suspension-PG文化内分泌和腺泡的血统(图7、中、低的行)。定性,似乎Suspension-DE文化产生内分泌腺泡的细胞比Suspension-PG文化。Suspension-DE文化的高放大图像表明淀粉酶⁺和激素⁺细胞是不同的(数字8(一个)和8 (b))和胰岛素⁺文化不表达胰高血糖素细胞(图8 (c)),而大多数表达核PDX1(图8 (d))。

还有另一个不同的方式悬挂和附着文化治疗。要启用回贴,浮动EB-like镀人口15%的边后卫在一夜之间和分化受到后续步骤协议像往常一样。因此,为了排除瞬态血清暴露可能会增强胰脏分化的原因,进行对照实验,一夜之间附着文化收到serum-bolus模仿飞蚊的时期的依恋。从这些文化mRNA表达分析(附着DE / PG)没有显示类似的表达Amy2a,胰岛素,Gcg,或风场成绩单的文化经历了悬浮培养(补充图)和immunofluorescent染色(数据未显示)证实了这些结果,这表明悬挂的物理状态是负责增强胰腺分化,我们观察到。

4所示。讨论

胰腺是一个器官起源于内胚层的,源自于一个狭窄的嘘signaling-excluded地区后前肠内胚层。因此,表达式的上下文关键胰腺转录因子(PDX1和PTF1a)参与胰腺规范非常独特和非常重要的成功激活胰腺程序。之前我们已经表明,异位表达PTF1a EB-based文化导致所有胰腺血统的形成:内分泌腺泡和导管细胞。特别是,在体外文化主要完成形态和分子事件发生在胰腺器官形成。在这些研究中,我们假设感应的PTF1a丰富内胚层的上下文能够带来更好的胰腺细胞的分化并PTF1a可能丢失的元素在当前β细胞分化协议未能生成monohormonal胰岛素⁺细胞。

为此,我们生成使用大量出版协议如表中所示1。这些协议表明糟糕的性能与低效率和/或低细胞生存能力。与有效的分化hESC DE在单层膜使用补充高血清激活素A和低,制已被证明是相当困难(1,3- - - - - -5,16]。在各种试验时,我们观察到的一个共同趋势:细胞播种密度影响内胚层的成功的一代。文化开始分化细胞密度较低的德比是密度高的更容易。我们的发现与相关类似的观察,低细胞密度提升RA-induced PDX1表达为其在文化35),和信息联系被发现抑制胰腺分化。它也表明,制高密度有增长β连环蛋白在质膜池本地化(36)和膜协会β连环蛋白Oct4 /钙粘蛋白与多能性(37]。这些研究表明,高细胞密度甚至可能抑制分化。相反,最近的报告显示矛盾的结果;促进胰腺分化[密度都很高38,39]。尽管如此,高/低是一个相关名词:播种密度在高密度文化(100000细胞/厘米²柴提等)的研究。39)是介于低,高密度的文化在我们的实验(图1(一)),因此建议正常播种密度之间的关系(钟形)和形成。

感应的PTF1a天真的单层DE (SOX17⁺FOXA2⁺Pdx1)人口导致只有罕见⁺细胞集群中更加突出比苯丙酸诺龙Nodal-derived派生DE。有人建议比Nodal-derived DE胜任形态发生和器官规范,因此节点是ESC分化更相关的分子(6]。但是这些细胞没有激活胰腺下游基因的表达,表明未成形的内胚层PTF1a活动不是一个足够的上下文。因此,我们进一步分化单层DE PF,然后诱导PTF1a的表达。重要的是,诱导PTF1a PF人群允许PDX1的生成⁺NKX6.1⁺胰腺祖细胞。FGF10发现PDX1的数量增加⁺NKX6.1⁺细胞与PTF1a活动协同,FGF10单独孤立PDX1生产⁺细胞不表达NKX6.1。因此,我们已经证明的必要性PTF1a表达式后前肠内胚层细胞以获得一个真正的胰腺的命运。然而,PF-derived PDX1⁺NKX6.1⁺在这些文化不接受终端分化细胞。这可以归因于几个因素,其中一个作为FGF10 FGF10的存在已被证实,迫使祖逮捕维护处于增殖状态,并破坏终端分化(30.,40]。

在区分制膜,我们观察到一些细胞自发分离板和形成浮动EB-like人口悬挂特别是在德和PG阶段。收集、金属堆焊、诱导PTF1a和区分这些人口导致相当大的成人胰腺细胞类型的文化,包括腺泡和hormone-expressing细胞。细胞在悬浮在DE阶段最高效地生成的胰腺细胞。此外,胰岛素⁺细胞表达核PDX1和生产没有coexpress胰高糖素表明他们代表成熟β细胞。成长为短时间内细胞悬浮,不知何故,增强的潜力PTF1a-induced制进展终端分化。ESCs的3 d聚合或ESC-derived细胞具有复杂的组装细胞粘连,必不可少的形态发生和juxtacrine /旁分泌信号,失踪的单层文化(32,33]。此外,额外的“感应”从其他生殖细胞类型(s)层可能在3 d文化生成适当的胰腺发展至关重要。此外,EB-based公司的文化已经分化成成功德比单层制(2,41DE标记),以最大峰值在第四天。然而,EBs也表达嘘,胰腺的抑制剂的命运,从第七天42]。这些研究的结果可以用来解释我们的结果:细胞悬浮在两个在低血清激活素A和区分有效DE,随后镀前嘘感应从而绕过胰腺抑制。此外,镀EB-derived细胞暴露于SANT-1,嘘信号传导抑制剂,在PG阶段加强消除嘘活动。

5。结论

从本质上讲,我们已经表明,PTF1a活动在一个内胚层的背景下,特别是在有图案的后验前肠内胚层,改善胰腺祖细胞在制的形成。此外,我们发现,细胞密度和ECM基质影响DE和胰腺细胞的输出类型。最重要的是,PTF1a感应结合悬浮培养分化格式显著增强,所有成人胰腺细胞类型,包括胰岛素⁺monohormonal细胞。这项研究声称PTF1a表达的重要性高纯度endodermal-derived种群的ESCs的分化β例如细胞有效。

缩写

SR: 1%	1%血清替代
德:	明确的内胚层
ECADH:	钙粘蛋白
海尔哥哥:	胚状体的身体
FOXA2:	Forkhead盒蛋白A2
制:	小鼠胚胎干细胞
NKX6.1:	NK6同源框1
No-GF:	没有生长因子治疗
PDX1:	胰腺和十二指肠同源框1
体育:	胰腺内胚层
PF:	后前肠内胚层
答:	原肠
PTF1a:	胰腺特定转录因子1
SOX17:	性别确定区域Y-box17
Tet-Ptf1a:	四环素、强力霉素诱导小鼠胚胎干细胞系。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Gopika g . Nair设计并进行实验,写论文,分析数据。乔恩·s . Odorico设计实验,分析数据,和编辑文章中写道。

确认

作者想感谢以下个人提供重要的试剂:克里斯·赖特anti-PDX1抗体,射线麦克唐纳anti-PTF1a抗体,塞缪尔·普法夫anti-HLXB9抗体,迈克尔Kyba Ainv15细胞系。作者还想承认复合魏斯曼核心设备的培训和使用他们的A1R-Si尼康共焦和流式细胞仪石中剑的机器。金融支持这个项目提供的资金:NIH ARRA dk - 78889 - 1 - a2, JDRF研究批准号2007 - 75,ADA创新奖项,外科学系外科协会奖,维拉斯助理教授奖,和ROTRF /美国总统奖。71612962。

补充材料