使用改良的mRNA转染方法，依赖于细胞外基质生成整合和Xeno-Free iPS细胞

摘要

人类诱导多能干细胞(iPS细胞)在再生医学领域，特别是免疫相容细胞治疗中有着巨大的前景。在临床上使用iPS细胞之前必须解决的最重要的安全相关问题包括生成“无足迹”和“无异种”iPS细胞。在这项研究中，我们试图检验我们最近建立的基于细胞外基质(ECM-)的无异种培养系统是否可以与microrna增强的mRNA重编程方法一起用于生成临床安全的iPS细胞。该方法的显著特点是使用xeno-free / feeder-free文化系统“诱导多能性”细胞的生成和扩张,而不是传统的劳动密集型的文化系统使用人类馈线细胞或人类feeder-conditioned介质和增强mRNA-mediated重组通过小分子核糖核酸的交付。值得注意的是，我们观察到早期出现的iPS细胞集落(~11天)，大量的重编程效率(~ 0.2-0.3%)，esc样集落占总集落的比例(~87.5%)，表明增强的动力学和重编程效率。因此，本研究建立的联合方法为临床安全的iPS细胞(即整合和无异种)的生成和扩展提供了一个有价值的平台，有助于在不久的将来进行免疫匹配细胞治疗。

1.介绍

诱导多能干细胞(iPS细胞)的发现为患者特异性和免疫相容的细胞替代治疗开辟了新的途径[1]。

最初将重编程基因引入人类成纤维细胞的方法依赖于逆转录病毒或慢病毒载体，这导致了不希望的转基因基因随机插入染色体[2那3.]。通过这些病毒载体的转基因的染色体整合可能会根据插入位点引起肿瘤形成，如先前的基因治疗试验中清楚地证明了X链接严重的免疫缺陷[4.-6.]。此外，整合的转基因基因可能由于不完全沉默而在重编程后持续表达，或者在某些情况下，可能由于重新激活而引起完全表达。

因此，用于产生没有染色体整合外源重编程基因的IPS细胞的方法已经快速发展。这些方法包括再生体质粒转染[7.-9.、仙台病毒介导的基因传递[10.]和mRNA转染[11.]。

在这三种不整合的方法中，mRNA转染法显示出一些独特的优势。例如，与episomal质粒转染相比，mRNA转染完全避免了染色体整合的可能性。此外，与episomal质粒转染和仙台病毒感染不同，mRNA转染由于引入的mRNA半衰期短，不需要延长传代时间来去除外源基因的残留表达。然而，需要连续17天转染mrna [11.那12.]是非常费力的，这可能限制了该方法在生产用于细胞治疗的GMP级iPS细胞方面的应用。因此，建立一种更高效、方便的利用mrna生成iPS细胞的方法是很有必要的。

考虑关于IPS细胞的临床应用的另一个重要问题是在严格无异卵状况下的这些细胞的产生和扩展。自由杂草培养可防止非人抗原引起的异脑病变和免疫并发症[13.那14.]。为了进行mRNA介导的重编程，初始和随后的研究使用人饲养细胞和人新生儿成纤维细胞 - （NUFF-）条件培养基[11.那12.那15.那16.]。虽然这些方法使用xeno无条件重编程，制备人类饲养细胞或人类饲养条件培养基是繁琐和劳动密集。因此，建立一种更简单、更方便的mrna介导的细胞替代治疗重编程方案的需求很大。

在本研究中，我们试图通过结合我们之前建立的基于细胞外基质(ECM-)的无异种/无喂养者的人多能干细胞(hPSC)培养系统来建立这种方法[17.]和改进的mrna介导的重编程协议。因为临床上安全的iPS细胞是细胞替代治疗所必需的，这项研究为未来使用iPS细胞的细胞治疗方法提供了一个有用的平台。

2.材料和方法

2.1。细胞培养

该研究得到了韩国CHA大学本当CHA医院伦理委员会的批准(申请号:KNC12005)。人成年真皮成纤维细胞(美国卡尔斯巴德科学细胞研究实验室，美国)在DMEM (WelGENE，大古，韩国)中培养，添加10%胎牛血清(FBS)、2 mM l -谷氨酰胺(Invitrogen公司)和1倍青霉素/链霉素(P/S)(均来自美国卡尔斯巴德Invitrogen公司)。

人类iPS细胞在玻璃素XF (Primorigen Biosciences, Madison, USA)包膜培养皿中培养，使用我们最近建立的无异种/无饲料的hPSC培养基，稍加修改[17.]。简单来说，培养基由DMEM/F12、15%敲除SR XenoFree CTS、1个非必需氨基酸(NEAA)、1个谷氨酰胺(GlutaMAX)、0.1 mM组成β-巯基乙醇，1倍P/S(均来自Invitrogen公司)，10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) (CHA生物技术公司，大jeon，韩国)，10 nM trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)， 5 uM Gö6983 (Tocris, Ellisville, MO, USA)， 1 mM dorsomorphin二盐酸(Tocris)。

2.2。集成和Xeno-Free iPS细胞的生成

本研究中使用的转基因重编程试剂是来自Stemgent, Inc. (Cambridge, MA, USA)的好意。该系统由一个microRNA鸡尾酒溶液(20 uM)组成，其中包含执行重编程功能的microRNA，包括mir302a-d和mir367，以及一个mRNA鸡尾酒，其中包含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28的mRNA，摩尔化学计量比分别为3:1:1:1。每个mRNA的浓度为100 ng/μL.使用这些试剂生成iPS细胞按照Stemgent, Inc.提供的方案进行，只做了少量的修改[11.]。

为了产生诱导多能性细胞，首先，将成人真皮成纤维细胞以在6孔培养皿中预先涂有玻璃素XF (10µg / mL)。第二天，在转染前2小时，用我们的无异种/无饲料的hPSC培养基替换培养基。重组B18R蛋白(工作浓度200ng /µL) (eBioscience, Inc.， San Diego, CA, USA)， 1型干扰素抑制剂，此时添加，以促进RNA转染后的细胞活力。使用Stemgent, Inc.的Stemfect RNA转染试剂盒进行RNA转染:1µg和/或3.5µmicroRNA鸡尾酒的L (20µM)与Stemfect转染缓冲液1管混合(总体积50µl）和4 µ将L的Stemfect RNA转染试剂加入第二管的Stemfect转染缓冲液中(总体积为50µl）。将第二管中的混合物加入第一管中，然后轻轻移液总量100 µ联合溶液的L体积。rna -脂质体复合物在室温下孵卵15分钟后，将混合物滴加到培养基中，并轻轻摇动培养皿，以确保rna -脂质体复合物在孔中的均匀分布。细胞培养4小时后，将培养基替换为2ml新鲜的无异种/无饲料的hPSC培养基。mRNA转染从第2天开始连续11天，microRNA转染于细胞播种后第1天和第5天(仅2次)。每天监测iPS细胞集落的出现，并在大约第20-22天通过机械方法选择单个集落进行进一步克隆扩增。

2.3。定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)

总RNA根据制造商的说明使用NucleoSpin RNA II Kit (Macherey-NagelGmbH & Co. KG, Duren, Germany)分离。互补DNA (cDNA)由1µ使用ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japan)检测总RNA g，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA)和StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)在以下条件下进行qRT-PCR分析:DNA在95°C下变性5秒，每个引物对在55-63°C下DNA退火30秒，72°C聚合30秒，共40个循环。人类的β-actin基因作为归一化对照。qRT-PCR实验中使用的引物列于补充表1，可在线获得http://dx.doi.org/10.1155/2016/6853081.．

2.4。在体外分化分析

为了测试其多能性，iPS细胞菌落被机械分离，并在培养皿(SPL Lifesciences, Pocheon, Korea)中悬浮培养，培养基为胚状体(EB)培养基(DMEM/F12, 10%敲除SR XenoFree CTS, 1倍NEAA, 1倍P/S和0.1 mMβ- mercaptoethanol;所有来自Invitrogen）。在3维培养的3-10天后，将EBS连接到Matrigel（BD Biosciences，Bedford，Ma，USA）涂覆的载玻片，并进一步培养在分化培养基中15天（DMEM / F12补充1％NEAA，1x P/ s，0.1毫米β-巯基乙醇，10%胎牛血清用于内胚层和中胚层或DMEM/F12添加1倍NEAA, 1% P/S, 0.1 mMβ- 巯基乙醇，1x N2补充剂和10ng的异位形状的BFGF）。对于这些三种胚层的衍生物的几个代表性标记物用于分化后免疫染色。本研究中使用的抗体列于补充表2中。

2.5。畸胎瘤的形成

约每只小鼠肌肉注射iPS细胞到NOD/SCID小鼠的大腿，并于注射后9-12周切除肿瘤团块。经苏木精和伊红染色后，在肿瘤肿块中发现所有三个胚层结构。

2.6。核型分析

SamKwang医学实验室(韩国首尔Smlab)对从T-25瓶中收获的iPS细胞进行了g显带分析。

2.7。DNA指纹分析

为了确认诱导多能性细胞确实来源于用于诱导多能性细胞生成的成纤维细胞，在韩国基因信息中心(首尔，韩国)比较了诱导多能性细胞和成纤维细胞基因组DNA的DNA指纹。

2.8。酸性亚硫酸盐测序

使用Egene组织SV试剂盒（eNGEALL生物技术，首尔，韩国）提取来自人成纤维细胞，H9-HESC和IPS细胞的基因组DNA，并用EPITECH BISULFITE KIT（QIAGEN GmbH，Hilden，Germany）进行DNA。bisulfite conversion according to the manufacturer’s instructions. The “CpG-rich” promoter regions of the human Oct4 and Nanog genes were amplified using the specific PCR primers listed in S1 Table. The amplified PCR products were subcloned into the TA cloning vector (RBC Bioscience Corp., New Taipei City, Taiwan) and were subjected to sequencing analysis.

2.9。全局基因表达谱分析

根据制造商的议定书，使用核盈宝RNA II套件（Mahcerey-Nagel GmbH＆Co.Kg，Duren，Duren）制备总RNA样品。全球基因表达的分析在Macrogen，Inc。（首尔，韩国）进行了使用2 µ和HumanHT-12 v4表达珠芯片(Illumina, Inc.， San Diego, CA, USA)。微阵列数据存储在公共数据库中，如基因表达综合数据库(GEO，系列记录GSE68035)。

3.结果

3.1。在基于ecm的不依赖于饲养的培养系统中通过RNA转染生成Xeno和足迹的iPS细胞

在我们的实验中，我们试图通过将基于ECM（VITRONECTIN）的异叶/饲养/饲养的HPSC培养系统与MRNA介导的重编程方法组合来产生无异形和无铅IPS细胞。该研究中使用的MRNA重编程方法被修改，使得使用MicroRNA鸡尾酒提高了重编程效率。在细胞播种后的第1天和第5天，将microRNA鸡尾酒转染入成纤维细胞。在播种后第2天开始在第2天开始将OCT4，SOX2，KLF4，C-MYC和LIN28 mRNA的混合物连续11天转染到成纤维细胞中。间充质 - 上皮过渡（Met）的现象在第3天和第5天之间是明显的（图1 (b)，顶行，左两个面板）。ESC样殖民地的初始迹象（用透明边界填充细胞团，并且由具有高核 - 致细胞质比和值得注意的核仁的细胞组成）开始出现在第11天（图1 (b)尽管它们在第13天变得更加明显(图1 (b)(底部一行，最左边的面板)。如果细胞在第14-16天变得太密，它们被分成3个培养皿。大约在第20-22天选择每个esc样菌落，并使用我们基于玻璃体ectin的无异种/无饲养器的hPSC培养系统进行培养。esc样集落形成的效率约为0.2-0.3%(图1 (c))，值得注意的是，esc样菌落占总菌落的比例非常高(~87.5%)(图1 (d)）.在我们选择的ESC样殖民地中，使用两个称为mRNA-IPSC2和mRNA-IPSC11的克隆进行进一步实验。DNA指纹分析证实，这些IPS细胞衍生自用于IPS细胞产生的原始成纤维细胞，而不是由其他多能干细胞（补充表3）的污染物（补充表3）。

综上所述，我们的结果表明，我们的重编程过程高效率和加速动力学。

3.2。成纤维细胞衍生的iPS细胞表现出多能干细胞的典型特征

多次传代的iPS细胞碱性磷酸酶染色阳性，碱性磷酸酶是未分化细胞的早期标志(图)2）.所有的菌落都呈现出清晰的边界和圆形，表明它们处于未分化的状态。为了更仔细地检查这些iPS细胞是否表达未分化细胞的标记物，我们对PSCs特异性的几种抗原进行了免疫染色。Oct4、Sox2、SSEA4、Tra-1-60和Tra1-81在我们基于ecm的无异种/无饲料的hPSC培养系统传代15次的iPS细胞中稳定表达(图)2）.为了检测本研究中使用的抗体的特异性，我们对hesc来源的神经前体进行了免疫染色，其中含有针对一些多能性标记物(如Oct4和Tra1-60)的抗体(补充图1)。

接下来，我们检测了在本研究中生成的两个iPS细胞系中几种未分化细胞标记物的表达水平，并以hESCs和尿源iPS细胞(UNFiPSC1)为阳性对照。此外，用hesc衍生的eb作为阴性对照(图3(一个)）.mRNA-iPSCs中Oct4、Nanog、Sox2、DNMT3B、Zic3和REX1的表达量与hESCs相同。相反，mRNA-iPSCs在外胚层(NCAM、Nestin和Pax6)、中胚层(FoxF1、Hand1和Gata2)和内胚层(AFP和Gata6)谱系中极少表达代表性标记(图)3 (b)-3（d））.

我们使用DNA芯片进一步分析了mRNA-iPSCs的表达模式。全基因组基因表达谱的散点图和热图分析表明，mRNA-iPSCs的基因表达模式与hESCs非常相似(图)4（a）和4 (c)）.然而，mRNA-iPSCs的基因表达模式与mRNA-iPSCs来源的成纤维细胞明显不同(图)4 (b)和4 (c)）.补充表4列出了人类esc富集基因和成纤维细胞富集基因的列表。

PluriTest是一项基于基因表达谱的多能性生物信息学分析，表明mrna -iPS细胞具有多能性，类似于hESCs和其他iPS细胞，包括之前已经建立的UNFiPSC1和ANFiPSC1 [18.] （数字4 (d)和4 (e)）.基因表达数据的层次聚类分析表明，mRNA-iPSC2细胞系更类似于hESCs，而不是源自该细胞系的成纤维细胞(图)4 (f)）.

3.3。多能性相关基因启动子区域甲基化模式分析

我们进行了亚硫酸氢盐测序分析，以研究两个代表性多能性相关基因Oct4和Nanog启动子中的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpGs)的甲基化模式。有证据表明启动子甲基化与基因表达呈负相关[19.]。启动子甲基化mRNA-iPSCs的Oct4和Nanog基因启动子区域的DNA甲基化模式与hESCs相似，但与原始成纤维细胞不同(图)5(一个)）.该结果与MRNA-IPSCS和HESC中的OCT4和NANOG基因的高表达一致（图3(一个)）.

giemsa带状中期mRNA-iPSCs的细胞遗传学分析显示，即使传代至第35代，染色体中也没有明显异常(图)5 (b)）.

3.4。mRNA-IPSCs的多能性在体外和在活的有机体内

为了检测mRNA-iPSCs是否获得多能性，细胞自发分化为三个胚层的衍生物在体外．为此，首先产生EB，然后形成含有10％FBS的培养基中的基质涂层菜肴上的粘附培养物。当在Matrigel分化后15天分析，透明EctOderm（Nestin和III类）的代表性标志物的表达β-微管蛋白(Tuj1))、中胚层(平滑肌动蛋白(SMA)和血小板内皮细胞粘附分子(PECAM))、内胚层(甲胎蛋白(AFP)和FoxA2)(图)6（a））.

当移植到NOD/SCID小鼠中，mRNA-iPSCs发育成畸胎瘤，由来自所有三个胚层(分泌上皮(外胚层)、软骨(中胚层)和肠道(E4)上皮(内胚层)的各种细胞类型组成(图)6（b））.

总之，这些结果清楚地表明在我们的异种和饲养的HPSC培养系统中产生和培养的mRNA-IPSC表现出多能性。

4.讨论

一项基于人类iPS细胞的针对视网膜疾病的临床试验目前正在进行中[20.]，并预计在可预见的将来开始若干试验。因此，产生符合临床要求的安全iPS细胞的需求不断增加。

在无染色体整合的iPS细胞的制备方法中，mRNA转染显示出了重要的优势，如完全避免染色体整合。不同于episomal转染方法，使用mRNA转染方法不需要检查转基因插入到染色体。此外，mRNA转染可以使重编程后的外源遗传物质快速从细胞中移除，减少了残留转基因的不良影响。

然而，这种方法与某些问题相关，在其临床应用之前必须解决:(1)mrna介导的重编程的原始方案需要17天转染才能完成重编程[11.，这是高度劳动密集型的;(2)最初和随后的方案使用人类喂养细胞(即人类新生儿包皮成纤维细胞(NuFF)) [11.或在重编程阶段的nuff条件介质[12.那15.那21.那22.]。使用人饲养细胞或nuff条件培养基既昂贵又费力，需要分别重复制备有丝分裂后的人饲养细胞和收集人饲养条件培养基;(3)迄今为止报道的大多数mRNA重编程协议都使用了不同的培养条件来重编程和扩增生成的iPS细胞。例如，Warren等人在重编程过程中使用NuFF喂养细胞，并使用小鼠胚胎成纤维细胞(mef)来扩增iPS细胞[11.]。最近的mRNA重编程方案在重编程阶段采用nuff条件培养基，随后使用人类喂养细胞[21.或无馈线的定义介质[12.培养iPS细胞。使用不同的培养系统对iPS细胞进行重编程和扩增是不方便和繁琐的，这促使我们寻找一种可以用于iPS细胞生成的整个过程(即重编程阶段和生成的iPS细胞的繁殖)的培养系统。

在本研究中，我们将mRNA转染方法与我们之前开发的无xeno和无饲料的hPSC培养体系相结合，建立了一种更简单、更方便的无xeno和不整合iPS细胞的生成和繁殖方法。这两种系统在无异种iPS细胞的生成和扩增过程中功能相容。本研究中使用的mRNA转染方法在原方案的基础上进行了改进，在重编程阶段加入了两次转染microRNA鸡尾酒。这两个转染与microRNA鸡尾酒被认为是加速动力学和效率的重编程。与此相一致的是，我们在细胞播种后11天检测到esc样菌落，这比Warren等人报道的结果快(~第17天)[11.]。重编程所需的每日mRNA转染总数从17减少[11.]由于MicroRNA鸡尾酒的转染了11。此外，我们发现总菌落中的ESC样菌落的百分比约为87.5％，其显着高于先前报道的结果[2那9.]。综上所述，我们的研究结果表明，microRNAs的混合促进了重编程过程，从而使mrna介导的诱导多能性细胞的生成更加费时费力。

我们的方法的另一个重要特点是使用相同(或非常相似)的无异种/无饲料的hPSC培养基进行iPS细胞的重编程和繁殖，这使得iPS细胞的生成和扩增程序更加简单和方便。我们方法的简单性将促进用于细胞治疗的GMP级非xeno iPS细胞的生产。

据报道，使用MRNA重编程方法的IPS细胞生成的效率是显着的变化（0.04-4.4％）[11.那12.那22.]，它可以至少部分地由用于重编程的体细胞的先天性质，转染效率，引入的重编程因子的数量，培养期间的氧气浓度（5％vs.20％）和培养基/用于重新编程的条件[11.那12.那22.]。例如，在饲养细胞上，重编程效率为1.89%，而在使用以基质凝胶为基础的无饲养细胞培养条件时，重编程效率降至0.22% [22.]。在我们的研究中，我们一致获得了~ 0.2-0.3%的重编程效率在常氧条件下(20% O₂)，采用我们的无异种/无饲养体hPSC培养系统对成人皮肤成纤维细胞进行重编程。

本研究中使用的培养基是完全定义的、无异种的、无饲料的hPSC培养基。在这里，我们证明了这种培养基与改良的mRNA转染方法在诱导多能干细胞的生成和扩增方面具有高度的兼容性。因此，这种基于ecm的无异种/无饲料的hPSC培养系统与改良版本的mRNA转染方法的结合，为生成无足迹和无异种iPS细胞提供了一个快速、高效、有效的平台，用于安全的临床应用。

5。结论

在这里，我们报道，通过结合我们之前开发的基于ecm的无xeno / feederfree hPSC培养系统和改进的mRNA重编程方法，治疗安全(即无xeno和footprint-free)的iPS细胞可以有效地生成和扩展。促进了未来iPS细胞介导的细胞治疗的劳动力和时间有效平台的使用。

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Kang-In Lee和Seo-Young Lee对本文有同贡献。

补充材料

参考文献

1. K. Takahashi和S. Yamanaka，“用定义因子从小鼠胚胎和成纤维细胞培养中诱导多能干细胞”，细胞第126卷，第4期。4, 663-676页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki等人，“通过确定的因素从成人成纤维细胞中诱导多能干细胞”，细胞第131卷，第2期。5, pp. 861-872, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. J. Yu, M. A. Vodyanik, K. Smuga-Otto等，“从人体体细胞中提取的诱导多能干细胞系，”科学第318卷第3期5858页，1917-1920,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. M. cavazana - calvo, S. hacei - bey, G. de Saint Basile等，“人类严重联合免疫缺陷(SCID)-X1病的基因治疗，”科学(第288卷第1期)5466，页669-672,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. S. hacei - bey - abina, C. Von Kalle, M. Schmidt等人，“两名患者在SCID-X1基因治疗后出现lmo2相关克隆T细胞增殖，”科学第302卷第2期5644，页415-419,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. S. hachin - bey - abina, A. Garrigue, G. P. Wang等，“逆转录病毒介导的scd - x1基因治疗后4例患者发生插入性肿瘤，”临床研究杂志(第118卷第1期)9，页3132-3142,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. F. Jia, K. D. Wilson, N. Sun等人，“一种非病毒微圆载体，用于提取人类iPS细胞，”自然方法，第7卷，第2期。3，页197-199,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. J. Yu, K. Hu, K. Smuga-Otto等，“不含载体和转基因序列的人类诱导多能干细胞，”科学第324卷，第3期。5928, 797-801页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. K. Okita，Y. Matsumura，Y. Sato等，“更有效的方法来产生无整合人体IPS细胞”，自然方法第8卷第2期。5，页409-412,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. N. Fusaki, H. Ban, a . Nishiyama, K. Saeki，和M. Hasegawa，“使用基于仙台病毒(一种不整合到宿主基因组中的RNA病毒)的载体高效诱导无转基因的人类多能干细胞，”日本科学院学报B辑:物理和生物科学(第85卷)8，页348-362,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. L. Warren, P. D. Manos, T. Ahfeldt等人，“利用合成修饰的信使rna，高效的重编程实现人类细胞的多能性和定向分化，”细胞干细胞，第7卷，第2期。5，页618-630,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. J. Durruthy-Durruthy, S. F. Briggs, J. Awe等人，“快速高效地将无整合的人诱导多能干细胞转化为gmp级培养条件，”普罗斯一体第9卷第2期。4、文章编号e94231, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. M. J. Martin，A.Muotri，F.Gage和A.Varki，“人胚胎干细胞表达了一种免疫原性非人唾液酸”自然医学，第11卷，第2期。2, 228-232页，2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. A. Heiskanen，T. Satomaa，S. Tiitinen等，“N人类胚胎干细胞和间充质干细胞的-糖基神经氨酸异种抗原污染基本上是可逆的，”干细胞第25卷，没有。1，页197-202,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. L. Warren, Ni Y.， Wang J.， and X. Guo，“无供体来源的人诱导多能干细胞与信使RNA，”科学报告，第657条，第00657条，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. P.K.Mandal和D.J.Rossi，“使用改良的mRNA将人的成纤维细胞重编程为多能性，”自然的协议第8卷第2期。3, pp. 568-582, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. K.-I H.-T。金。李,D.-W。金,D.-Y。“一种基于ecm的培养系统，用于生成和维持无异种的人类iPS细胞，”生物材料第34卷，没有。4, pp. 1041-1050, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. K.-I。Lee, h - t . Kim和d - y。“使用基于细胞外基质的培养条件，从尿液细胞中提取无足迹和异种的人诱导多能干细胞，”生物材料第35卷，没有。29, pp. 830 - 8338, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. S. U. Kass, N. Landsberger和a . P. Wolffe，“DNA甲基化指导了转录起始的时间依赖性抑制，”当代生物学，第7卷，第2期。3, 157-165页，1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 里尔登和西拉诺斯基，“日本干细胞试验激起了嫉妒，”自然，卷。513，没有。7518，pp。287-288,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. C.Boreström，S. Simonsson，L. Enochson等，“无关节软骨的无关节人类诱导多能干细胞具有重新细胞能力：朝向临床级细胞来源的第一步”干细胞转化医学，第3卷，第4卷。4，页433-447,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. P. A. Goh, S. Caxaria, C. Casper等人，“对获得临床相关患者特异性诱导多能干细胞(iPS)的整合自由重编程方法的系统评估，”普罗斯一体第8卷第2期。11、文章ID e81622, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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