文摘
当前的方法在人类胚胎干细胞(hESC)胰腺β细胞分化在很大程度上是基于胰腺上皮的发育研究中获取知识,同时其他的潜在角色支持组织隔间没有被充分研究。一个这样的组织是支持上皮在胚胎器官发生胰腺间质。我们假设的详细描述胰腺间质可能导致小说因素的识别不习惯在当前分化协议。补充现有hESC分化条件,这些因素可能会创建一个更全面的模拟细胞培养的正常发展。来验证我们的假设,我们利用一种新型的转基因小鼠模型分离胰腺间质在不同的胚胎和产后阶段为后续蛋白质组学分析。精制胚胎和产前样品制备和分析条件四个时间点导致了21498年的识别与高信任度映射到1502蛋白质肽。表达式分析pancreata证实存在的三个潜在的细胞分化的重要因素:Galectin-1 (LGALS1) Neuroplastin (NPTN)和层粘连蛋白α2亚基(LAMA2)。两三个因素(LGALS1和LAMA2)增加胰腺祖转录水平的表达hESCβ细胞分化协议发表。此外,LAMA2部分块细胞培养诱导β细胞去分化。立刻,我们提供的证据表明,蛋白质组学分析的支持组织如胰腺间质可以识别潜在的重要因素指导hESC胰腺分化。
1。介绍
从人类一代的功能产生胰岛素的β细胞干细胞数量将为细胞提供一个丰富的资源替代疗法用于治疗1型糖尿病患者。几个细胞培养协议详细的引导差异化hESC [1,2)和人类诱导多能干细胞(iPS)细胞(3,4成胰岛素生产beta-like细胞生成。然而,大多数方法的不成熟,导致低非功能性胰岛素表达细胞。失败的原因可能是缺乏在胚胎胰腺发育的关键因素。获得当前方法主要是基于知识发展研究的途径和转录程序底层小鼠胰腺上皮规范(1- - - - - -4]。相比之下,周围支持组织的贡献,包括间质至关重要在活的有机体内胰腺的形成(3- - - - - -5),尚未充分探讨。最近的证据的重要性凸显间质来自coculture实验表明间充质细胞行推动的扩张hESC-derived内分泌祖细胞(6];然而,这些影响的因素尚未确定。我们假设一个详细的蛋白质组学鉴定胰腺间质产生的因素会导致蛋白质的识别,可以添加到当前ES差异化协议启用更全面模拟正常的发展在体外。
2。实验方法
2.1。老鼠
老鼠用于本研究根据批准的协议维护加州大学旧金山,委员会实验动物资源中心。Nkx3.2 (Bapx1)Cre老鼠前面描述的(7]。R26-YFP液氧(Gt (ROSA) 26琼tm1 Cos (EYFP)从杰克逊实验室获得的)老鼠。
2.2。排序
解剖pancreata在0.4毫克/毫升胶原酶消化P(罗氏)和0.1 ng / mL DNase(σ)稀释在哈佛商学院为30分钟37°C和40毫米过滤器过滤。与PECAM1-PE染色后(eBioscience, 1: 200)和/或DAPI排除死细胞,细胞隔离执行使用流式细胞仪咏叹调(BD)。
2.3。细胞培养
细胞未分化CyT49他(其中,Inc .)保持在小鼠胚胎成纤维细胞支线层(微孔)。分化进行了如前所述[8]。LGALS1 (1μg / mL或5μLAMA2 (5 g / mL)μg / mL), Narpin (3μ米)是获得Peprotech(美国),微孔(美国),分别和生物基础知识(加拿大)。控制纤维母细胞线建立了培养YFP排序+间充质细胞含10%胎牛血清的DMEM至少4通道。去分化分析、孤立的小岛被分散成单个细胞5 - 10分钟孵化0.25%胰蛋白酶(Gibco),其次是细胞过滤。细胞生长在3天poly-D-Lysine coated-plates(微孔)或与5板涂在一夜之间μ人类Merosin g / mL(微孔),这是由LM211和LM221的混合物。
2.4。免疫荧光分析
固定的人类尸体胰腺组织(Prodo)孵化30%蔗糖溶液中紧随其后的是嵌入在10月(TissueTek),低温贮藏,切片。解剖小鼠胰腺组织修复与Z-fix (Anatech),一夜之间在30%蔗糖,孵化和低温贮藏。组织部分沾主要抗体,anti-mouse波形蛋白(1:200年,σ),反波形蛋白(1:50,Calbiochem) anti-YFP / GFP(1: 500年,Abcam) anti-Galectin-1(1: 50,研发系统),anti-LAMA2(1: 200年,恩佐)和anti-PDX1(1: 200年,研发系统),其次是与AlexaFluor染色标记的第二抗体(1:500年,英杰公司)和安装Vectashield媒体(向量)。核与DAPI可视化。图像使用徕卡显微镜SP5或收购一个InCell分析仪2000量化(通用电气医疗集团)。16从每个条件字段被随机选择InCell分析仪和量化的成像。PDX1积极核总核测定使用InCell开发软件(通用电气医疗集团)。
2.5。qPCR分析
总RNA分离与试剂盒(σ)和500 ng是反向转录使用iScript cDNA工具包(Bio-Rad)根据制造商的指示。qPCR分析ABI 7900 HT快速实时PCR系统(应用生物系统公司)使用标准协议。引物序列如下:LGALS1 ATCGTGTGCAACAGCAAGG CCTGGTCGAAGGTGATGC;LAMA2 AAAGATCCTTCCAAGAACAAAATC CGGTCAGCTTCCTGTTCTAAA;NPTN TCTCGCTGTTGCTGGTCTC CCTCTTCACTGGTGACAATCC;NGN3 AAGTCTACCAAAGCTCACGCG GCTCATCGCTCTCTATTCTTTTGC;PDX1 AAGTCTACCAAAGCTCACGCG GTAGGCGCCGCCTGC;真沸点TGTGCACAGGAGCCAAGAGT ATTTTCTTGCTGCCAGTCTGG。Taqman探针:LAMA2 Mm00550083_m1;ACTB 4352933 - 4352933。
2.6。女士的方法
Filter-Aided样本准备(FASP)被用来溶解细胞,用胰蛋白酶消化,恢复胰蛋白酶的肽(9]。肽nano-LC / MS / MS分析。肽是在3小时梯度筛选了20厘米,self-packed C18毛细管柱上Eksigent NanoLC-2D系统。质谱是在热LTQ Velos线性离子阱质谱仪。5最高强度2+或3+从每一个离子扫描选择女士碰撞诱导解离(CID)。
2.7。数据分析
进行蛋白质鉴定和定量使用尖塔(系统的蛋白质识别和相对表达式)高通量蛋白质组学数据分析(分析平台10]。塔尖雇佣了一个新颖的方法来结合开源搜索算法X !串联和OMSSA增加数量的肽和蛋白质识别和显著提高统计评估这些标识。塔尖生成肽识别概率基于逻辑回归模型和一个随机的蛋白质序列数据库搜索,在这种情况下与Uniprot完成鼠标蛋白质组。塔尖使用新修改的蛋白质ID模型聚合肽谱识别成蛋白质识别和生成一个错误发现率阈值(为每个识别蛋白质价值)。塔尖还生成定量估计相对表达分析基于光谱计数(数量的高信任度肽谱匹配)归一化总表达在每个样本。可视化的表达蛋白质组学数据是由热图和分层聚类使用R统计软件(R统计计算的基础)。蛋白质识别在基因本体映射到功能关键词使用朋友[11]。数据被revisualized分离蛋白质组基于这些结果。人类胚胎分化的数据显示为均值±SD。使用双尾学生的数据进行评估以及。
2.8。针对蛋白质组学
层粘连蛋白α2量化样本中使用选择反应监测(SRM)加上稳定同位素稀释质谱法(SID-MS) [12]。从先前的实验中确定两个肽谱库用作层粘连蛋白特征肽α2。我们有这些多肽合成和isotopically标记。每个肽的最高强度y-ions MS / MS谱的谱库被选为记者离子浓度来确定。校准曲线的记者离子强度比值测定的两种不同的合成肽及其isotope-labeled伙伴。isotope-labeled合成肽水平上升到0.5 fmol /样品μL;然后绝对目标肽的浓度取决于合适的同位素比值的MS / MS记者离子校准曲线。轮廓分析软件建立包含列表用于肽序列提取峰值强度值和提供光谱库(13]。
3所示。结果与讨论
在蛋白质组学分析我们使用前面描述的Nkx3.2 Cre鼠标线,它允许在间质Cre重组酶的具体表现,但不是上皮,内皮,胰腺或神经细胞发展中5]。这个鼠标线用于配合Rosa26 loxp停止loxp黄色荧光蛋白(YFP)记者老鼠分离胰腺间质细胞的荧光激活细胞分类(流式细胞仪)对全球蛋白质组学分析(数据1(一)和1 (b))。YFP+间充质细胞能整除~ 500000个细胞的胚胎(e) 15.5(峰值Ngn3表达式,内分泌细胞分化的标志),e17.5(胰岛形成启动),产后一天(p) 2(未成熟的β细胞存在),和好(成熟的β细胞存在)pancreata与纯度的(见图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6183562无蛋白条件下)排序和快速冷冻前分析串联猎枪蛋白质组学为基础的女士。值得注意的是,获得的样本数量是一个数量级低于通常在此类实验中使用的。鉴于这种约束我们使用协议(图1 (c)),最大限度地减少必要的样品清理和恢复了8.6到16.3μ从每个整除克蛋白质。整除一式三份和蛋白质分析识别和量化进行了使用尖顶软件(10)和肽谱匹配UniProt (14]鼠标完成蛋白质组序列数据库。总的来说,我们发现了21498高信任度(大于90%)肽谱匹配在使用我们的方法(图时间点1 (d))。使用尖顶生成的错误发现率(罗斯福)阈值的1%或5%导致842年和1502年蛋白质的鉴定,分别为(图1 (d))。可视化使用归一化光谱计数和分层聚类的热图显示不同的组蛋白基于表达随时间的变化(图2(一个))。进一步筛选蛋白质的基因本体论(去)11条款包括细胞外基质(ECM),分泌,粘连,无翼信号转导通路(WNT)和膜定位导致匹配143总蛋白质。从这些,我们选择两个,Galectin-1 (LGALS1)和Neuroplastin (NPTN)(图2 (b)),为进一步评价,根据他们的表达模式和信息从已发表的研究15,16]。尽管我们采用的方法是一个很好的战略评估大量的蛋白质候选人,许多非常低丰度蛋白质仍低于检出限。鉴于这种警告,我们也追求目标的方法基于初步结果表明角色层粘连蛋白包含了211年和221年α2亚基(LAMA2)β细胞的功能。我们已经指出,流式细胞仪YFP排序+间充质细胞显示重要的浓缩Lama2记录相比,整个胰腺。值得注意的是,Lama2没有发现在胰腺内皮细胞(图和[17]),表明层粘连蛋白的主要来源的间质α2链的胰腺。添加LAMA2部分块细胞培养诱导β细胞的去分化(图)。β细胞标记基因mRNA转录水平Ins1和Mafa在培养的胰岛治疗LAMA2持平而新鲜的小岛,而赖氨酸治疗控制文化显示出显著减少。葡萄糖转运蛋白Glut2在培养的胰岛组织基因表达降低相比,新鲜的小岛,虽然大大减少在LAMA2培养胰岛治疗。此外,Hes1,β细胞去分化的标志18),诱导治疗的LAMA2小岛而控制文化(图)。总的来说,这些数据显示功能角色LAMA2支持β细胞分化状态。我们设计了一个选择反应监测(SRM)分析使用两个合成肽从LAMA2标准,确定蛋白质的平均浓度出现在三个独立的纤维母细胞细胞系建立从YFP排序+间充质细胞和两个样品的新鲜P2新生儿YFP排序+0.032和0.047 fmol /细胞μ分别为L(图2 (c))。值得注意的是,浓度是一个数量级低于通常发现在猎枪蛋白质组学实验使用仪器用于这项研究[19]。串联女士和SRM结果证实采用免疫荧光分析lineage-traced YFP+间充质细胞的pancreata e15.5 e17.5, p2,好。正如所料,YFP+为间充质细胞costain标记波形蛋白(Vim)作为一个积极的控制(图3(a))。这些细胞也表现出LGALS1特定抗体的免疫反应,证实这个因子的蛋白质组学鉴定胰腺间质(图3(b))。由Lama2染色显示一个错综复杂的网络接近YFP-labeled间充质细胞(图3(c))。我们还发现细胞间充质标记阳性VIM或者与一个典型的间叶细胞形态LGALS1立即毗邻产生胰岛素β细胞。这些假定的间充质细胞周围和胰岛内都可以找到健康的人类pancreata(图3(d))。虽然我们不能实现可靠的与现有的抗体染色LAMA2人类胰腺部分和NPTN鼠标或人类部分,qPCR分析净化人类胰岛显示平均0.2 - 5倍的表达LAMA2和NPTN分别记录,内生控制基因TATA框结合蛋白(真沸点)(图3(e))。人工培养的成纤维细胞多,“碳足迹”表示平均2.5 -和11倍LAMA2和NPTN,分别。LGALS1记录在人类成纤维细胞培养和纯化人类胰岛平均406 - 10倍浓缩,分别(图3(e))。这些结果证实的存在因素被老鼠和人类胰岛组织中蛋白质组学分析。
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接下来,我们检查了我们的小说因素能否促进定向分化为其对胰腺内分泌细胞使用我们的最近出版协议(8]。分析qPCR显示转录水平很低或者检测不出来LAMA2和LGALS1控制分化hESC文化在胰腺祖细胞阶段。相比之下,NPTN转录水平,在培养的成纤维细胞或小岛,虽然低于平均高出1.3倍真沸点水平(图)。我们添加了重组LGALS1 LAMA2,以及肽Narpin(如图所示模拟NPTN的绑定活动在体外(16三天]),hESC-derived foregut-like细胞进一步分化为胰腺祖细胞(图4(一))。我们观察到显著差异相对于控制文化扩散的细胞治疗LAMA2或LGALS1(图4 (b))。我们先前表明,间充质细胞支持胰腺癌扩散前驱和后分化内分泌细胞在活的有机体内(5]。虽然LGALS1除了导致显著增加增殖,LAMA2胰腺祖细胞的增殖。这些数据表明离散的影响个体间质因素在特定的发展阶段,而这种可能不同于所有因素的联合效应提供了一个支持性的组织,如胰腺间质,在开发过程中在活的有机体内。胰腺祖标记PDX-1mRNA水平显著增加在实验中孵化LGALS1或LAMA2虽然Narpin孵化并没有显示任何变化(图4 (c))。观察到的增加PDX-1添加后转录水平LGALS浓度依赖性。然而,量化的胰腺祖细胞被PDX-1蛋白表达并没有透露与LGALS1治疗后显著变化,LAMA2或Narpin(图4 (d)),表明因素促进PDX-1表达式不增加PDX-1 +细胞的比例已经很高现在控制条件。此外,LAMA2成绩单的内分泌水平祖标记NGN3(图4 (c)),已知的生成所需所有激素阳性内分泌细胞(20.]。
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总之我们的数据展示的能力来识别小说在β细胞分化因素潜在的重要使用蛋白质组学分析的胰腺间质。此外,我们表明,特定的蛋白质可以被我们的方法在低丰度量化样本。最重要的是,我们表明,三分之二的小说因素选择其他验证可以增强hESCβ细胞分化。这里描述我们的方法不仅仅限于胰腺也可以很容易地采用更好的描述甚至少量的支持细胞和组织分化的血统和器官。我们预计,调整现有hESC分化方法将使一代的细胞培养条件下完全成熟的β细胞。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
概念和设计是由Holger a·拉斯和马提亚Hebrok Kolker尤金。来自国立卫生研究院BCBC的金融支持。Holger a·拉斯利同胞,蕾妮·l·格里尔和克里斯托弗·l·莫斯贡献数据的收集和/或装配。数据分析和解释是由Holger a·拉斯利同胞,克里斯托弗·l·莫斯罗杰·西格顿,兰迪班子,蕾妮·l·格里尔,凯莉Kaihara,尤金Kolker和马提亚Hebrok。Holger Russ和罗杰·西格顿了论文写作。最终批准的纸是由Holger a·拉斯利同胞,克里斯托弗·l·莫斯罗杰·西格顿,兰迪班子,蕾妮·l·格里尔凯莉Kaihara,尤金Kolker和马提亚Hebrok。
确认
作者感谢Hebrok和Kolker实验室成员的评论和讨论。他们要感谢导演西蒙·Efrat博士(以色列特拉维夫大学)的礼物净化人类胰岛RNA和盛鼎博士(美国旧金山格莱斯顿研究所)人包皮成纤维细胞。Holger a·拉斯被理查德·g·克莱因奖学金支持,美国总统奖学金(3-2012-266)。利同胞支持由美国糖尿病协会指导奖。图像采集是由加州大学,旧金山,糖尿病和内分泌学研究中心(DERC)显微镜coreP30 DK63720。胰岛细胞分离是由加州大学,旧金山,糖尿病和内分泌学研究中心(DERC)胰岛核心P30 DK63720。研究马提亚Hebrok实验室支持基金从TCPA格兰特β细胞生物学协会(UO1 DK089541)和利昂娜的资助m . &哈里b·赫尔姆斯利慈善基金。研究实验室的尤金Kolker由美国国家科学基金会支持下的生物基础设施奖0969929,国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所的美国国立卫生研究院的奖项u01 - dk - 089571和u01 dk - 072473年,罗伯特·b·麦克米伦基金会,戈登和贝蒂·摩尔基金会以及西雅图儿童研究机构的奖。
补充材料
补充表1:电子表格包含所有,蛋白质组学的结果。
补充图2 s:答:RNA是隔绝大部分胰腺组织(总胰腺),胰腺内皮细胞(Pecam1 +细胞,分离从总pancreata)流式细胞仪和胰腺间质细胞(Nkx3.2 / YFP +细胞,孤立的流式细胞仪Nkx3.2-Cre; YFP总pancreata)。由qPCR表达水平进行了分析。N = 4。* * * P < 0.005比未经处理的pancreata总。未检测到ND =。B:治疗LAMA2部分抑制culture-induced胰腺β-细胞去分化。RNA提取新鲜孤立的小岛(白色)或从trypsin-dispersed胰岛细胞3天后文化在盘子里涂上要么Poly-D-Lysine(蓝色)或人工Merosin(层粘连蛋白- 211年和-221年,绿色)。N = 4。数据显示一个代表性的两个独立的实验比较结果。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.005, NS =不重要,比刚孤立的小岛。
补充图3 s: Galectin-1和α-2链层粘连蛋白表达只在非常低的水平后12天的他比人类成纤维细胞和胰岛细胞的分化而Neuroplastin很容易探测。定量PCR分析LGALS1, NPTN LAMA2记录在人类包皮成纤维细胞(n = 2)和净化人类胰岛准备(n = 5)(如图2、3),他经过12天的分化(n = 4, 2独立实验)。表达式的值显示为平均褶皱变化±标准差相比内生控制基因的表达水平真沸点。