代胆碱能和多巴胺中间神经元从人类多能干细胞体外相关工具建模的神经障碍病理学和治疗

文摘

神经系统疾病的细胞和分子基础研究了几十年;然而,潜在的机制尚未完全阐明。相对于其他疾病,神经系统疾病的研究非常困难主要是由于无法理解人类的大脑和神经细胞在体内或体外和困难生活在人类死亡的脑组织的考试。尽管各种转基因动物模型的可用性,这些系统仍然不够充分导致物种变异和遗传背景的差异。人类诱导多能干细胞(hiPSCs)从患者体细胞重编程有可能分化成任何细胞类型,包括神经祖细胞和postmitotic神经元;因此,他们打开一个新地区的体外模型神经系统疾病和他们的潜在的治疗。目前,许多协议生成不同的神经元亚型正在开发;然而,大多数人仍然需要进一步优化。在这里,我们强调成就了一代的多巴胺能和胆碱能神经元,影响最大的两个亚型在阿尔茨海默病和帕金森疾病和亨廷顿氏舞蹈症的间接影响。此外,我们讨论的潜在作用hiPSC-derived神经元的建模和治疗神经系统疾病与多巴胺能和胆碱能系统功能障碍有关。

1。介绍

大部分的潜在机制与人类相关的神经功能障碍还没有完全检查。大多数当前的知识神经发育和神经退行性疾病的重点是研究后期神经组织,脊髓和大脑或癌组织(如神经母细胞瘤)。由于缺乏神经解剖器官样本和限制的可能性直接检查住人类神经元,当前对这些疾病的细胞和分子机制的理解是有限的。此外,从尸体解剖研究组织,经常代表疾病的结束阶段并不总是揭示疾病的信息。重大贡献,阐明各种神经系统异常的发病机制一直是由转基因动物模型,可以模拟人类疾病(1]。转基因/基因敲除技术为调查疾病的机制提供一个有用的工具。然而,人类疾病动物模型不能完全概括复杂的表型,只对单基因疾病通常是有限的。

最近发现在多能干细胞技术提供一个新的机会来克服这些限制。生产人类多能干细胞(hPSCs)从不同体细胞血统可以被看作是一个新的工具,允许人类神经系统疾病的治疗方法的发展通过疾病建模、药物筛选和再生医学。

人类胚胎干细胞(为其建立了汤森et al。2)和山中hiPSCs由的集团(3],hPSCs的主要类型,展示无限的自我更新属性和能力分化成三个生殖细胞层(4]。

目前,许多神经系统疾病显著增加趋势,发达国家的人口老龄化,潜在的治疗方法是迫切需要的。如今,阿尔茨海默病和帕金森疾病是最常见的进行性神经退行性疾病在人口老龄化。世界老年报告估计,全球4680万人生活在痴呆和每年检测到超过990万新病例。到2050年,痴呆症患者的总数将增加到1.35亿人。根据欧洲帕金森病协会公布的统计数据,与帕金森病在世界范围内大约有630万人受到影响。代的定义的神经亚型hiPSCs取代影响大脑中的神经元可能是一种有效的方法在中枢神经系统(CNS)疾病治疗。此外,适当的人类细胞体外pathomechanisms模型有关。到目前为止,许多不同的协议被用于hiPSCs分化,因此导致代大数量的神经元亚型:多巴胺、胆碱能、glutamatergic, gaba ergic,运动神经元,外围感觉神经元,神经元中带刺的纹状体(5]。重要的是,在阿尔茨海默病和帕金森疾病,多巴胺能和胆碱能神经元是最经常组神经元的影响。

代的各种协议中描述的功能从hiPSCs多巴胺神经元相对健壮且可再生的,而胆碱能神经元生产仍然需要优化和提高效率。在此,我们将把重点放在最近的成就一代多巴胺能和胆碱能神经元及其潜在使用新的治疗方法的发展。

2。代的特定神经通过多能干细胞分化亚型

神经元形成和大脑的模式是正确的布线的关键,他们大多发生在胚胎神经发生。神经祖细胞位于neuroectodermal层胚胎是由各种信号因素诱导分化成神经元和神经胶质。基于祖位置在大脑发育的过程中,不同的神经元和神经胶质细胞产生。例如,位于腹侧神经祖细胞管产生运动神经元和少突胶质细胞,而中间神经元和星形胶质细胞产生的背祖细胞(6]。除了位置沿神经轴,单一神经元的命运取决于许多因素,包括表观遗传剖面和模式的因素。neuroectoderm内未指明的祖细胞可以分化成各种神经亚型的调制信号通路中涉及骨形态发生蛋白(BMP), Wingless-Type MMTV集成网站家庭(WNT)蛋白质,纤维母细胞生长因子(FGF),维甲酸(RA),和其他信号分子。

许多实验室已经建立了体外分化协议生成神经元。最初的方法是基于为,尽管它们的使用一直是伦理,法律,和社会争议,因为他们的推导从早期胚胎。山中,2007年的集团已生成的人类躯体成纤维细胞通过基因重组的细胞则通过逆转录病毒转导的四个人类转录因子:砰域,类5、转录因子1 (POU5F1),即从其前任的名字octamer-binding转录因子4,因此通常缩写为OCT4、性别确定地区Y-box 2 (SOX2),4 (Kruppel-like因素KLF4),原癌基因(3]。这一发现以来,hiPSCs神经元的生成被认为是一个重要的来源和许多其他类型的细胞。ESCs则类似于在很多方面如pluripotency-related基因/蛋白质的表达、身体胚状体的形成,形成畸胎瘤,能力区分成三个胚芽层。然而,万能的完整程度关系的ESCs仍在评估。

理论上,万能和ESCs都多能性的性质,可以同样用于人类疾病模型。万能和ESCs之间尽管有很多相似之处,有一些差异,对新细胞生成有明显的影响。例如,基因表达谱的分析揭示变化细胞系之间基于他们的起源。“表观遗传记忆”的原始体细胞可能导致一些特定的畸变,阻碍iPSC分化潜能(7]。由于长期体外传播文化和环境条件,万能的基因组完整性受损。因此,基因畸变可能减少重组效率。

尽管有这些没有完全检查问题,几种不同的差异化协议获得多巴胺(图1)和胆碱能神经元hPSCs(图2)已经开发出来。人类已经有潜在的功能分化成专门的细胞类型通过模仿体内发展机制。许多因素如媒体组成、浓度信号因素,电镀细胞密度、和时间的分化和成熟过程和文化系统的物理参数的类型和效率有重大影响生成的细胞,如神经细胞。在下一节中,我们比较了不同的技术生成中脑多巴胺神经元,从hPSCs基底前脑胆碱能神经元。数据1和2提供全面的图片的使用方法、化合物和实验室发表的方法。我们也详细的测试方法是否与不同的PSC (hESC或hiPSC)细胞来源。

2.1。代的多巴胺能神经元

成功已经被转换成多巴胺(DA)神经元取决于模式和信号因素诱导基因表达典型的内生发展中DA神经元。

神经干细胞(nsc)由万能干细胞生产/ ESCs进行归纳与基质coculture馈线细胞如尼龙6和5级(8,16)或在馈线的独立系统。神经上皮的结构由nsc由花结像巢蛋白表达神经标记(NES),配对盒6 (PAX6),性别决定区域Y-box 1 (SOX1)和神经细胞粘附分子(NCAM)。文化的nsc化学定义神经感应介质结果在祖细胞分化成不同的神经元亚型。

第一个实验进行nsc透露,与纤维母细胞生长因子治疗hESC-derived神经前体细胞8 (FGF8)和声波刺猬(嘘)显著增加神经元的数量表达酪氨酸羟化酶(TH),因此成熟DA神经元的比例(17]。的存在胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)在培养基另外增加DA神经元分化(18]。

尽管FGF8和嘘确定DA表型,DA神经元的区域标识(前脑、中脑表型)可以在一个指定chemical-defined媒体组合。最近,两组出版协议生成两种不同类型的的DA神经元;然而,这些研究使用鼠标的ESCs(制)。在第一个,祖细胞分化成中脑DA神经元在FGF8,嘘,抗坏血酸(AA)和他们的成熟是证实了多巴胺释放的介质(19]。在第二项研究中,基质细胞被用来诱导神经元分化的制在无血清条件下没有任何模式的因素。这些基质衍生细胞诱导显著增加的活动,反映在TH-positive神经元的数量产生多巴胺。纹状体DA神经元移植到老鼠后保持TH阳性,因此指示比midbrain-like更forebrain-like多巴胺神经元(20.]。额外的研究表明,SOX1积极神经上皮的细胞来源于为和接触FGF8嘘生成双前脑DA神经元表达的酶。神经上皮细胞前体的治疗阶段SOX1表达会导致形成中脑DA神经元的细胞体和特定的中脑标记,十字的1 (EN1) [21]。在大多数的研究中,证实了DA神经元的表型是大板的形态和功能特征如下:TH表达式,KCl-evoked DA释放,depolarization-induced和tetrodotoxin-sensitive动作电位(8]。然而,DA神经元的区域标识不检查由于缺乏可靠的抗体(例如,限制检测多巴胺转运体(DAT),成熟的标志在培养人类DA神经元)和不同的时间点对转录因子的释放和DA神经元标记表达式。在制,En1转录因子表达与TH重叠在postmitotic TH神经元表达下调。因此,只有低比例的神经元coexpressedEn1在神经元分化(22]。此外,DA神经元的成熟和功能测试在6-hydroxydopamine——(6-OHDA)损伤大鼠。DA神经元的移植来自hPSCs改善行为缺陷(11]。移植的分析表明,大多数的DA神经元移植神经细胞生成,其中一些可以集成到纹状体电路。多巴胺释放从注入大鼠神经细胞触发功能改善22]。

叉头框蛋白A2 (FOXA2)是另一个球员有重要影响的中脑DA神经元的早期开发和维护。中脑多巴胺神经元与稳定的表型定义由FOXA2表达TH,β微管蛋白是来自为接受低剂量的视黄酸和高嘘的活动形式。早期接触WNT1和FGF8a而不是FGF8b高效分化所需的神经祖细胞从底板(FP)中脑DA神经元表达FOXA2(23]。

2009年,钱伯斯等人描述的快速和高效转换为神经元和hiPSCs协同行动的两个SMAD通路的抑制剂,‘诺金’,SB431542 [9]。单一抑制SMAD SB431542通路的表达明显减少NANOG和尾增加类型同源框2 (CDX2),因此导致损失的多能性和通过滋养层谱系分化。‘诺金’会使CDX2表达和压制BMP释放驱动滋养层的命运。只有双SMAD抑制显著提高为神经感应和贴壁培养条件下hiPSCs。接触的细胞生成通过这种方法在第五天嘘和FGF8在每天9终端分化和进一步的文化,直到19日在中补充了AA,脑衍生神经营养因子(BDNF), GDNF,转化生长因子β3 (TGFB3)和环腺3′,5′一磷酸(营)导致微管蛋白的生产,β3第三类(TUBB3) coexpressing TH阳性神经元9]。

中脑DA神经元生成的另一种方法是基于FP策略。FP是由一群细胞与神经源性潜在位于腹侧中线发展中神经管。这方面的细胞分泌可扩散的分子如嘘和Netrin 1 (NTN1)参与神经管合缝处的轴突的延伸模式和指导(24]。FP的神经性潜力建立细胞转录因子的表达,如EN1,orthodenticle同源框2 (OTX2),FOXA2LIM同源框转录因子1α(LMX1A),参与两个监管反馈循环(SHH-FOXA2和WNT1-LMX1A) (25]。分化已经FP细胞,然后激活DA神经元的神经发生是一种另类的方式生成。ESCs人类暴露于高浓度的嘘改变形态和属性对FP细胞(26]。另外,一起嘘WNT可以用来驱动hPSCs中脑FP体细胞。以这种方式生成,中脑DA神经元可以保持几个月体外,而且,在6-OHDA-lesioned小鼠和大鼠移植后,他们演示完成恢复运动活动10]。在腹侧中脑WNT1表达激活神经发生中发挥重要作用。因此,监管WNT1和嘘的神经祖细胞可导致代中脑DA神经元通过替代路线。

2.2。代的胆碱能神经元

基底前脑胆碱能神经元(BFCNs)是大脑皮层胆碱能输入的主要来源,对于记忆和学习是必要的。之前的研究在动物揭示BFCNs在海马神经发生的重要作用27在发展中皮层[]和功能性突触可塑性28]。最大和最好的前脑胆碱能神经元的组织特点是放置在中间神经节隆起(兆欧)。BFCNs主要影响阿尔茨海默氏症。出于这个原因,胆碱能神经元的体外代从人类疾病建模和PSC是一个关键步骤的新细胞替代治疗阿尔茨海默氏症患者。然而,从hPSCs BFCNs分化的数量仍然是非常有限的,生成神经元的区域标识不是很透彻了。

第一个方法的推导BFCNs从为是基于刺激使用扩散配体出现在兆欧发育相关时间段(12]。上述实验的关键的一步是分化hESC-derived神经祖细胞向预处理嘘和FGF8前脑祖的命运。以这种方式神经祖细胞生成和治疗瞬变和骨形态发生蛋白9 (BMP9)有显著提高BFCN标记,如胆碱乙酰转移酶的表达(聊天),乙酰胆碱酯酶(疼痛)和神经生长因子受体(NGFR): TrkA和生成我。胆碱能神经元的标记为其他人群没有检测到。直接治疗为BMP9没有嘘/ FGF8预处理导致胆碱能神经元的缺失。兆欧在开发过程中表达一些转录因子包括LIM同源框8 (LHX8)转录因子29日)和原肠胚形成大脑同源框1转录因子(GBX1)促进BFCN分化30.),由BMP9调节。瞬变的超LHX8和GBX1嘘/ FGF8预处理神经祖细胞导致的高纯度BFCNs人口与长轴突投射和coexpression聊天和我12]。这些神经元体外产生乙酰胆碱和胆碱能突触形成电生理功能移植到小鼠海马切片后的文化。

另一种方法的活跃ChAT-positive胆碱能神经元代关注神经营养因子。神经营养因子的生长因子,通过刺激Trk和我受体,进而负责轴突和树突增长,神经递质调节、和突触可塑性31日]。hESCs-derived神经元细胞与神经营养因子刺激后,脑源性神经营养因子,生成3 (NTF3),睫状神经营养因子(据)和神经生长因子(神经生长因子),显著提高ChAT-positive神经元的比例(15]。然而,与脑源性神经营养因子、神经生长因子刺激的神经祖细胞移植LHX8表达在胚胎前脑的兆欧区域,而据诱导LIM同源框6转录因子(LHX6在其他子域的兆欧)表达式。额外的表达NK2同源框1 (NKX2-1)和ISL LIM同源框1 (ISL1)与前脑胆碱能神经元的发展和coexpression我受体证明BFCNs的存在。此外,这些神经细胞分化产生α3,α4,α7单元的烟碱乙酰胆碱受体和毒蕈碱的乙酰胆碱受体亚型,M1, M2, M3,显示一个重要的角色在hESCs-derived胆碱能神经元(15]。所有上述方法使用特定的外在因素在二维文化生产胆碱能神经元。然而,最新的研究报告了一个新颖的胚状体的身体基础微分系统高效诱导BFCNs [14]。文化的拟胚体在三维系统没有任何额外的因素刺激内在嘘信号导致的表达NKX2-1和LHX8(32]。在终端分化、基底前脑特定nsc产生电活动的胆碱能神经元表达TUBB3,聊天,ISL1,我和移植后能够融入成年鼠大脑(14]。在发布的最新研究胡锦涛et al ., hPSCs被转换为NKX2-1积极兆欧细胞通过使用高浓度的嘘嘘和purmorphamine或组合。增加BFCNs生成的效率,兆欧祖细胞与hPSC-derived cocultured星形胶质细胞在神经生长因子的存在33]。在上述方法中,占总细胞数的40%左右,表达了胆碱能标记提供了一个有效的方法来产生BFCNs多能细胞。

3所示。则提供新的工具来开发治疗胆碱能和多巴胺能系统的失常

目前神经障碍的病因的理解大大扩展。然而,大多数这些疾病的机制仍不清楚。此外,没有有效的治疗或疾病修饰治疗是可行的。因此,patient-derived人类细胞则是一个很好的工具生成的生理相关人类疾病体外模型。干细胞技术可以应用于疾病pathomechanism调查,识别潜在的药物靶点,药物筛选平台,和细胞移植。

新生成的万能patient-derived组织成功地应用于建模的人类神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、脊髓性肌萎缩(SMA),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),和亨廷顿氏舞蹈病)和神经发育障碍(如家族性神经异常,Rett综合症,自闭症谱系障碍(ASD),和唐氏综合症)(表1)。近年来,多巴胺能和胆碱能系统一直是一个重点研究神经发病机理。高效生成功能多巴胺能和胆碱能神经元的影响主要在帕金森症和阿尔茨海默氏症和亨廷顿氏舞蹈症患者,分别可以提供一个重要的工具表示障碍的有效治疗。

3.1。阿尔茨海默氏症和万能

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病和人类痴呆的最常见的类型,影响有八分之一的成年人超过65 (34]。两个广告的主要病理特征是细胞外(β淀粉样蛋白斑块的聚合β神经原纤维缠结蛋白和细胞内(非功能性测试)组成的聚合τ,微管结合蛋白。这些广告特性对神经元有不同的有害影响。一个β可以扰乱突触可塑性包括长期势差(LTP),而非功能性测试可能会影响胞内运输,加上吗β、诱导机制负责突触损失和神经元死亡。

通过某些脑区神经退化的广告发展顺序和选定的亚种群的脆弱的神经元。在普通皮质损伤,BFCNs是广告中最受影响的细胞类型。乙酰胆碱水平降低(ACh)发布的胆碱能神经终端与胆碱能神经传递损失和AD患者认知功能的严重恶化。减少胆碱吸收、乙酰胆碱释放和突触前缺乏胆碱能与积累β蛋白质和细胞内非功能性测试。此外,分析广告的大脑显示降低烟碱和毒蕈碱的M2 ACh突触前神经元胆碱能受体,而突触后终端上的M1, M3受体数量仍不受影响。一些研究表明,胆碱能减少活动可能刺激高τhyperphosphorylation通过增加活动的蛋白激酶C (PKC) [35]。由于干扰神经传递平衡,τ磷酸化和β蛋白质积累增加,这些导致增强的神经退化。BFCNs变性导致注意力不集中,增加了空间记忆下降,进一步损害新情景记忆的编码(36]。

集中行动抑制胆碱酯酶药物如他克林、多奈哌齐,卡巴拉汀,加兰他敏已经被证明为温和症状受益个人提供广告(37]。疼痛抑制剂一起毒蕈碱的受体受体激动剂能够恢复胆碱能平衡和降低β沉积(38]。

最近,一些组织已经开发出一个广告使用万能干细胞疾病模型。源自神经元细胞则来自家族广告(时尚)患者携带突变基因编码淀粉样前体蛋白(APP), presenilin 1 (PSEN1), presenilin 2 (PSEN2)提供一个创新的工具来阐明广告病因和发展有效的疗法。

应用程序的顺序蛋白水解分裂β-secretases和γ-secretases导致的一代β。而γ-secretases裂开c端应用的碎片(APP-CTF)导致生产多种长度的变异β长,变异β(一个β42岁的β43)更容易聚合比短的(β38,β40岁),他们被认为是更多的致病性39]。

近藤等人产生一个广告则从E693删除患者应用基因模型。带有这种突变的神经元细胞内积累β低聚物,导致内质网(ER)和氧化应激。此外,积累了β寡聚物没有proteolytically耐药,治疗AD神经细胞和二十二碳六烯酸(DHA)缓解应激反应(40]。这些结果表明,DHA可能是一个有效的药物对病人的一个子集,使得iPSC技术验证和识别潜在的药物的一个有用的工具。Muratore等人描述万能时尚与突变应用程序(V717I)。这种突变导致更高的应用表现,提升β42岁的β38生产,增加总水平和磷酸化τ在神经元41]。在另一项研究中,患者神经元来自时尚的细胞则重复应用基因显示增加分泌β1-40 phospho-Tau的相对水平,活跃的糖原合成酶激酶3β(GSK3B)。治疗的神经元β分泌酶抑制剂显著降低phospho-Tau和活跃GSK3B的相对水平42]。与PSEN1 fAD-derived万能(A246E)和PSEN2 (N141I)突变也成立。在这两种情况下,增加了一个神经细胞β42分泌和β42/40的比率(43]。的治疗γ分泌酶抑制剂减少一个β40,β在突变体神经元42生产。上述发现来自病人的细胞则是一个好方法重演的广告表型体外,可用于药物发现和改善疾病建模。

最近时间,少数团体成功地生成万能零星的广告(sAD)患者代表超过95%的广告案例。悲伤显示相似的表型的细胞则时尚则包括增加分泌β、高水平的ER和氧化应激和积累扩大RAB5-positive早期核内体(42]。然而,仍有有限的临床发病和课程信息悲伤。新开发的模型,主要是基于二维(2 d)文化系统,可能不反映大脑神经元的影响。由于有限的研究,很难预测神经元是否来源于悲伤显示病理表型的细胞则是能够揭示疾病发展的分子基础。评估一个悲伤的真正价值派生的万能,长期的文化可能需要三维(3 d)系统。此外,集成的小胶质细胞在神经元文化环境因素一起模仿悲伤的风险因素可能显著改善vitro-based实验悲伤的模型。

最近的数据显示,动物和nonneuronal细胞模型用于制药化合物不能充分验证模型的药物反应人类神经元。因此,有一个增加的趋势来检测潜在的药物用于治疗阿尔茨海默病使用patient-derived iPSC的基础系统。

基于在应用或突变的事实γ-secretases组件,PSEN1 PSEN2,导致增加了β42 /β40比和总β水平,等药物β分泌酶和γ分泌酶抑制剂开发(44,45]。非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)被确定为γ分泌酶调节器(gsm)降低β42生产目标γ分泌酶或应用程序(46]。从广告研究进行iPSC-derived神经元病人显示indometacin,布洛芬、双氯芬酸,flurbiprofen显著降低β42 /β40比(46]。治疗γ分泌酶抑制剂,N - [N - (3 5-difluorophenacetyl) 1-alanyl] -S-phenylglycine叔丁基酯(榫眼),或γ分泌酶激活蛋白(GSAP)抑制剂,伊马替尼,导致强烈的下降β40,β42岁的水平。抑制的β40 sc - 560导致增加分泌β42 /β40的比例。其他测试分子包括阿司匹林、萘普生和Rho-associated卷曲螺旋形成蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶(岩石)抑制剂y - 27632对神经元(没有显著影响46]。

3.2。帕金森病和万能

帕金森病(PD)是第二个最常见的进行性神经退行性疾病。PD患者出现各种症状,包括移动缓慢,刚性,低频地震,和平衡的问题。这些重要的运动能力损伤的PD是由于含有多巴胺神经元的变性在黑质致密部(SNC)一篇纹状体多巴胺及其代谢产物的损失(47]。

大多数PD病例是零星的;只有10 - 20%患者存在家族单基因疾病。突变基因,-核蛋白α(SNCA),富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2),帕金RBR E3泛素蛋白连接酶(PARK2),PTEN-induced假定的激酶1 (PINK1),泛素羧基末端酯酶L1 (UCHL1)和beta-glucocerebrosidase (GBA),导致致病性大脑的变化(48]。

在病理级别,PD的特点是聚合的蛋白质的胞质积累的光环辐射纤维和更少的核心定义称为路易的身体。另一个PD-specific特性是氧化应激的增加,这是由于谷胱甘肽耗竭,铁沉积,增加脂质过氧化的标记,氧化DNA损伤和蛋白质氧化,降低线粒体复杂的表达式和活动1在SNC [49]。

几组显示基底前脑胆碱能系统的功能障碍PD患者的存在证实了路易Meynert身体下橄榄核的神经元,大脑胆碱能神经元的主要来源(50]。额外的研究表明突触前在皮层胆碱能标记,减少毒蕈碱的烟碱受体结合位点,在大脑皮层和减少聊天活动,海马体,黑质。受损的分布和突触后胆碱能受体可以与PD衰减。

最近的数据表明,在PD DA神经元的损失符合改变M4受体的胆碱能神经元。纹状体中,由于水平的增加,导致电动机的发展迹象像PD患者的震颤和运动障碍35]。

与大多数其他神经退行性疾病,是一种有效的临时组成的多巴胺替代治疗PD症状与左旋多巴和多巴胺受体激动剂(51]。另一方面,由于神经退化在PD是进步的,没有有效的再生疗法,病人最终成为完全禁用。因此,抑制突触后毒蕈碱的受体导致分泌减少和突触前upregulation烟碱受体分泌多巴胺可以在PD治疗提供一种新的治疗策略。

iPSC技术都提供了一个机会来研究PD表型和机制在家族和零星的病例和识别潜在的药物。

第一家族PD模型之一是万能干细胞来自患者的三倍SNCA基因,编码一个突触vesicle-associated路易小体的蛋白质。DA神经元来自这个病人表现出增加SNCA表达和对氧化应激(52]。其他研究人员生成的万能患者最常见的SNCA基因突变,A53T。与控制相比,这些细胞产生一氧化氮和3-nitrotyrosine (3 nt)和显示积累ER-associated降解基质(53]。DA神经元分化的细胞则来自G2019S突变患者LRRK2基因显示增加关键氧化应激反应基因的表达:HSPB1,NOX1,MAOB,upregulationSNCA。突变体神经元对压力也更敏感代理人:过氧化氢,蛋白酶体抑制剂MG132, 6-OHDA [54]。另一项研究表明,DA神经元由体内基因LRRK2零星的PD或PD的则显示出类似的表型包括更高层次的SNCA SNCA的积累,减少的数量(神经突55]。如果这些结果将可再生的,他们会给我们一个可能性模型还在未来特发性帕金森病病例。尽管这种疾病的未知原因,一小部分特发性帕金森病病例可以归因于遗传因素。虽然代万能特发性帕金森病病人成立,它仍然不确认是否PSC-derived DA神经元证明显然可检测和相关的表型PD体外(56]。由于未知的机制导致零星的PD,可能由于遗传和环境因素的组合,使用同基因的控制比较研究是不可能的。然而,增加患者的细胞系生成能使iPSC模型更可靠的环境中复杂的偶发性帕金森氏病等疾病。

主要的DA神经元也携带突变的细胞则产生PINK1。这个基因编码一个能保护细胞线粒体激酶对线粒体压力和控制线粒体退化。DA神经元与这种缺陷在治疗线粒体应激诱导物增加水平的过氧物酶体proliferator-activated受体γ,共激活剂1α(PPARGC1A)线粒体生物起源的监管机构,和线粒体的数量57]。上述结果表明,不仅遗传背景的神经元,而且他们接触相关的压力可能是必要的适当的建模使用万能干细胞疾病的表型。DA神经元携带突变基因转录增加PARK2单胺氧化酶类,大大块导致更高的DA DA吸收释放。插入突变基因的正确形式救助表型。它表明PARK2控制多巴胺神经传递,抑制多巴胺氧化58]。这些结果提供一个生理相关平台,屏幕在PD疾病修饰治疗的新靶点。

最近,这是显示,则可以被成功地移植到PD动物模型。则有效地刺激到npc和注入大脑产生神经元和神经胶质细胞功能集成与神经组织和成熟的神经活动。中脑DA神经元分化从hiPSCs移植到成人的大脑能够改善大鼠的行为表型影响PD (59]。另一项研究表明,DA神经元产生PD万能干细胞,移植到开发的6-OHDA-lesioned大鼠纹状体轴突预测(60]。Rhee等人证明了来自蛋白质hiPSCs DA神经元移植到大鼠纹状体病变可以拯救汽车赤字(61年]。2005年,岸等人展示了一个可能的雌激素的作用nsc移植的帕金森病。17β雌二醇,雌性激素,增加的数量TH-positive DA神经元在体外。上面的效果是由雌激素受体拮抗剂,废除ICI182780,确认人的角色在DA神经元的分化62年]。由于人的存在在nsc和DA神经元,增加TH-positive神经元与雌激素的神经分化的支持效果和DA神经元成熟的细胞则62年]。

3.3。亨廷顿氏舞蹈症和万能

亨廷顿氏病(HD)是一种遗传进步的障碍,影响了大约10000人。高清的具体功能包括肌张力障碍,运动不协调,认知和情感障碍(83年]。障碍的原因是一个扩大CAG受到多麸醯胺酸三重编码高清基因产物,称为杭丁顿蛋白(http)的蛋白质。这种蛋白质的正常功能了解甚少,一些参与细胞骨架的证据功能。

在病理级别,高清的特点是选择性神经脆弱。第一个区域受到高清caudate-putamen是纹状体的一部分地区。在这个大脑区域、中带刺的GABA神经元严重受损,高达95%的损失在以后阶段的疾病(了84年])。此外,还有在细胞核内的包涵体和细胞核周围的神经炎的骨料高清神经元的计画。早期基因研究高清显示的长度三联体CAG重复扩张与疾病的严重程度呈正相关。谷氨酸毒性,氧化应激和自噬抑制压力刺激CAG扩张,导致更高的细胞毒性5]。

一些研究在人类和小鼠模型表明,也在HD患者胆碱能系统的影响。胆碱能神经元异常被观察,证明聊天活动减少大脑纹状体组织和乙酰胆碱释放显著下降(85年]。证实,水泡乙酰胆碱转运体(VAChT)和聊天阻遏元素1沉默基因调节的转录因子/神经元限制性消音器因素(REST / NRSF) (86年]。交互的其他计画/ NRSF突变蛋白导致镇压一些神经元的特定基因如BDNF和可能导致胆碱能减少标记表达式。在研究期间由史密斯et al .,高清小鼠纹状体的聊天水平降低与计画的数量聚集在胆碱能神经元。这些结果表明,缺陷在胆碱能神经元取决于计画由突变控制机制(85年]。

最近,疼痛抑制剂等提出了他克林为HD治疗潜在的药物由于其恢复胆碱能系统的能力。胆碱、毒扁豆碱、多奈哌齐和其他潜在的药物在HD治疗现在正在测试;然而,恢复记忆的能力,减少运动机能亢进似乎非常有限(35]。

高清神经细胞来自显示相关的疾病表型的细胞则包括代谢的变化,电生理学细胞粘附,细胞毒性。分化高清细胞扩大CAG重复显示基因表达的变化,包括钙粘蛋白家族和TGFB通路。此外,细胞耗氧量和更容易有异常细胞压力和BDNF撤军(69年]。在其他的研究中,HD-generated万能溶酶体活性受损,线粒体碎片,转录抑制因子活性变化[5]。公园等人分化高清特定神经干细胞来自患者iPSC到纹状体神经元。在这些神经细胞,增强细胞凋亡蛋白酶活动检测(3/770年]。高清万能干细胞治疗后线粒体分裂相关蛋白的抑制剂:dynamin 1 (DNM1L)增加细胞生存能力66年]。在体内研究由全和同事,HD-derived神经祖细胞被移植到高清与excitotoxic鼠纹状体病变。行为观察复苏,尽管注射细胞显示高清表型(87年]。以上研究表明,突变校正则需要高清的有效治疗。

药物筛选和测试新的治疗方法使用高清iPSC-derived神经元细胞包括应用压力如谷氨酸毒性、氧化应激、DNA损伤,或生长因子(撤军88年)测试分子抵消效果。例如,肿瘤坏死因子-α(TNFα)抑制剂xpro - 1595减少细胞因子诱导细胞凋亡神经元来自万能的43个cag [89年]。腺苷受体2 a受体激动剂cgs - 21680和亚太经合组织减少氧化应激在细胞毒性暴露在H₂O₂通过减少γ-H2A X(组蛋白家族成员γH2AX)感应和半胱天冬酶3裂90年]。

其他研究已经表明,g蛋白耦合受体52 (GPR52)是参与突变杭丁顿蛋白的毒性。GPR52击倒以及微196 (miR196a)减少杭丁顿蛋白聚集在神经元文化(91年]。此外,GPR52击倒降低半胱天冬酶3活动响应BDNF撤离。此外,BDNF撤军后凝结核的数量降低了过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγδ)活化剂(KD3010) (92年]。许多研究小组描述了药物作用的BDNF或FGF /生活撤军,视为一个压力因素在细胞生存88年]。抑制剂ataxia-telangiectasia突变(ATM)蛋白激酶参与DNA损伤反应,细胞凋亡,细胞内稳态,KU60019,应用于109年和180年CAG混合神经细胞培养显示减少BDNF withdrawal-induced TUNEL-positive核和减少半胱天冬酶3活动(93年]。2015年,在人证明TGF -环β信号通路改变72年高清NSC与cag导致更高的TGF -表达式β。此外,TGF -β1起神经保护作用的NSC模型和一起netrin-1可以减少半胱天冬酶活动(3/794年]。

化合物对已经被表型的影响与压力被Charbord检测et al。相关的研究活动增加抑制因子的转录阻遏休息/ NRSF绑定元素1高清(RE1)序列。成千上万的选择化合物的高通量筛选确定了两个benzoimidazole-5-carboxamide衍生品,抑制RE1-dependent地沉默。72年治疗CAG nsc X5050抑制剂,有针对性的退化,增加了BDNF的表达和其他REST-regulated基因(95年]。2013年,郭等人开发了一种选择性抑制剂(P110-TAT)线粒体分裂蛋白dynamin-related蛋白1 (DRP1)。从HD患者治疗iPSC-derived神经元P110-TAT减少线粒体分裂和改善线粒体功能。此外,P110-TAT增加细胞生存能力和减少神经元的神经突缩短文化程度(96年]。

4所示。结束语

iPSC技术是一种新型的和互补的方法来研究神经系统疾病。

代人类iPSC-derived神经细胞使神经发育和神经病理过程的理解比此前更容易的方式。正在取得迅速进展在改善技术的分化细胞则对不同人群的神经亚型。代hiPSC-derived胆碱能神经元将扩大我们的知识胆碱能功能在开发和突触可塑性的机制。能够选择性控制神经元分化的能力已经被成功能性神经元胆碱能神经递质和受体表达理解神经退行性疾病是一个重要的一步。此外,它可以用于细胞替代疗法的发展为阿尔茨海默氏症和高通量筛查代理促进BFCNs生存。生成的体外生物功能性DA神经元毒性和制药药物筛选提供了一个可再生来源。他们可能会提供一个可持续发展的有效工具治疗疾病,帕金森病等影响DA系统。

尽管有上述优势,仍有一些障碍在扩大使用万能干细胞研究神经系统疾病。首先是缺乏一致性文化技术和感应方法,使不清楚可复制的差异化协议。方法基于神经元分化比附着二维三维系统似乎更有效的文化。然而,它不是决定哪个系统更适合体内环境。第二,给定一个更好的表述需要神经亚型以及验证新生成的神经元是否能够融入主机电路的一种生物。神经元来自hiPSCs需要几周的文化成为电生理活性和几个月整合进入宿主神经移植后的环境。因此,必须考虑合适的模型系统来评估人类干细胞衍生的神经元的功能和长期评估他们的安全文化。另一个困难的变异性有关表型的细胞则在细胞系,即使他们来自同一病人。iPSC变化可以来自不同的来源在iPSC生成和维护。因此,应当将重点放在证明强iPSC-derived神经元的表型与特定的遗传背景和不与这种可变性。 The potential source of the line-to-line variation is the reprogramming process that may disturb the genomic and epigenetic stability and potentially introduces de novo epigenetic variations. Furthermore, during a clonal selection process, clones carrying genetic defects can be selected, while the increasing passage number might introduce genetic alterations that facilitate cell propagation. Such genetic and epigenetic variations between different iPSCs lines may affect the differentiation potential and undermine the iPSCs accountability in downstream applications. Thus, several iPSC lines from the same individual are necessary to monitor the phenotypic variability between these lines.

尽管上述局限性,针对病人iPSC-derived神经元体外模型疾病过程提供了一个机会。万能携带宿主个体的遗传背景和表观遗传模式可以是一个很好的工具来研究多因素疾病。在疾病建模中最具挑战性的问题之一是识别神经元疾病表型的患者。学习的困难尤其可见发展几十年来体内的神经退行性疾病。因此,重建细胞疾病条件下环境和细胞之间的相互作用可以促进适当的表现型的发展。

总之,最近的研究证实,则可以加速药物发现和可能应用于细胞移植。特别是,ESC / iPSC-derived胆碱能和多巴胺中间神经元导致改善神经退行性疾病模型,因此补充动物模型,加快翻译对病人群分层的临床试验。我们预测,则派生的神经细胞将适合用于体外疾病的各种应用程序建模、高通量、高含量的药物,和毒理学筛查和潜在cell-transplant-mediated治疗干预措施。

缩写

2 d:	二维
3 d:	三维
3 nt:	3-Nitrotyrosine
6-OHDA:	6-Hydroxydopamine
AA:	抗坏血酸
一个β:	β淀粉样蛋白
哦:	乙酰胆碱
疼痛:	乙酰胆碱酯酶
广告:	阿尔茨海默病
肌萎缩性侧索硬化症:	肌萎缩性脊髓侧索硬化症
应用:	淀粉样前体蛋白
APP-CTF:	淀粉样前体蛋白c端片段
自闭症谱系障碍:	自闭症谱系障碍
ATM机:	Ataxia-telangiectasia突变
脑源性神经营养因子:	脑衍生神经营养因子
BFCN:	基底前脑胆碱能神经元
骨形态发生蛋白:	骨形态发生蛋白
BMP9:	骨形态发生蛋白9
阵营:	环腺苷3′,5′一磷酸
聊天:	胆碱乙酰转移酶
CDX2:	尾型同源框2
中枢神经系统:	中枢神经系统
据:	睫状神经营养因子
大卫·爱登堡:	多巴胺能
榫眼:	N - [N - (3 5-Difluorophenacetyl) 1-alanyl] -S-phenylglycine叔丁基酯
DAT:	多巴胺转运体
DHA:	二十二碳六烯酸
DNM1L:	Dynamin 1
DRP1:	Dynamin-related蛋白1
表皮生长因子:	表皮生长因子
EN1:	十字的1
呃:	内质网
时尚:	家族性阿尔茨海默病
FGF:	纤维母细胞生长因子
FGF8:	纤维母细胞生长因子8
FOXA2:	叉头框蛋白A2
外交政策:	层板
GBA:	Beta-glucocerebrosidase
GBX1:	原肠胚形成大脑同源框1
GDNF:	神经胶质细胞衍生神经营养因子
GPR52:	g蛋白耦合受体52
GSK3B:	糖原合成酶激酶3β
GSK3Bi:	GSK3B抑制剂
gsm:	分泌酶调节器
GSAP:	分泌酶激活蛋白
高清:	亨廷顿氏舞蹈症
hESC:	人类胚胎干细胞
hiPSC:	人类诱导多能干细胞
hPSC:	人类多能干细胞
计画:	杭丁顿蛋白
ISL1:	ISL LIM同源框1
KLF4:	Kruppel-like因子4
KSR介质:	敲除血清替代
Lhx6:	LIM同源框6
Lhx8:	LIM同源框8
LM511-E8:	重组E8人类层粘连蛋白511的碎片
LMX1A:	LIM同源框转录因子1α
LRRK2:	富亮氨酸重复激酶2
LTP:	长期势差
制:	小鼠胚胎干细胞
兆欧:	中位数神经节的隆起
miR196a:	196微
NCAM:	神经细胞粘附分子
新经济学院:	巢蛋白
非功能性测试:	神经原纤维缠结
神经生长因子:	神经生长因子
NGFR:	神经生长因子受体
NKX2-1:	NK2同源框1
NRSF:	神经元限制性消音器的因素
非甾体抗炎药:	非甾体类抗炎药
国家安全委员会:	神经干细胞
NTF3:	Neurothrophin 3
NTF4:	Neurothrophin 4
NTN1:	Netrin 1
OCT4:	Octamer-binding转录因子4
OTX2:	Orthodenticle同源框2
PARK2:	帕金RBR E3泛素蛋白连接酶
PAX6:	双箱6
帕金森病:	帕金森病
PDL:	Poly-D-Lysine
PKC:	蛋白激酶C
PPARδ:	过氧物酶体扩散者激活受体γ
PPARGC1A:	过氧物酶体proliferator-activated受体γ,共激活剂1α
PINK1:	PTEN-induced假定的激酶1
pn:	周围神经系统
POU5F1:	POU域、类5、转录因子1
PSEN1:	Presenilin 1
PSEN2:	Presenilin 2
类风湿性关节炎:	视黄酸
RE1:	抑制因子元素1
其他:	抑制因子元素1沉默转录因子
石:	Rho-associated卷曲螺旋形成蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶
悲伤:	零星的阿尔茨海默病
嘘:	声波刺猬
SMA:	脊髓性肌肉萎缩症
西门子数控(南京)有限公司:	黑质致密部
SNCA:	α-核蛋白
SOX1:	性别确定区域Y-box 1
SOX2:	性别确定区域Y-box 2
TGFB3:	转化生长因子β3
TH:	酪氨酸羟化酶
肿瘤坏死因子α:	肿瘤坏死因子-α
TUBB3:	微管蛋白,β3第三类
UCHL1:	泛素羧基末端酯酶L1
VAChT:	水泡乙酰胆碱转运体
WNT:	Wingless-Type MMTV集成网站的家庭。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

安娜Ochalek和卡罗丽娜Szczesna写手稿,朱丽安娜Kobolak和保罗Petazzi手稿编辑,和Andras Dinnyes编辑和批准了最终版本的手稿。所有作者阅读和批准了最终版本。

确认

作者感谢卡尔教授克劳斯,Balazs Mihalik博士和Cormac Murphy建议改善我们的手稿。这项工作是支持由欧盟FP7项目之下(STEMMAD piapp - ga - 2012 - 324451;EpiHealth、健康- 2012 - f2 - 278418;EpiHealthNet pitn - ga - 2012 - 317146)和Szent什特大学(卓越研究中心11476 - 3/2016 / FEKUT)。

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