附件、增长和人类间充质干细胞的分离化学中定义

文摘

制造人类间充质干细胞临床应用需要一个适当的增长(hMSCs)表面和一个优化,最好是化学介质(CDM)定义为扩张。我们调查了一个新的蛋白质/ peptide-free CDM支持粘附,生长,超然的永生化hMSC线(hMSC-TERT)以及主要细胞来源于骨髓(bm-hMSCs)和脂肪组织(ad-hMSCs)。我们观察到的快速附件和传播hMSC-TERT细胞和ad-hMSCs CDM伴随整合素的表达和肌动蛋白纤维。细胞传播促进了涂层表面胶原IV型和纤连蛋白生长。hMSC-TERT细胞的生长是类似的清洁发展机制和血清中而bm-hMSCs长期在CDM的停滞阶段。FGF-2或表面涂层与胶原IV型bm-hMSCs促进了增长,但层粘连蛋白没有效果。所有三种类型的细胞保留在CDM trilineage分化能力和被几个分离酶(但不是胶原酶在hMSC-TERT细胞)。中、涂层不影响分离效率但分离后细胞存活率的影响。清洁发展机制结合特异性表面涂层和/或FGF-2补充剂因此一样有效的血清中不同类型hMSC制造。

1。介绍

人类间充质干细胞/基质细胞(hMSCs)经常用于细胞疗法,因为他们提供了许多有利的特征(1]。治疗前使用,hMSCs必须扩展到生产每个病人所需的细胞数量和每剂(至少1 - 2×10⁶每公斤hMSCs) [2]。anchorage-dependent hMSCs的增长,增长表面之间的相互作用,细胞周围的介质中,因此重要的生产适当数量的健康细胞。

细胞粘附是必要hMSC扩张是由非特异性和特定的相互作用。圆形细胞悬浮最初附着在表面由于补充静电/离子部队然后增长表面与细胞表面蛋白的主要受体介导cell-matrix粘附[3]。整合素激活的结果形成的形成,启动信号级联激活下游基因,最终调节细胞的形态和行为。细胞趋于平缓和传播由于激活的蛋白激酶C (PKC)和随后的积累粘着斑激酶(FAK)和肌动蛋白丝前缘的细胞。完成细胞扩散和表面附着力强,扩散所需,特点是PKC和肌动蛋白交联的失活细胞内定义应力纤维与FAK位于粘着斑的网站。肌动蛋白形成稳定细胞骨架,保持细胞的附着传播状态(4,5]。

血清(通常是牛,有时人类)通常是包含在hMSC扩张媒体促进细胞粘附,因为它包含了许多attachment-promoting蛋白质(如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和vitronectin)以及激素和脂质,刺激细胞增殖在体外(6]。血清hMSC扩张时导致问题必须进行良好生产规范(GMP)因为hMSCs在诊所治疗被认为是先进的医药产品(ATMPs)欧洲药品局(EMA)和美国食品和药物管理局(FDA)。这些机构建议避免任何原材料来源于哺乳动物,包括血清,以降低污染的风险当使用ATMPs [7]。

监管压力消除血清产生了若干创新[8]。除了血清培养基(SCM, 10 - 20%血清)和降低血清培养基(1 - 5%血清,强化胰岛素,转铁蛋白,和其他营养物质),几类无血清培养系统的开发包括无血清培养系统(a),与其他哺乳动物激素,生长因子,蛋白质,和多胺;(b)无蛋白培养基,含有肽片段的酶或酸水解蛋白质来自动物或植物;(c)重组xeno-free介质,包括重组蛋白/激素化合物和化学定义脂质;定义和(d)化学介质(CDM)这是一个无蛋白基础培养基仅包含低分子量添加剂、合成肽或激素,和一些蛋白质的重组或合成版本。几个内部血清媒体发达的hMSC扩张,而这些通常包含额外的因素如牛/人血清白蛋白,胰岛素,转铁蛋白、激素(如孕激素,氢化可的松和雌二醇),生长因子(如bFGF、TGF -β、EGF、PDGF)或肝素(9- - - - - -18]。商业产品也可用于这个目的,虽然完整的成分列表不披露他们也往往包括上面列出的组件的选择。然而,据我们所知,只有蛋白质/ peptide-free CDM hMSC扩张StemCell1介质从细胞培养技术,完全缺乏任何蛋白质的组件,每个组件是一个定义的浓度低分子量化合物(50至250 Da,除了一个> 1000 Da)可以被化学文摘社登记号码。

没有增长和attachment-promoting蛋白质在CDM可能使蛋白质表面涂料的使用组织培养plasticware鼓励细胞粘附。许多血清蛋白质可以用作涂料,包括本地或变性胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、vitronectin。每个蛋白质被特定的整合素形成:原生胶原蛋白α₁β₁,α₂β₁,α₁₁β₁,;变性胶原蛋白的α₅β₁,,;纤连蛋白的α₂β₁,α₃β₁,α₄β₁,α₄β₇,α₅β₁,α₈β₁,,,,,,;层粘连蛋白,α₁β₁,α₂β₁,α₆β₁,α₇β₁,α₆β₄,;和vitronectin,,,(19]。hMSCs孤立从骨髓表达整合素亚基,,,,,,,,,,(20.),可能也和(21]。整合素表达hMSCs由来源不同,但hMSCs应该通过整合素受体结合上述涂料。

我们调查了附件和传播行为的永生化hMSC细胞系(hMSC-TERT)和两种类型的主要hMSCs来源于骨髓(bm-hMSCs)和脂肪组织在CDM StemCell1 (ad-hMSCs)。我们测试了不同蛋白涂层,以确定哪些能够促进这三种细胞的粘附和生长在清洁发展机制。我们也确定细胞生长在不同涂料不同的分离行为和应对不同分离酶。

2。材料和方法

2.1。细胞系

我们使用主要hMSCs从骨髓(bm-hMSCs通道3 - 10)请提供的m .车默克密理博,贝德福德,妈,美国从脂肪组织(ad-hMSCs通道3 - 10)请提供的f . Ehlicke维尔茨堡大学德国维尔茨堡。永生化细胞系hMSC-TERT [22)(段落,74 - 80年)请提供的m .卡塞姆南丹麦大学,丹麦欧登塞。

2.2。媒体

我们使用鹰的最小基本培养基(EMEM)补充2毫米谷酰胺和10%胎牛血清(标准化的边后卫,货号。S0615)作为我们的标准配置管理。我们使用StemCell1介质(细胞培养技术、Gravesano瑞士)补充了2毫米谷酰胺作为我们的清洁发展机制。媒体被进一步补充8 ng / mL重组人类基本成纤维细胞生长因子(bFGF;货号。在需要时W1370950050)。除非另有说明,所有组件都购自Biochrom(德国柏林)。

2.3。常规细胞扩张和适应清洁发展机制

Cryoconserved hMSC-TERT细胞(10% DMSO溶液,90%的边后卫)和主hMSCs解冻和培育组织烧瓶(Sarstedt Numbrecht,德国)与播种密度在5000年和10000年之间细胞包含EMEM厘米⁻²在37°C, 5%的股份有限公司₂湿润的气氛。使是在80 - 90%融合使用0.25毫克毫升⁻¹trypsin-EDTA。CDM适应后第一段进行了使用SCM 50%和50% CDM的混合物,并随后100%清洁发展机制中使用先进的TC™组织烧瓶(他一一Bio-One、Kremsmunster、奥地利)。所有后续使早些时候使用25%条件培养基从文化。媒介取代50%新鲜中每3 - 4天。细胞通过仅在CDM开始前至少两次实验。

2.4。涂层Six-Well板块

胶原IV(人类,C7521),纤连蛋白(牛、F1141)、层粘连蛋白(鼠,L2020)和vitronectin(人类,SRP3186)获得Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH (Seelze,德国)。每个蛋白应用于six-well板块在一夜之间实现涂层的密度在4°C 5μ摩尔厘米⁻²。一套盘子涂以10% (v / v)的边后卫是一个积极的控制。

2.5。分析细胞的吸附和扩散

这些细胞被暂停在SCM或清洁发展机制和镀7000 (hMSC-TERT), 8000 (bm-MSCs),或3000厘米(ad-MSCs)细胞⁻²在涂布或noncoated six-well盘子。分析了附件5 h通过计算每小时附着和悬浮细胞。传播进行了分析通过计算扩散细胞显微图像和定义如前所述24]。

2.6。免疫荧光染色的细胞骨架和细胞表面整合素α₄

细胞生长24 h在SCM或CDM涂布或noncoated six-well盘子。我们固定的细胞通过删除中,轻轻地洗2毫升PBS、孵化和丙酮(卡尔罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)10分钟−20°C。两个洗PBS后,样本孵化2毫升屏蔽解决方案(10毫克毫升⁻¹BSA在PBS)在室温下30分钟。样品又洗了两次然后孵化1:80稀释的Alexa萤石®555 Phalloidin(生活技术,达姆施塔特,德国,A340555)或1:200稀释DyLight 488整合素抗体MM0417-2L30(研发系统GmbH是一家德国威斯巴登,nbp2 - 11738 g)在PBS 2 h在黑暗中在室温下。最后,细胞核与DAPI复染色(AppliChem,达姆施塔特,德国)和样本嵌入Mowiol(卡尔罗斯)根据制造商的建议。

2.7。分析细胞生长

细胞被播种在six-well板块(涂布或noncoated)细胞的密度7000 - 10000厘米⁻²和生长在2毫升SCM或CDM长达8 d在37°C 5%的股份有限公司₂湿润的气氛。每天在显微镜下细胞数。增长率μ决心在指数增长阶段使用以下方程:

2.8。扩大了细胞的分化

细胞分化使用StemMACS AdipoDiff ChrondroDiff,或OsteoDiff媒体(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)根据制造商的建议。分化后的细胞与4%多聚甲醛固定(卡尔罗斯)在室温下30分钟。去证实了nil红染色的脂肪滴如前所述25]。最后,样本嵌入Mowiol(卡尔罗斯)根据制造商的建议。Chondrogenic分化的免疫荧光染色证实了胶原蛋白II型(描述26]。使用OsteoImage矿化成骨分化确认试验(Lonza、巴塞尔、瑞士)根据制造商的建议。

2.9。分析细胞的分离

这些细胞被悬浮在SCM或清洁发展机制,播种密度的50000个细胞厘米⁻²在涂布或noncoated six-well盘子和37°C 5%孵化有限公司₂调湿大气观察到附件。每个被洗两次,1毫升PBS的媒介。0.5毫升的细胞培养分离酶解决方案(必要时补充0.02% EDTA)如表所示1。分离反应停止通过添加1.5毫升SCM,解决方案是离心机(500×g, 5分钟,房间温度),剩下的细胞颗粒在0.5毫升resuspended SCM。细胞数量和生存能力是由锥虫蓝染色。

3所示。结果

3.1。附件和hMSC-TERT细胞和初级hMSCs蔓延

高效细胞增长表面的附件和传播是必要的扩张anchorage-dependent hMSCs。在CDM, hMSC-TERT细胞完全附着在4 h不管存在/缺失或类型的表面涂层。我们观察到小附件surface-dependent差异率;例如,细胞在胶原IV涂层更慢。然而,几乎没有区别的依恋行为hMSC-TERT细胞生长在SCM和清洁发展机制。相反,细胞的扩散在CDM积极影响蛋白质涂料。在没有涂层的情况下,只有8%的5 h后连接细胞传播,而细胞的胶原IV型和纤连蛋白与出口增速传播种子的边后卫或SCM(图1)。细胞骨架和细胞表面蛋白的免疫荧光染色显示hMSC-TERT细胞生长在CDM表面涂以胶原IV型或纤连蛋白包含组织有效的f -肌动蛋白纤维细胞生长在其他表面整合素表达在更高的级别上(图2)。

在清洁发展机制(图bm-hMSCs附加不佳3(一个)),但即使是在单片机完成附件24 h。只有少数bm-hMSCs在CDM附加5 h后,没有观察到在这个时期传播。附加的bm-hMSCs被拉长,薄的涂料和没有观察到板状伪足。我们的结果表明,没有涂层更为可取的附件或传播这些细胞在清洁发展机制,但没有涂层附着细胞倾向于再次分离,成为圆形(图3 (b))。

相比之下,ad-hMSCs附加在CDM迅速和90%以上的细胞内附2 h,不管存在/缺失或类型的涂层。在4 h, 59%的细胞已经扩散胶原IV型表面而几乎100%的细胞已经扩散纤连蛋白、层粘连蛋白、vitronectin表面相同的时间后。免疫荧光染色显示的所有扩展ad-hMSCs CDM整合素表达,但f -肌动蛋白纤维没有组织和不同的细胞培养中所观察到的SCM(图2)。

3.2。的增长和初级hMSCs hMSC-TERT细胞

全面调查hMSC-TERT增长在CDM最初行为表明,细胞培养的选择塑料(CCP)有一个巨大的影响(图4)。在标准的共产党,hMSC-TERT细胞长期停滞阶段和较慢的增长速度(h⁻¹)相比,细胞生长在SCM (h⁻¹)。此外,细胞生长的最大密度标准CPP低2.6倍相比,CDM SCM。在CPP专门为兼容CDM (CDM-CPP),培养细胞的生长速率在CDM和SCM(类似h⁻¹)。补充CDM FGF-2或涂层CPP与上面列出的蛋白质没有进一步提高增长率。

bm-hMSCs在CDM的发展只是使用CDM-CPP进行了测试。我们发现细胞生长慢得多没有涂料(0.016 h⁻¹在SCM)相比,增长率(0.020 h⁻¹),细胞的培养数量相比低4倍CDM SCM(图5)。初级hMSCs,补充CDM FGF-2显著提高细胞增长率(h⁻¹),但培养的细胞数量在清洁发展机制是通过使用SCM只有一半。这可能反映了停滞阶段的持续时间,在CDM 48小时时间而SCM。涂层的性质也影响增长率bm-hMSCs清洁发展机制;例如,层粘连蛋白没有促进细胞增长比裸板,而胶原IV型提高了bm-hMSC增长率相同的程度与FGF-2补充中。

3.3。分化hMSC-TERT细胞和初级hMSCs清洁发展机制的潜力

Trilineage分化潜力的最小准则hMSCs的治疗用途,所以我们研究细胞在CDM的扩张是否对这个属性的影响。我们发现hMSC-TERTs、bm-hMSCs ad-hMSCs每个保留向脂肪细胞分化的能力,软骨细胞,成骨细胞,由免疫荧光染色(图6)。

3.4。hMSC-TERT细胞的分离和初级hMSCs

超然hMSC扩张也是必要的,这个过程应该有效,没有造成细胞损伤。hMSC-TERT细胞生长在SCM相比,我们发现相同的细胞生长与胰蛋白酶CDM更难以分离,Accutase, PsP,胶原酶是完全无效的即使烧瓶的表面涂有胶原蛋白(图7)。hMSC-TERT细胞生长在SCM,涂层没有影响超然与胰蛋白酶或Accutase因为酶分离达到近100%。hMSC-TERT细胞生长在CDM,胰蛋白酶和Accutase分离从laminin-coated大多数细胞表面。PsP无法分离hMSC-TERT细胞表面涂以胶原IV型单片机或清洁发展机制。这种酶有效地将细胞从所有其他表面在两种媒体,但从纤连蛋白细胞分离的效率在CDM SCM相比低50%。尽管CDM一般对分离效率影响不大,影响分离细胞的可行性。hMSC-TERT细胞生长在CDM没有表面涂层,分离后的生存能力大幅下跌与胰蛋白酶(%),Accutase (%)和胶原酶(%)但仍高与PsP分离后(%)。相比之下,细胞生长没有表面涂层在SCM只有超然与胶原酶(后失去了生存能力%)。bm-hMSCs可以独立有效地从每个涂层的酶,包括胶原酶。我们没有观察到的差异的四个涂料,但超然略低效率在缺乏涂层。所有分离的细胞保持高度可行的分离后(图8)。

4所示。讨论

4.1。细胞之间的相互作用和表面生长

增长表面的性质可以对培养细胞的行为产生深远的影响,我们发现这也是三种不同类型的hMSCs。从SCM转向清洁发展机制影响的增长hMSCs标准组织培养塑料,而是一个特别改装的表面设计兼容CDM改善hMSC-TERT细胞的生长在同样的程度上作为SCM,和涂层表面与细胞外基质(ECM)的蛋白质或添加FGF-2中没有提高任何进一步的增长。修改后的塑料表面是由孵化等离子体,它提供了更多的氧气组增加润湿性,蛋白质相互作用,从而细胞增殖(27]。进一步与ECM蛋白质涂层的影响根据不同细胞类型。纤连蛋白促进hMSC-TERT细胞的粘附和ad-hMSCs,这并不奇怪,因为hMSCs纤连蛋白受体表达比受体的三个其他涂料20.,28]。整合素是一个主要的纤连蛋白受体(19),我们可以发现这种蛋白质表面的这些hMSCs种植在纤连蛋白在SCM和清洁发展机制。有趣的是,整合素也出现在hMSC-TERT细胞生长在CDM胶原IV型虽然整合蛋白吗,,,与整合素结合结合胶原IV和整合素不涉及。纤连蛋白和胶原IV是紧密联系在一起的,胶原IV型教育其他ECM组件和促进成纤维细胞的生存和独立的肿瘤细胞整合素和特异性的方式来规避凋亡[29日,30.]。我们观察到这种刺激效应在CDM bm-hMSCs增长胶原IV型涂料。涂层有相同的生长因子FGF-2产生积极的影响,这是众所周知的,加强hMSCs潜在的有丝分裂,增加他们的增长率和潜在的自我更新31日,32]。

4.2。的行为三种类型的hMSC清洁发展机制

附件和传播动力学的三种类型的hMSC CDM强烈依赖于细胞类型。而hMSC-TERT细胞和ad-hMSCs附加和迅速传播,bm-hMSC的粘附是缓慢而低效的。后者也将缓慢SCM,这表明效果是细胞或donor-dependent而不是表明失踪attachment-promoting CDM的蛋白质。人类来自不同来源的msc的整合素不同概要文件(33];例如,hMSC-TERT细胞表达蛋白,,,,α₁₁,,,(28),而主要hMSCs表达整合蛋白,,,,,,α₁₁,(34),这可能会影响他们的粘附行为。重要的是,细胞活力还取决于供体的年龄和健康。bm-hMSCs是源自一个老比ad-hMSCs捐赠,这就可以解释他们的吸附和扩散ad-hMSCs相比缓慢和无限增殖hMSC-TERT细胞。排除donor-dependent效果和确认在CDM是真正cell-dependent观察到的行为,有必要用bm-hMSCs重复实验和ad-hMSCs至少五个捐助者。

强粘附细胞生长所需,所以bm-hMSCs的低效的粘附在清洁发展机制可以解释长期滞后阶段相比,相同的细胞生长在SCM。增长率被补充改进媒介FGF-2或涂层表面胶原IV型,但滞后阶段不能缩短。证实这一假说,应该分析细胞的粘附强度在未来的实验中,例如,通过原子力显微镜(35]。

的分离行为三种类型的hMSC也是不同的,依赖于介质表面涂层。清洁发展机制的细胞生长,表面涂层不提高分离的效率,但它确实增加细胞分离表明保护作用后细胞生存能力。有趣的是,hMSC-TERT细胞与胶原酶不能分离,即使collagen-coated表面细胞生长,尽管事实上,胶原酶通常用于隔离hMSCs从组织36]。在先前的研究中,我们表明,胶原酶不适合hMSC-TERT细胞的分离从玻璃表面,因为它主要裂解细胞表面和信息联系,不联系(37,38]。hMSC-TERT细胞相比,主hMSCs可以很容易地分离与胶原酶和酶。

4.3。表面涂层和介质对干细胞的影响力量

所有三种hMSC保留他们的干细胞表型和multilineage分化能力在CDM扩大时,表明CDM适合hMSC强劲扩张和不含可溶性因子,促进多余的分化(39]。

我们没有确定涂层影响hMSCs的效力,但这必须考虑因为某些ECM组件可以诱导分化。例如,纤连蛋白促进细胞蔓延和扩散,抑制脂肪形成的分化,但它在成骨分化中起着举足轻重的作用。此外,vitronectin和胶原蛋白类型我可以促进hMSCs成骨分化,而层粘连蛋白可以刺激hMSCs扩散(虽然我们无法在我们的实验证实了这一点),但抑制软骨形成(40]。这表明多个ECM组件可以提供一个合适的附件和增长hMSCs表面,但这些必须认真选择,以避免不必要的分化细胞扩张。

5。结论

制造hMSCs临床应用需要一个适当的媒介选择表面增长和扩张。我们已经表明,可以扩大不同初级hMSCs和蛋白质/ peptide-free CDM的无限增殖hMSC线,这意味着需要补充比预期的少,细胞可以在基础培养基中存活。培养的细胞为几天或一个或两个段落是不够的声明一个健壮的无血清培养基,因为干细胞增殖在基础培养基41]。因此,有必要扩大hMSCs更长时间来决定是否清洁发展机制适用于制造业。然而,三种细胞类型的行为在清洁发展机制是不同的。例如,纤连蛋白涂层ad-hMSC仅仅是有利的,但不影响bm-hMSCs hMSC-TERT依恋。此外,FGF-2和胶原IV提升bm-hMSCs但不是hMSC-TERT细胞的生长。一般尚不可能推荐一个有利的涂层或补充每个MSC类型的扩张在CDM因为donor-dependent效果不能被排除在外。因此,更广泛的研究hMSCs从其他来源(例如,脐带)和更多的捐助者细胞类型是必要的,以确定是否可以从这些数据一般原则。高效hMSC制造业需要详细了解细胞之间的相互作用,增长表面,培养介质。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是财务支持的黑森州高等教育、研究和艺术,在黑森州倡议支持科学和经济卓越(LOEWE-program)。作者承认博士理查德M Twyman修改论文。

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