三维立体胃肠瀑样文化结合神经或成纤维细胞:一个方法来描述胃肠道干细胞利基

文摘

胃肠道上皮细胞的特点是高流动率的细胞和肠道干细胞主要存在隐窝的底部和他们的后代有助于维持正常的肠道内稳态。越来越多的证据证明了关键作用的一个利基周围肠道隐窝干细胞,由细胞和可溶性组件和创建一个环境不断影响干细胞的命运。这里我们描述不同的3 d文化系统文化胃肠道上皮,应使我们能够研究干细胞利基在体外在未来:瀑样文化和多层系统,如organotypic肠道组织的细胞培养和文化碎片体外。这些方法模拟在活的有机体内情况在体外通过创建3 d文化反映肠道隐窝的生理情况的条件。修改培养基的组成以及coculturing上皮瀑样与前所述细胞组件如myofibroblasts、胶原蛋白、和神经元的影响方法应用于调查利基交互在体外。我们进一步提出一个新方法来隔离标签使用Dclk1-CreGFP小鼠肠神经系统的神经。

1。介绍

成年组织干细胞是组织内稳态和损伤后再生所必需的,但在某些情况下他们可能发生恶变,导致癌症。这一假设已被广泛研究在活的有机体内但在体外方法分析潜在因素和上皮和基质之间的相互作用是失踪。大多数成人干细胞的共同和独特的特征是他们的定位1),因为它们驻留在一个特定的和受保护的解剖位置称为干细胞利基。这样一个利基是由细胞组成的组件周围的干细胞,细胞外基质(ECM)和溶性因素。人们认为这种干细胞利基市场的主要功能是干细胞保留控制的对称和不对称分裂。安克雷奇的干细胞是由他们的接触ECM和依赖(粘合连接处并且2,3]。利基的细胞部分包含骨髓基质细胞,如成骨细胞的细胞、支持细胞在种系干细胞利基,或pericryptal成纤维细胞在小肠1,4]。由于胃肠道上皮容易发炎和致癌作用,是很重要的破译肠道干细胞利基市场的监管机制不仅在生理,还在炎症和致癌作用。

肠道是一个器官上皮细胞高的营业额包括自我更新每两到七天在正常组织内稳态的背景下(5),一个完美的模型来研究生态位的影响干细胞的增殖和分化。这种可塑性源于多功能肠道干细胞的存在(ISC),驻留在隐窝或胃肠道腺[5]。Lgr5就艾滋病患者(Prom1 -/Sox9艾滋病)快速循环干细胞驻留在地下基地,因此也称为地下室基础柱状细胞(CBC),和四个细胞谱系的肠道隐窝被证明是来自这些干细胞(6]。内皮细胞(血管和淋巴内皮)包围,周,免疫系统的细胞,成纤维细胞,神经元,isc不断调制通过释放细胞因子,趋化因子,生长因子,神经递质,从而可能修改对致癌的命运(7,8]。干细胞的维护和扩散是高度依赖于信号通路的调节,如Wnt切口,BMP,或者刺猬8]。最近,Paneth细胞被证明是肠道干细胞利基(的一个重要组成部分9];然而损耗的细胞类型鼠标没有显著改变地穴表型(10]。建议利基因素由基质细胞提供。

绝大多数的在体外占主导地位的研究在生物医学研究中的应用二维(2 d)细胞培养模型。然而,后者反映细胞异质性和细胞组织的行为在活的有机体内。此外,2 d细胞培养不允许学习不同的细胞或ECM-cell交互之间的通信。在生物医学中的应用研究越来越有兴趣三维(3 d)细胞培养系统。最近,3 d鼠标肠隐窝的文化已经被开发出来,这被称为minigut文化或瀑样(11]。地下文化立在肠道上皮细胞的多样性。此外,肠道瀑样文化地下室和绒毛域可以被识别,因此类似增殖和分化在小肠隔间在活的有机体内。可以增加基质细胞瀑样的文化,它是一种很有前途的生理模型来研究利基因素相关体外。这里我们提出研究利基因素利用神经细胞和成纤维细胞作为利基肠道和贲门地穴瀑样在体外。

2。方法

2.1。动物

动物实验是经当地动物福利委员会批准。如果地下室隔离组织的C57BL / 6小鼠(杰克逊实验室)使用。隔离的肠道myofibroblasts野生型C57BL / 6 j小鼠4岁weeks-2年使用。Dclk1-CreGFP老鼠穿过Rosa26-mTomato / mGFP (R26-TGFP)记者菌株如前所述12]。老鼠用于神经coculture年龄在7到10天,处处转基因表达的蛋白质Dclk1Cre在Dclk1阳性细胞和他们的血统,加上记者蛋白质复合体。获得巴雷特瀑样贲门细胞、组织从pL2-IL-1b老鼠的年龄一年被孤立。EBV-L2-IL-1 pL2-IL-1beta老鼠携带β转基因,overexpressing人类IL-1beta在食管鳞状前胃粘膜。老鼠显示食管炎进展上皮化生和发育异常的老年人(~ 12个月)13]。此外,贲门和肠道隐窝文化Lgr5-CreTMG小鼠诱导Cre和Lgr5-positive细胞中稳定表达GFP分别为60岁和32周,被[6]。

2.2。肠道瀑样文化(肠隐窝)

小鼠的小肠(SI)取出,洗在PBS(生命技术),删除所有的脂肪和邻近组织。在PBS纵向剖开,洗移除所有剩下的食物残渣。如果组织切成3 - 5厘米长部分,这是存储在皮氏培养皿中冷PBS + 10%胎牛血清的边后卫(生命技术),以下称为PBS /的边后卫。小肠部分被夷为平地在培养皿和绒毛使用覆盖玻璃被刮掉。这个步骤是重复的内外SI部分。这些如果部分是用手术刀切成2 - 4毫米,转移到20毫升PBS / 50毫升猎鹰管的边后卫。组织样本被允许沉积物和上层清液被移除。额外的10毫升的PBS /的边后卫是添加洗组织和上层的删除。这些步骤被重复,直到浮在表面的清晰(约。5次)。 The remaining tissue was digested in PBS + EDTA (2 mM) for 15 min at 4°C on a shaker. After digestion the supernatant was removed. The tissue was resuspended in 10 mL PBS/FBS and filtered through a 70 μm细胞过滤器(BD生物科学)到一个新的50毫升猎鹰管。此步骤重复了几次(~ 4次)。颗粒的蓄水池他们离心机为8分钟,每分钟800转4°C。上层清液尽可能彻底切除,150 - 200μL基底膜基质添加到颗粒避免气泡。50μL人工基底膜镀在每一个的prewarmed 24-well盘子。在每个0.5毫升的地穴培养基(CM)补充说,这是由先进的DMEM / F12(技术)、补充与血清B27(1: 50,生活技术),N2(1: 100年,生命技术),防治(50毫米,σ),重组鼠上皮生长因子(EGF 50 ng / mL, Peprotech),‘诺金’(100 ng / mL, Peprotech) R-Spondin (1μg / mL, Peprotech), Glutamax-I补充(1:100年,生命技术)、青霉素、链霉素(500μg / mL,生命技术),玫瑰(10μ米,生活技术)(见表1)。文化是在37°C和湿润孵化器孵化有限公司5%₂。

一天后,孤立的隐窝的增长可以被监视。2 - 3天后如果隐窝开始萌芽,类似于肠道中的crypt-villus结构。媒介是改变了每隔一天。大约每星期可以分裂隐窝1:2 - 1:4,根据隐窝的数量和大小。通过瀑样,媒介取代0.5毫升冰冷的介质(厘米没有生长因子,也称为完全培养基),用移液器吸取上下几次破坏基底膜基质,并把新的15毫升猎鹰。中断隐窝应该不再是可见的眼睛。他们在800 rpm颗粒状5分钟在4°C和基底膜基质的适量添加到颗粒。基底膜基质滴再次镀成24-well板块和地下室培养基是补充道。

2.3。隔离的肠道Myofibroblasts

肠道myofibroblasts使用外植体分离技术。小鼠小肠是收获,切成2 - 3毫米的碎片。组织碎片被洗冷洗的解决方案,由汉克斯平衡盐溶液(hbs)(生命技术),1%青霉素和链霉素(技术)和50μg / mL庆大霉素(技术)和孵化1毫米二硫苏糖醇(DTT)在室温下15分钟。之后,组织碎片被孵化在1毫米EDTA为30分钟37°C,偶尔搅拌。与哈佛商学院洗涤后,孵化与1毫米EDTA是重复的。然后组织碎片被清洗和孵化1毫克/毫升胶原酶I型(σ)30分钟在37°C。洗后的解决方案包含哈佛商学院,10%的边后卫(技术),和1%的青霉素和链霉素,组织碎片被镀和包含RPMI1640培养在一个中等(技术),10%的边后卫,1%,青霉素、链霉素和100μg / mL Normocin (Invivogen)。myofibroblasts迁移的组织碎片和坚持培养板。

2.4。Crypt-Fibroblast Coculture Organotypic细胞培养系统(OTC)

Myofibroblasts和隐窝是孤立的从6-week-8-month-old老鼠(如上所述为期两天的文化和7天的文化),扩展,然后用于实验。非细胞和细胞基质准备像以前公布的14),小的修改。900年μ非细胞的L矩阵是用移液器吸取transwell(24毫米transwell 3.0μ米孔隙聚碳酸酯膜插入、康宁)放入6-well transwell载体(器官发生)。凝固后,450年μL细胞矩阵包含肠道myofibroblasts打翻了。在450年矩阵的稳定μL细胞矩阵包含肠隐窝是倒在上面。每口井中含7.5毫升RPMI1640(技术),10%的边后卫(技术)、青霉素、链霉素(生命技术)1%,330 ng / mL R-Spondin (Peprotech)补充道。一天0细胞被播种。R-Spondin添加到介质只在天0。在2天至7天文化在福尔马林固定,脱水,嵌入在石蜡。在降低石蜡幻灯片),ki - 67 (Abcam),和αsma (Abcam)染色进行。隐窝是量化的幻灯片总数染色)。解体隐窝算作是不能存活的。生存的比例被定义为可行的隐窝。

2.5。组织培养体外

从5-week-old小鼠小肠,切成小块,嵌入在一个矩阵,和培养。正如前面执行的方法发表(15),除了非细胞底层和cell-containing层的组成,是根据协议准备organotypic细胞培养(14]。文化表现在transwell(24毫米transwell 3.0μ米孔隙聚碳酸酯膜插入、康宁)放入6-well transwell载体(器官发生)。火腿的F12培养基由(技术),20%的边后卫(生命技术),50μg / mL庆大霉素(技术)和交换了一个星期后。1毫升中添加了/。两周后,文化在福尔马林固定,嵌入在石蜡和PAS染色。

2.6。表型的细胞外基质的影响肠道瀑样

小肠隐窝从三个野生型7-week-17-month-old分离、培养的小鼠在基底膜基质如上所述。的实验中,隐窝被播种在人工基底膜或细胞矩阵,这是准备像以前公布的14)除了的边后卫,补充道。隐窝是与细胞混合矩阵和50μ每口井的L矩阵被播种的24-well板。隐窝被播种在第0天以前公布的培养基是一样的(16]。分析和固定在福尔马林在第二天进行。部分是彩色ki - 67 (Abcam)。

2.7。贲门瀑样文化

收获的胃被打开了大曲率和冻得通红PBS + 10%的边后卫去除食物残渣。孤立的组织squamocolumnar结(SCJ),打开肚子是平放在一个坚硬的表面;感兴趣的组织解剖,在PBS洗,切成小块,转移到20毫升PBS缓冲替代EDTA和乙二醇四乙酸(EGTA,最终浓度2毫米)。分离单个组织层,45分钟的收获组织孵化瓶在4°C。孵化后上层清液被10毫升PBS和10%的边后卫是补充道。类似于肠道隐窝的隔离,进一步破坏组织使用移液的剪切力来实现的。经过70年的碎片μm细胞过滤器(BD生物科学)。的细胞悬液在600 rpm出来5分钟。颗粒在基底膜基质resuspended和播种到预热24-well板与50滴μL基底膜基质在每个。长期的文化,瀑样培养在Wnt-conditioned肠隐窝培养基(0.5毫升),添加新鲜每隔一天。Wnt-CM(后来称为贲门介质,凸轮)是来自L-Wnt3a细胞系(写明ATCC)培养介质由先进的DMEM / F12(技术)、玫瑰(10μ米,生活技术)、青霉素、链霉素(500μg / mL,生命技术),Glutamax-I补充(1:100年,生命技术)。贲门瀑样通常需要Wnt3a增长和长期生存作为额外生长因子(17]。瀑样的有效扩张,它们必须通过7和10天后在文化与肠道瀑样相同的过程。文化在第十天在福尔马林固定,脱水,石蜡和嵌入。降低石蜡幻灯片后,苏木精和伊红()),周期性acid-Schiff (PAS), ki - 67 (Abcam),和αsma (Abcam)染色进行。

2.8。隔离的神经组织和Coculture

神经组织来源于肌间神经丛通过移除的seromuscular层准备小肠(改编自18,19])。在分离过程中,孤立的组织一直在冰上的最低基本培养基(MEM、生活技术)。获得组织消化ca。45 - 80分钟在哈佛商学院的37°C包含胶原酶II型(1μ克/μL,沃辛顿)。使用显微镜,消化过程仔细监控的进展。第一次潜伏期后,不够消化plexi分离和消化15分钟。获得的小片段然后仔细中断使用喷射注射器(Sterican 23 G×1′′或20 G×1′′)。停止消化过程hbs补充添加了10%的边后卫。细胞悬液离心(600 rpm, 5分钟),与哈佛商学院/另一个洗涤步骤后的边后卫,resuspended先进的DMEM / F12(技术)。神经元的生长和分化,细胞被镀在基底膜基质与贲门瀑样和培养neurobasal完全培养基(现),这是由neurobasal介质(技术)、神经生长因子(NGF对于1:1000年,生命技术),血清B27(1: 50,生活技术),N2(1: 100年,生命技术),防治(50毫米,σ),重组鼠上皮生长因子(EGF 50 ng / mL, Peprotech),‘诺金’(100 ng / mL, Peprotech) R-Spondin (1μg / mL, Peprotech), Glutamax-I补充(1:100年,生命技术)、青霉素、链霉素(500μg / mL,生命技术),玫瑰(10μ米,生活技术)。每隔一天中被改变。Cocultures在湿润孵化器孵化在37°C和5%的公司₂。

2.9。钙成像

Ca^{2 +}成像允许可视化改变细胞内可见利用荧光染料,荧光的强度取决于变化。尽管Ca的直接贡献^{2 +}神经元膜电位是有限的,它已经表明,膜电位变化事件密切相关(20.,21]。因此Ca^{2 +}指示器Fluo-4点(英杰公司)是用于检测cocultures神经元的激活。10的细胞被孵化μM Fluo-4 20分钟,20分钟洗掉。在Ca^{2 +}灌注成像实验细胞不断与柠檬酸溶液(22]在37°C,不断与carbogen熏(95%氧气和5%股份有限公司₂)。确保神经元染色是稳定的几个小时我们添加了1.25毫米丙磺舒(σ)柠檬酸溶液用于实验。丙磺舒是有机阴离子转运蛋白的抑制剂消除染料和指标从细胞质中23]。荧光的变化测定使用数码相机(AxioCam Hsm,蔡司)和蔡司Axio视觉软件结合一个倒置显微镜(Axio观察者A1,蔡司)。录音是2赫兹的帧速率,这是足以揭示神经元激活。进行可行性测试我们应用100μM尼古丁(σ)通过压力应用程序(PDES-2L npi电子GmbH,塔姆,德国)通过一个玻璃吸管(齿顶圆直径ca。5μ米)。尼古丁作为nicotinergic乙酰胆碱受体的激动剂,因此适用于作为培养肠神经元的生存能力测试(24]。量化荧光的变化在烟碱乙酰胆碱受体的激活,我们分配休息光强度(扶轮领导学院(RLI))感兴趣的区域。

2.10。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒)。剩余基因组DNA被DNase消化在列(试剂盒)。互补脱氧核糖核酸是由逆转录工具包(Promega)生成。应用引物是αsma(弗兰克-威廉姆斯5′CGCTGTCAGGAACCCTGAGA 3′, 5′房车ATGAGGTAGTCGGTGAGATC 3′),β肌动蛋白(弗兰克-威廉姆斯5′CCCTGAACCCTAAGGCCAACC 3′, 5′房车ACCCCGTCTCCGGAGTCCATC 3′),钙粘蛋白(fw 5′ACCACTGCCCTCGTAATCGAA 3′, 5′房车CGTCCTGCCAATCCTGATGAA 3′), Lgr5就(fw 5′GACGCTGGGTTATTTCAAGTTCAA 3′, 5′房车CAGCCAGCTACCAAATAGGTGCTC 3′), villin 1 (fw 5′GACGTTTTCACTGCCAATACCA 3′, 5′房车CCCAAGGCCCTAGTGAAGTCTT 3′),和波形蛋白(fw 5′AACACCCGCACCAAC 3′, 5′房车TCCGGTACTCGTTTGACT 3′)。

2.11。瀑样/肠状的评估和统计分析

增殖和生长的瀑样可以评估在体外在几个方面;我们应用的决心的直径和周长瀑样每段时间轴和比较方法。的贲门瀑样测定在第七天,第十天使用软件(蔡司)和ImageJ Axio愿景。评估在organotypic肠隐窝细胞培养系统的发展是基于分析)染色:隐窝直径2和7天后文化测量。使用GraphPad棱镜进行统计分析。比较两组的执行使用一个未配对的双尾以及。的标准偏差是统计显著。

3所示。结果

3.1。D细胞培养系统研究胃肠道干细胞利基

为了分析干细胞利基在体外我们分析了三种不同的在体外文化系统理想的模拟在活的有机体内情况下,仍然能够理解不同的细胞和非细胞的影响因素。

组织文化体外系统是基于嵌入整个组织碎片在一个矩阵。在这里我们调制以前公布的组织文化体外系统(15),使用一个额外的非细胞层和一层cell-containing准备出版场外系统根据协议(14)(图1(a))。transwells如上所述的执行文化。首先一个非细胞层倒,模拟基底膜。然后细胞层含有组织碎片倒。中添加了外面的菜,它创建了一个气液界面和导致文化的更好的氧化。值得注意的是,增加R-Spondin瀑样文化(这是关键)是没有必要的;然而我们观察到提高效率的增长后上皮的R-Spondin(未显示),同样是之前报道(15]。虽然这种类型的文化保留原生基质利基(箭头所示,图1(一)),可以通过免疫组织化学方法分析福尔马林固定和石蜡包埋后,它不代表一个直接的工具来分析epithelial-stromal交互在体外不使用转基因小鼠模型,当然不是对人类的材料。

与组织文化体外场外和瀑样文化使结合,因此分析不同的细胞类型。在场外系统上皮和基质细胞是嵌入在不同的基质层。由于多层和多细胞场外交易系统(14]似乎提供营养的梯度(喂养从底部),他们似乎模仿一个器官的结构比瀑样文化中,我们测试了场外作为小说模式的适用性研究肠道干细胞利基与B6小鼠肠道隐窝孤立WT老鼠。我们培养肠道隐窝在一个多层场外交易系统(图1(b))类似的组织文化体外;transwell执行文化。首先,非细胞层倒;然后用肠道myofibroblasts添加细胞层。在上面,另一个细胞层含有隐窝。中只添加了外菜(从底部喂养)从而使一个气液界面与隐窝偶尔被定向到开放的表面。

相比之下,在肠状的/瀑样文化细胞嵌入在基底膜基质和培养“人工基底膜下降”(图1(c))。培养基含有生长因子如R-Spondin, EGF,和‘诺金’,这是必要的维持经济增长和结构的隐窝。定义,从小肠隐窝就应该叫肠状的他们只形成一个崭露头角的“minigut”,这些细胞与其他细胞类型的组合允许瀑样。等其他细胞类型的组合与肠状的成纤维细胞和神经系统模拟特定的在活的有机体内情况,可以称为瀑样(25]。虽然瀑样文化代表一个生理相关的细胞培养系统,它已经表明,小肠隐窝瀑样文化系统中包含一个地下室和绒毛域(11),它有一定的局限性。瀑样文化系统,例如,而不是概括的梯度营养,这是沿着crypt-villus轴在活的有机体内。

3.2。对小肠瀑样和小肠Myofibroblasts

为了描述小肠瀑样,文化在福尔马林固定,石蜡嵌入式,染色。)染色显示,一个肠瀑样由极化的单层柱状上皮细胞(图2(一个)(左)。此外小肠瀑样包含腔和特点是味蕾的存在。PAS染色显示产生粘液细胞和粘液的分泌腔(图2(一个)、中)。除了有区别的区域特征,例如,通过粘液产生细胞的存在,在小肠瀑样增殖区可以区分为可以看到从ki - 67染色(图2(一个),对吧)。细胞增殖活动似乎并没有随机分布,而是积累了嫩芽的地区(图2(一个),对吧)。此外,小肠瀑样Lgr5就表示,肠道干细胞的标志(图2 (b)),我们将演示Lgr5-positive细胞分离从一个CreTM Lgr5就鼠标,所有也有表达细胞Lgr5就GFP表达在肠道瀑样(图2 (b))。Myofibroblasts隔绝小肠和讲究的在体外被拉长,spindle-like(图2 (c))。确认的血统身份小肠瀑样和小肠myofibroblasts, rt - pcr的上皮细胞标记上皮和villin以及间充质细胞标记等αsma和波形蛋白。数据显示,小肠瀑样阳性上皮和villin为阴性αsma和波形蛋白,从而确认其上皮血统身份(图2 (d))。小肠myofibroblasts表示αsma和波形蛋白和上皮细胞标记为负,从而确认他们的基质细胞身份(图2 (d))。

3.3。成纤维细胞改善瀑样文化生存

研究成纤维细胞的作用作为isc利基因素,小肠隐窝在一起培养肠道myofibroblasts场外交易系统(图1(b))和地穴单作相比。单一,使用相同的矩阵,但唯一的变化,myofibroblasts没有添加到细胞层。经过7天的培养我们观察到宏观的可见性增加coculture与单作相比(图3(a))。地下室场外单作和地下室场外coculture含有粘液细胞和增殖细胞生产所展示的不是和ki - 67染色(图3(b))。增殖细胞并非同质的分布,但增殖隔间可以尤其是coculture。αsma染色证实存在潜在的梭形myofibroblasts地穴场外coculture(图3(b),相邻放大)。检查myofibroblasts是否影响地下室增长,隐窝的直径在第二天和第七天浸泡在福尔马林溶液的测定是在文化,嵌入在石蜡,染色)。虽然我们没有发现显著变化在地下室大小与单作coculture在第二天,我们观察到,在第七天隐窝直径在单作~ 100μ米,而在coculture ~ 400μm(图3(c)),这表明myofibroblasts改善隐窝的增长。进一步调查的影响myofibroblasts隐窝,瀑样进行生存分析,依赖的量化可行的基于圆)染色的隐窝。一个可行的墓穴被定义为与完整的上皮细胞单层地下室,而不能存活的墓穴被定义为一个细胞碎屑积累(图3(d),较低的)。地下室场外单作30%的隐窝是可行的,而在地下室场外coculture 90%的隐窝是可行的(图3(d)上),这表明myofibroblasts改善瀑样文化生存,从而支持假设myofibroblasts isc的提供一些利基因素。

3.4。胶原蛋白调节肠道隐窝的表型

有趣的是,隐窝的场外交易系统几乎没有味蕾,而3 d肠道组织文化的特征,如图所示,隐窝在瀑样培养系统(图4(一))。从细胞外基质被证明改变正常的乳腺上皮细胞的表型(26),鉴于矩阵组成的场外交易不同于一个用于瀑样肠隐窝的文化,我们假设细胞外基质可能有助于塑造正常肠上皮细胞的表型。为了验证这个假设,我们利用瀑样的文化系统和嵌入式隐窝在场外细胞矩阵。排除的潜在影响气液界面和血清的影响,文化表现在24-well板(相同瀑样文化)(11,27),没有添加血清细胞矩阵。在控制条件下(隐窝播种在基底膜基质)大约70%隐窝包含味蕾,而在场外细胞矩阵只有40%隐窝是萌芽(图4 (c)),这表明胶原蛋白减少芽的形成。虽然在场外隐窝细胞矩阵显示数量减少的味蕾,它们包含增殖细胞,揭示了ki - 67染色(图4 (b))。

3.5。隔离不同的肠神经系统的神经元在体外文化

如上所述,神经系统被认为是一个重要的功能在肠上皮干细胞调控和肿瘤的发展(12,28,29日]。胃手术或药理去神经后,我们的合作者,我们最近表明,致癌作用去除神经支配胃的一部分是根据神经支配17]。同时,这是相关的差别,对这些Wnt3a干细胞利基的去除神经支配胃的一部分。

我们最近产生了BAC转基因老鼠,表示本构的控制下Cre-recombinase Dclk1基因位点(12]。我们随后穿过Dclk1-Cre老鼠番茄/ GFP记者鼠标线(B6.129S4-Gt (ROSA) 26 sortm4罗(ACTB-tdTomato-EGFP) / J),中膜有针对性的西红柿(RFP)被膜有针对性的绿色荧光蛋白(GFP) Cre-mediated重组。有趣的是,在这只老鼠与本构活跃Cre表达式从胚胎发生,我们观察到血统追踪nerve-like结构在整个肠道(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。Dclk1谱系中,我们经常发现肠GFAP +神经胶质细胞和PGP9.5 +神经和神经节(数字5 (e)- - - - - -5 (f)),这表明Dclk1血统的标签部分肠神经系统(ENS),已被证明能够调节反应损伤(30.]。

随后,我们建立了一个neuron-organoid coculture模型作为一种新颖的方法来检查的作用在肠神经干细胞利基(12巴雷特食管等)在健康和疾病,我们最近还开发了一种新的小鼠模型(13),它允许我们隔离鼠标巴雷特上皮瀑样。使用我们的健壮的瀑样文化模型,我们培养和cocultured瀑样巴雷特上皮的老鼠在不同媒体如上所述。

相似的特征培养小肠隐窝,他走时染色显示贲门瀑样由极化的单层柱状上皮细胞(图6(一))。此外瀑样包含腔,主要由产生粘液细胞和粘液的分泌腔(图6(一)PAS染色)。除了有区别的区域特征,例如,通过粘液产生细胞的存在,在贲门瀑样增殖区也可以称之为可以看到从ki - 67染色(图6(一))。细胞增殖活动似乎并没有随机分布,而是积累扩大地区的瀑样(图6(一))。验证的纯度孤立贲门瀑样,αsma显示主要是消极除了只有少数积极相邻纤维母细胞,增生的上皮细胞(图6(一))。证明干细胞的存在在我们的贲门瀑样,我们将演示的存在Lgr5-CreTM-GFP标记上皮细胞在培养条件下(见图6 (b))。

隔离肠神经系统的神经元,7-10-day-old幼崽被使用Dclk1.Cre.GFP-Tom^{fl / fl}绿色荧光蛋白老鼠,如上所述(图6 (c))。这个图展示了从肠道神经结构的纯隔离,然后可以培养与贲门瀑样从巴雷特模型。作为额外的证明神经显示积极的传承,一个beta-III神经元微管蛋白染色进行培养在体外,这几乎完全标记神经元(图6 (d))。使用Dclk1血统记者因此我们能够专门隔离存在和神经突生长在3 d coculture条件(图6 (e))。神经元表现出杰出的神经突,生理活性产物到第十天的文化展示利用Ca-imaging(数字6 (f)和6 (g))。扶轮领导学院(RLI)的分析显示,突然增加神经元与尼古丁的刺激,随后显示随时间减少扶轮领导学院(RLI)感兴趣的区域(ROI)没有尼古丁(图6 (g))。

3.6。神经元增强小鼠生长贲门瀑样

比较不同条件下瀑样的文化和文化媒体和没有神经元和变化,我们观察到显著的文化差异和没有神经元如前所述12]。我们比较瀑样文化巴雷特从pL2-IL-1b老鼠从巴雷特食管上皮细胞分离13与CM)培养,Wnt-conditioned凸轮,coculture现化神经元,正常瀑样文化在CM在七天,对照组10天(媒体组成,见下表1)。的比较贲门瀑样Wnt-conditioned介质和cocultured神经元的特殊利益,神经的作用和Wnt信号最近调查集中在胃肠肿瘤发生[17]。

有趣的是,意味着±SEM(平均数标准误差)的组织显示高度显著差异(见表已经经过七天的文化2),总共三个实验每组和时间点进行。瀑样的规模种植在凸轮(Wnt-conditioned介质),而到CM显示明显增大瀑样7和10天后应用这两种方法测量瀑样大小()。相同的结果的比较显示瀑样在CM瀑样相比,在非神经元coculture(现+ N) ()。瀑样在现cocultured与神经元与凸轮的瀑样培养相比没有任何明显的差异大小两天7和10(数字6 (h)和6(我)、培养的例子和cocultured瀑样图所示6 (j))。有趣的是,随着时间的推移瀑样数达到了1.5倍数量的增加每口井的瀑样已经在第四天的文化在两个凸轮条件和cocultures神经相比对照组培养在CM(数据未显示),尽管瀑样数平衡相比,在第十天的文化条件。此外,从直径和周长的分析判断,后者从直径(表计算是可行的2)。

4所示。结论

这里我们描述不同的3 d文化的利用和改造方法,可以用来分析不同干细胞利基组件的角色和功能在体外。每个三维细胞培养的基本元素是一个矩阵,为细胞和组织起支架作用,类似于ECM,存在于器官在活的有机体内。矩阵的例子中使用3 d细胞生物学:基底膜基质,胶原蛋白,水凝胶31日- - - - - -35]。三维细胞培养显示改变基因表达分析相比,2 d (36]。这里描述的修改和建立三种不同的三维细胞培养方法研究成人胃肠上皮细胞以评估其潜在研究利基因素:(1)组织文化体外,(2)organotypic细胞培养(OTC),和(3)瀑样文化(见图1)。我们进一步执行cocultures与成年小鼠成纤维细胞、胶原蛋白、或成年小鼠神经元,我们的数据表明,细胞的组件在体外利基,代表myofibroblasts和神经元,支持经济增长的上皮含有干细胞的瀑样;然而相互作用的确切机制可能接受进一步调查。

组织文化体外特点是最高的生物复杂性从所有这些方法。它保留干细胞及其组织培养中的本机利基和任何操作体外将会影响整个干细胞利基。然而,这种文化不允许一个特定的分析方法不同的组件的干细胞利基市场,因此我们在这里提供一个新颖的方面将这些不同的组件(如成人pericryptal成纤维细胞、胶原蛋白、和成人神经从实体到不同的单独的coculture化验。场外交易和瀑样文化满足这些标准。场外瀑样文化相比的优势,然而,一个气液界面的特点是最近描述为一个细胞分化因子(37),免疫组织化学处理的目的,甚至考虑到场外需要大量的细胞。在成年小鼠肠上皮细胞周围是一层牙龈myofibroblasts [38)和可能的异质性myofibroblasts与关键的梯度利基因素(例如,Wnt配体,bmp)决定的增殖和分化区crypt-villus单位(39]。根据他们的解剖位置、牙龈myofibroblasts被假设是肠道上皮细胞组成部分利基和调节自我更新和分化的isc (40]。Cocultures人类起源细胞的使用表明,某种类型的婴儿成纤维细胞可以增加人类的寿命瀑样/肠状的文化[33,34]。我们证明成年小鼠pericryptal成纤维细胞也影响地下室大小和生存在一个器官型培养设置直接上皮间充质细胞接触,再次表明,成纤维细胞代表利基为肠道干细胞及其分化细胞的能力。

作为另一个例子,我们证明正常肠道隐窝展览减少萌芽在矩阵由胶原蛋白和基底膜基质培养(细胞矩阵用于OTC)。因为人工基底膜已经含有胶原蛋白,细胞矩阵场外交易的特点是胶原蛋白浓度的增加,可能会导致增加的刚度矩阵。我们的结果证实先前的发现,胶原蛋白可以修改矩阵的瀑样文化(41),建议增加胶原蛋白浓度有重大影响肠道瀑样的生长条件,因为它限制了芽的形成和应被视为未来瀑样分析文化系统的警告。

积累的研究已经指出的重要性神经的调节肠道干细胞利基(12,17,42,43]。神经瘤形成的发展的作用也被提出(17,28,29日]。神经纤维被证明支持致癌作用通过机械方面,是一个由围神经的解剖结构用作指导肿瘤的生长肿瘤入侵,或功能方面,包括神经递质影响当地的血管化,邻近细胞的迁徙活动,或neoneurogenesis本身(29日,44,45]。有趣的是,胃的手术或药理去神经后,结果表明,去除神经支配胃的一部分有明显降低肿瘤发病率和发展在不同的胃癌小鼠模型17]。同时,这是相关的差别,对这些Wnt3a干细胞利基的去除神经支配胃的一部分。在这里,我们提出一个新颖的方法来隔离不同的肠神经从鼠标存在被Dclk1-Cre-Tom / GFP血统和执行cocultures神经贲门瀑样在体外(数据5和6)。

我们先前表明,肠道12和胃17可以cocultured]瀑样神经元。我们证明,当培养贲门瀑样,具体取决于Wnt信号3 d单作系统,在与神经coculture这些显然是能够取代Wnt信号。Wnt通路代表isc的基本信号通路和这条通路的失调导致肠癌46]。我们的分析主要是圆形的文化和cocultures贲门瀑样从巴雷特食管小鼠模型演示了一些有趣的细节在肠道利基神经元之间的相互作用。瀑样培养Wnt-conditioned介质相比,标准的地穴中已经显示瀑样增长的显著差异(见表7和10天之后2,数据6 (h)和6(我)),直径和周长的测量申请增长的决心。coculture与神经元还显示一个高度显著差异瀑样增长相比,标准的地穴中七和十天后Wnt没有任何补充。同样的效果反映在每口井的瀑样数增加1.5倍Wnt-conditioned单一文化和神经元coculture单作相比标准。有趣的是,增长和瀑样数没有显著差异在Wnt-conditioned培养基培养瀑样或cocultured神经元之间,无论是在第七天还是在第十天。用钙成像显示cocultured神经元还活着和生理活性在观察期间,由这些显著差异的强调瀑样增长之间的控制和cocultured组。

从这些结果来看,在缺乏Wnt最有可能促进瀑样生长的瀑样神经元的影响,这可能表明,神经元和发射器取代Wnt信号的影响。认为神经信号,这创造了一个增殖环境和支持瀑样增长比通常应用生长因子用于标准的墓穴中,由赵和学院已经假定和显示可能存在(17]。在他们的研究中,胃瀑样增长显著提升如果cocultured神经元和神经元但在刺激毛果芸香碱(一种非特定的毒蕈碱的受体激动剂),和Wnt目标基因等Lgr5就,Cd44,Sox9被证明是高(17]。在未来的研究仍有待阐明因素导致增加神经元coculture瀑样增长相比Wnt-conditioned媒介。神经元是神经营养因子的丰富来源包括神经生长因子(神经生长因子),GDNF家族的配体(如GDNF、artemin和neurturin),或转化生长因子β1 (47]。可以想象,这些因素可能会大大促进瀑样的维护和增长或干细胞利基的胃。在我们的实验中应用神经生长因子neurobasal介质,这还有待澄清如果我们在这里描述的效果是由于这个单一神经营养因子或其他人。我们的观察也表明肠神经元可能有相似的营养功能在维护肠道上皮的完整性,众所周知肠神经胶质细胞(48]。因此我们强烈支持未来重点调查通路神经元之间的相互作用和肠道干细胞特征的构成癌症干细胞利基,培育发展的治疗指导恶性肿瘤的起源作为公认的治疗目标。

目前,广泛的下游方法可用来分析瀑样,例如,免疫组织化学和免疫荧光11,49],CRISP-Cas9系统[50,51],瀑样与逆转录病毒转导构造[52),或clonogenicity试验(53)(见图7)。结合肠道的文化碎片体外(15),保留了特定的本地利基,我们建议这些类型的文化为可靠的生理相关的3 d模型,分析在肠道干细胞利基mesenchymal-epithelial相声和识别潜在的早期肿瘤发生机制。虽然我们的结果到目前为止不允许任何特定角色的基本结论这些组件在一个干细胞利基,呈现coculture方法指向一个重要的功能描述三维基质细胞类型的文化条件。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

阿格涅斯卡Pastuła和莫里茨德霍夫同样导致了本文。

确认

阿格涅斯卡Pastuła收到劳拉低音部奖和慕尼黑工业大学Leonhard-Lorenz-Stiftung奖。迈克尔·Quante是德意志Krebshilfe Max-Eder支持的项目。

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