分析内皮细胞和内皮祖细胞释放的外泌体的新方法

摘要

外泌体(EXs)是细胞来源的小泡，介导细胞间通讯，可作为生物标记。在这里，我们描述了通过结合微珠和荧光量子点(Q-dots®)技术纯化内皮细胞(ECs)和内皮祖细胞(EPCs)释放EXs和表型的新方法。利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)系统，从细胞特异性抗体偶联微珠和二抗体偶联Q-dots培养液中分离并检测EXs。观察细胞起源标记对ECs (CD105、CD144)和EPCs (CD34、KDR)的敏感性。使用EXs (CD63)、血小板(CD41)、红细胞(CD235a)和微泡(Annexin V)的阳性和阴性标记来检测敏感性和特异性。此外，该方法还在无颗粒血浆和患者样本中进行了进一步验证。结果表明，抗cd105 /抗cd144和抗cd34 /抗kdr分别对EC-EXs和EPC-EXs的分离和检测灵敏度和特异性最高。该方法总回收率达70%以上，能够检测急性缺血性脑卒中患者循环EC-EXs和EPC-EXs的动态变化。综上所述，我们开发了灵敏、特异性的荧光NTA方法用于EC-EX和EPC-EX的分离和检测，这将有助于功能研究和生物标志物的发现。

1介绍

外来体（EXS）是从多泡内体细胞室衍生的纳米级胞外囊泡[1- - - - - -3.]。释放后，EXs可以在临近释放点的细胞外空间循环，或进入生物液体(如血浆、尿液和脑脊液)。最近的研究表明，EXs携带其母细胞的遗传和蛋白质组内容[4,5]。此外，越来越多的证据表明EXs是细胞间通讯的重要介质，在生理和病理生理过程中发挥重要作用。它们被证明与炎症、肿瘤发生、心血管疾病等有关[6- - - - - -10]。因此，更好地理解EXs在生物体液中的表型是必要的。然而，有限的研究显示了从生物液中分离和检测特异性EXs的方案。尽管传统的EX分离技术，如超离心力分离和密度梯度分离，可以实现EX的收集，但由于EX的大小和浮力密度相似，这些技术无法从EX化合物中分离出特定表型的EX [11]。

微珠是被缀合至高度特异性抗体对在细胞表面上的特定抗原超顺磁性粒子。他们往往通过他们的涂层抗体用于分离和富集特定的细胞亚群12]。由于EXs携带其亲本细胞的抗原，因此可以合理地假设特异性的抗原偶联微珠可用于EXs的分离、纯化和富集。纳米颗粒跟踪分析(NTA)是一项新技术，可以检测到直径为30纳米的小泡[13,14]和计数使用缀合到称为量子点（Q点）的荧光探针抗体EXS的特定亚组[6,15]. Q点和荧光NTA在表型特异性循环细胞外小泡、合胞滋养细胞衍生的微泡和上皮性肿瘤细胞衍生的Ex中的应用已被证实[15,16]。基于这些观察结果，我们假设细胞特异性抗体偶联微珠与荧光q点结合能够从生物体液中分离和表型EXs，特别是那些暴露其亲本细胞多个表面抗原的EXs。

为开发方法,在这项研究中,我们使用一个特定的内皮细胞表面抗原(ECs)或内皮祖细胞(EPC)来捕获练习从培养ECs释放或内皮祖细胞,然后我们探索与其他电子商务或EPC特定表面抗原表型捕获的练习。就我们所知，这是第一个描述结合微珠、荧光q点和NTA检测特异性EXs的工作。此外，该方法还能准确计算人血浆中的EC-EXs和EPC-EXs。

2.材料和方法

2.1。细胞培养基中EXs的制备

人脑微血管内皮细胞购自Cell Systems (Kirkland, WA)，在含10%血清、2%人重组生长因子和0.2%抗生素溶液的CSC完全培养基中培养，在标准细胞培养条件下(5% CO₂, 37°C)。细胞培养基每周更换两次。本研究使用第4 ~ 13段ECs进行实验。EPCs购自Amsbio。对于EC-EX的制备，使用含2%人重组生长因子和0.2%抗生素溶液的CSC培养基(细胞系统)挑战ECs 24小时。EPCs - ex制备时，EPCs用EPC基础培养基(Amsbio)和0.2%抗生素溶液刺激24小时。收集细胞培养基，300 g离心15 min, 2000 g离心30 min，去除细胞及细胞碎片。无细胞培养基2万g离心70 min, 17万g超离心6 h，制粒EXs。颗粒状EXs用20 nm过滤(霍曼，匹兹堡，PA)磷酸盐缓冲盐(PBS)和NTA的ali引用重悬。

2.2。用抗cd105或抗cd34共轭微珠从EC和EPC培养基中分离EC- exs和EPC- exs

根据制造商的修改说明，将颗粒状EXs与10孵育μL生物素偶联抗cd105(特异性对ECs)、抗cd41(特异性对血小板)、抗cd235a(特异性对红细胞)或抗cd34(特异性对EPCs)抗体(Miltenyi Biotec)在100μL反应体积2小时，加10μL的抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)。然后，一个磁铁模块被用于分离微珠标记的EXs从总EX悬浮液。经过一夜的磁铁分离，流体被轻轻从磁铁中取出，并被认为是废物。将结合微珠的EXs重悬100μL过滤PBS，加入10μL of multisort release reagent (Miltenyi Biotec) for 10 min to cleave off the microbeads from EXs by following the manufacturer’s instruction. Then, all samples were added with 150 μL过滤PBS，使最终体积为250μL并置于磁铁处(DynaMag-2;(生活科技)可以在一夜之间去除释放出来的微珠。第二天，收集的液体被认为是CD105⁺，CD41⁺, CD235a⁺,或者CD34⁺以前的。使用NTA NS300系统（Malvern Instruments）枚举所有隔离的Ex。纯化效率计算为微珠阳性EXs数除以EXs总数。

2.3。免疫荧光标记CD105⁺练习和CD34⁺练习与q导

分离出的CD105⁺或CD34⁺然后将EXs与其他一抗孵育，山羊抗CD144(特异的ECs)，山羊抗KDR(特异的EPCs)，山羊抗Annexin V(特异的MVs)，山羊抗CD63(特异的EXs)(1:200稀释;，孵育2小时，然后用Q-dot 655标记的兔抗山羊IgG孵育(1:35稀释;将过滤后的PBS添加到EX悬浮液中，最终体积为700μL.所有样品由NTA NS300系统(英国Malvern仪器公司)进行分析。

2.4。纳米颗粒跟踪分析

使用带有405 nm激光仪器(英国Malvern仪器公司)的纳米瞄准具NS300检测EXs，不需要标记或用稳定的荧光团标记。用100 nm和200 nm的聚苯乙烯乳胶标定珠检测仪器性能。在本研究中，我们将含有EXs的稀释悬浊液装入样品室，样品间的荧光散射模式保持在10照相机水平，样品间的荧光散射模式保持在16照相机水平。NTA的光散射模式使用相机滤镜1，而荧光模式使用相机滤镜2，并配备了430 nm的长通滤镜。以每秒30帧的帧率拍摄了三段时长通常为30秒的视频。数据分析采用NTA 3.0软件(Malvern Instruments)，该软件经过优化，逐帧对每个粒子进行识别和跟踪。

2.5。计算双标记EXs的检测和总体效率

CD105的检测效率⁺q导⁺练习和CD34⁺q导⁺EXs计算公式如下:(CD105⁺q导⁺)EXs%=（CD105的数量⁺q导⁺EXs)/(CD105的总数⁺EXS）;(CD34⁺q导⁺) EXs% = (CD34的数目⁺q导⁺EXs)/(CD34的总数⁺练习)。测量CD105的总体效率⁺q导⁺练习或CD34⁺q导⁺EXs计算公式如下:(CD105⁺)EXs%=（CD105的数量⁺q导⁺EXs）/（EXs总数）；（CD34⁺) EXs% = (CD34的数目⁺q导⁺EXs)/(EXs的总数)。

2.6条。蛋白质和蛋白质印迹分析

用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(Thermo Scientific, FL)从EC-EXs和EPC-EXs中分离蛋白。蛋白浓度测定采用Bradford assay试剂盒(Bio-Rad Laboratories)。BSA的线性范围为0.2 ~ 0.9 mg/mL。用荧光光谱仪(BioTek仪器)在595 nm处读取板。蛋白经电泳后转移到PVDF膜上进行western blot分析。在5%的奶粉中孵育1小时，然后在4℃与一抗孵育过夜，膜被阻断。一抗为抗cd63 (1:400);BD Biosciences)，抗cd105 (1:500;抗cd34(1:500，圣克鲁斯)，和β-actin (1:4000, Sigma)膜清洗彻底后，用辣根过氧化物酶偶联的IgG孵育(1:40000;在室温下1小时。然后用增强化学发光显影溶液显影。

2.7。EC-EXs和EPC-EXs的TEM

练习从EC和EPC条件培养基是固定的2%戊二醛和后缀的1%锇(都从电子显微镜购买科学,哈特菲尔德,PA),然后他们嵌入Spurr树脂(σ,圣路易斯,密苏里州)和烤60°C根据制造商的指示和我们之前的研究17]。用MT7000制备超薄切片(60-80纳米)，安装在300目铜网格上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。所有样品在加速电压为70 KV的em208(飞利浦)透射电子显微镜下进行检验。

2.8条。从无粒子等离子体中回收EC-EXs和EPC-EXs

人血浆用过滤后的PBS稀释5倍，200 g离心20分钟。上清离心20000 g，离心70 min, 170,000 g，离心6 h。超离心离心后的上清用NTA分析，认为是无微粒血浆。已知量(6×10)⁸将从ECs和EPCs中分离的EC-EXs或EPC-EXs颗粒)加入到1ml制备的无颗粒血浆中。将EC-EXs/particle-free plasma和EPC-EXs/particle-free plasma的混合物4℃，20000 g离心70 min, 170,000 g超离心6 h，制粒回收EC-EXs和EPC-EXs。回收的EC-EXs和EPC-EXs用过滤后的PBS重悬，用抗cd105 -、抗cd34 -、抗cd41 -或抗cd235标记的微珠分离，用NTA分析。同样，用抗cd144 -、抗annexin V-、抗kdr -或抗cd63 -共轭q -点检测回收的微珠阳性EXs，然后用荧光NTA进行分析。回收率计算为微珠阳性EXs数除以EXs总数。同样，恢复的CD105的检测和总体效率⁺q导⁺练习和CD34⁺q导⁺EXs计算方法如上所述。

2.9。研究对象

这项研究招募了16名来自奥克斯纳医学中心神经内科的缺血性中风患者。缺血性脑卒中患者在卒中发生后第1天采集外周血(3ml)。将16例患者分为两组:一组进行cEC-EXs分析();另一组用于检测cEPC-EXs ()。本研究的受试者排除标准包括以下情况:(1)前一个月患有传染病;(2)自身免疫性疾病、周围血管疾病或卒中史;(3)短暂性脑缺血发作、脑梗死、脑出血;(四)肝功能衰竭和急慢性肾病;(5)近3个月最近有心肌疾病;(6)控制血脂、抑制炎症、抑制免疫的药物;(7)癌症史。所有的实验方案都得到了奥克斯纳医学中心神经内科和莱特州立大学IRB委员会的批准。在参与本研究之前，每位参与者均已获得书面知情同意。

2.10。制备和分析，由人血浆循环EXS的

采用含3.13%柠檬酸钠的试管在入院第一天(第1天)、入院后第3天、第5天抽取缺血性脑卒中患者全血(3ml)。全血用过滤后的PBS稀释3x, 4℃离心400 g，离心35 min;最上层收集为血浆。取血浆1ml, 2000 g离心20分钟，去除血小板。收集上清液，2万g离心70 min, 17万g超离心6 h，制粒循环EXs (cEXs)。颗粒状cEXs用过滤后的PBS重悬，然后用抗cd105或抗cd34标记的微球分离，用NTA分析。然后用抗cd144 -、抗annexin V-、抗kdr -或抗cd63 -共轭q -点检测捕获的cEXs，然后用荧光NTA进行分析。用荧光NTA计算cEXs的比例为(CD105)⁺q导⁺) cEXs% = CD105⁺q导⁺cEXs /总cEXs;(CD34⁺q导⁺)cEXs%=CD34⁺q导⁺CEX/总CEX。cEC-ex和cEPC-ex的绝对数为CD105的绝对计数⁺CD144⁺cEXs或CD34⁺KDR⁺每毫升人血浆的cEXs。

2.11。统计分析

实验数据以均数±SEM表示，采用单或双向方差分析(ANOVA)进行分析。用Spearman秩相关检验(SPSS 17.0;SPSS,芝加哥,IL)。的值认为具有统计学意义。

3.结果与讨论

3.1。用NTA、TEM和Western Blot对EC和EPC培养基中分离的EXs进行了表征

Nanosight NS300系统用100 nm和200 nm的聚苯乙烯珠进行校准(图)1(一))在检测实验样品之前。如图所示1 (b)，在前贫EC介质和消失模铸造介质中只留下少量颗粒。EC-EXs的平均尺寸为158±55 nm, EPC-EXs的平均尺寸为154±59 nm，与之前的观察结果一致[18,19]。同时，我们的TEM结果与NTA数据一致，表明EC-EXs和EPC-EXs由小于200nm的小颗粒组成(图)1 (c))。此外，我们的western blot结果显示，EC-EXs和EPC-EXs表达的CD63是最常见的EXs相关蛋白家族之一，通常被用作EX标记[20.,21]进一步证实所分离的微球粒子为EXs。同时，发现EPC和ex34细胞表达cds并不特异1 (d))。在未来的研究中，可以分别在不同条件下的EC- exs和EPCs释放的EPC- exs中检测EC和EPC的其他特异性标记，如CD31和CD133。因为许多先前的研究使用EXs的蛋白质浓度，而不是粒子数作为功能分析的量化参数[22- - - - - -24]分析了蛋白质浓度与EC-EXs和EPC-EXs颗粒数的相关性。相关系数图显示，NTA检测到的EC-Ex和EPC-Ex浓度与Bio-Rad蛋白质测定法测定的各自蛋白质浓度高度正相关（图1 (e)). 这种相关性可用于从颗粒数推断蛋白质浓度体内未来的实验。

3.2。EC-EXs和EPC-EXs通过与抗cd105、抗cd34偶联微珠和抗cd144、抗kdr偶联Q-Dots结合分离得到

首先，为了进一步发展方法，我们以体外培养的ECs的EC-EXs作为标准样品建立分离方法。我们也用体外培养的EPCs释放的EPC-EXs证实了这种分离方法。因为一组标记(CD34, KDR)已被用作EPCs的替代标记[25,26， CD105和CD144已被鉴定为ECs [27，我们使用这些抗体来建立方法。数据显示，抗cd105标记的微珠纯化EC-EXs的效率最高(>94%)(图)2(一个))和抗cd34偶联微球纯化EPC-EXs的效率最高(>93%)(图)3(一个))，与那些阴性对照分离的，如抗cd41 -(血小板特异性)或抗cd235a -(红细胞特异性)结合微珠。这些结果反映了CD105对分离EC-EXs和CD34对分离EPC-EXs的特异性，也进一步证明了可以利用EX表面表达的抗原选择性分离EC-EXs的观点[28]。

在与针对CD144（EC标记）、KDR（EPC标记）或CD63的Q-点结合抗体孵育后，纯化的CD105⁺练习和CD34⁺EXS通过荧光分析NTA。根据NTA，CD105的检测效率的结果⁺CD144⁺EXs约为70%，CD105为70%⁺KDR⁺EXs只有大约30%(图)2 (b))。同样，CD34的检测效率⁺KDR⁺EXs约为68%，CD34⁺CD144⁺EXS仅为20％左右（图3 (b))。EXs检测的总体效率显示，从EC培养基中分离出的EXs中，有超过62%的EXs附着在CD105和CD144上(图)2 (c))。同样，从EPC培养基中分离出的EXs中，大多数(72%)用CD34和KDR标记(图)3 (c))。为了进一步排除颗粒中的污染，我们将捕获的抗cd105或抗cd34 EXs与抗cd63偶联q点或抗annexin v偶联q点孵育。数据显示，超过70%的捕获EXs对CD63呈阳性，而其中少数表达Annexin V，这表明捕获EXs的微珠中MVs的污染较低。值得注意的是，CD105的大小⁺EXs(黑色曲线)与标记CD105的q点重叠⁺练习(黄色曲线)。同样，CD34的大小⁺EXs(黑色曲线)与标记CD34的q点重叠⁺EXs(黄色曲线)(图表2 (d)和3 (d))。这些数据表明q点结合并没有改变EXs的物理特性。

总的来说，所有这些结果的证实结合微珠和Q点与荧光NTA的方法能够从颗粒池灵敏地和具体地枚举EXS。

3.3。利用无微粒血浆中的抗cd105或抗cd34偶联微珠和抗cd144或抗kdr偶联q点，可以回收EC-EXs和EPC-EXs

为了测试上述方法从血浆中提取EXs的效率，我们加入了已知量(6×10)⁸CD105的粒子)⁺练习或CD34⁺并对其回收率和检测效率进行了评价。如所述，已知的EXs数量(6×10)⁸粒子）加入到无颗粒血浆中，然后与抗CD105-、抗CD41-、抗CD235a-或抗CD34-共轭微球孵育。数据显示，几乎90%的添加的EC-Ex和EPC-Ex是通过抗CD105-捕获的-（图4(一)或抗cd34共轭微珠(图)5(一个)），而很少EXS的通过抗CD41或抗CD235A（阴性对照）捕获，进一步验证所述微珠的特异性和灵敏度用于捕获EXS。与第二抗体和Q点温育后，NTA结果表明，CD105的检测效率⁺CD144⁺EXs约为72%，CD105为72%⁺KDR⁺EXs约为42%（数字4 (b))。CD34的检测效率⁺KDR⁺EXs约为69%，CD34⁺CD144⁺EXs只有17%(图)5 (b))。

从EX测量的总体效率可以看出，70%以上的EC-EXs与CD105和CD144共混(图)4 (c))。同样，大部分(65%)恢复的EPC-EXs使用CD34和KDR标记(图)5 (c))。同样，我们用CD63和Annexin V来鉴定颗粒是否为EXs。数据显示，两种捕获的EXs中有75%以上CD63阳性，而Annexin V阳性的只有少数，这与图中所示的绝对数量一致4 (d)和5 (d). 这些数据与我们在标准EC-EX和EPC-EX样品中观察到的结果一致，进一步验证了所建立方法的纯化效率和特异性。

3.4。采用抗cd105或抗cd34偶联微珠结合抗cd144或抗kdr偶联Q-Dots方法分离急性缺血性卒中患者血浆中的cecc - exs和cEPC-EXs

先前的研究已经表明，升高的循环CD105的水平⁺CD144⁺血管疾病患者血浆中发现了内皮衍生的细胞外微泡，这表明它们可以作为内皮功能的替代标记物[10]。在临床研究和比较不同来源的EXs时，EXs的枚举和表型是重要的考虑因素。然而，EXs的纳米尺寸使流式细胞术的计数更准确[29,30.]。通过使用这里所描述的方法，我们首先从血浆样本中证明了表型EXs的概念。

如图所示6大约21.8%和10.8%的cEXs分别被抗cd105和抗cd34结合的微珠捕获。通过q点偶联抗体的检测，我们发现约12%的cEXs为CD105⁺CD144⁺cEXs和cEXs总数的7.9%为CD34⁺KDR⁺cEPC-EXs。在收集的cEXs中，20%共表达CD105和CD63, 10.2%共表达CD34和CD63。cEXs中表达Annexin V的百分比很低，这反映了收集的cEXs中循环MVs的交叉污染极低。大约有1.15×10⁷CD105⁺CD144⁺c - exs和8.3×10⁶CD34⁺KDR⁺每mL血浆CEPC-EXS病人入院（图后从第1天收集6(a3)和6（b3））。

3.5。CEC-EXS和CEPC-EXS的动态变化在急性缺血性卒中患者血浆

此外，我们还评估了CD105的动态变化⁺CD144⁺cEC-EXs和CD34⁺KDR⁺患者在入院后第1、3和5天的cEPC-EXs。如图所示7，我们发现CD105水平显著升高⁺CD144⁺第3天和第5天的cEC EXs与第1天相比。EC-EXs的研究使我们能够研究内皮细胞的状态体内，为进一步了解中风的病理生理学提供了一种有前景的新方法。同时，这一结果也为EC-EX作为缺血性卒中内皮损伤的生物标志物提供了支持。

正如分析了NTA，有CD34的显著水平升高⁺KDR⁺cEPC-EXs在第5天与第1天比较，但在第1天和第3天之间没有差异。缺血性中风中EPC-EXs的增加可能是由于缺血后循环内皮祖细胞数量的增加。综上所述，所有这些发现将有助于开发EXs治疗缺血性中风。

4.结论

总之，在本研究中，我们已经建立了灵敏，特异的方法，即表型和细胞培养液和血浆样品中枚举EXS。鉴于其方便，适用范围广，高潜力的发现，我们认为这些方法可能是一个重要的补充技术剧目为EXS的多种系统，从心血管炎性疾病的定性和定量评估。

相互竞争的利益

作者声明，不存在相互竞争的经济利益。

作者的贡献

王金菊、郭润民和杨益民是平等的贡献者。

致谢

这项工作是由美国国家心脏，肺和血液研究所（HL-098637，艳芳晨），美国心脏协会（15PRE25700198，晋州王）和中国国家自然科学基金委员会（NSFC，没有。81270195）的支持。

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