人类大脑微血管ECs买来电池系统(柯克兰,佤邦)和培养CSC完全培养基中含10%血清,2%的人类重组生长因子,和0.2%的抗生素溶液标准细胞培养条件下(5%股份有限公司₂,37°C)。细胞培养基是改变了每周两次。段落4到13的ECs被用于实验研究。内皮祖细胞从Amsbio购买。EC-EX准备,ECs挑战与CSC介质(细胞系统)补充2%的人类重组生长因子和0.2%的抗生素24人力资源解决方案。EPC-EX准备,内皮祖细胞与EPC挑战基础培养基(Amsbio)和0.2%的抗生素24人力资源解决方案。然后,细胞中收集和离心机在300克15分钟,随后在2000 g离心30分钟去除细胞和细胞碎片。脱细胞培养基离心机在20000克70分钟,然后离心器在170000克6小时缩短到颗粒的练习。颗粒状的练习与20 nm resuspended过滤(绘画纸、匹兹堡、PA)磷酸盐(PBS)和NTA整除。

根据制造商的指示,修改,颗粒状的练习与10孵化 μL (Biotin-conjugated anti-CD105 ECs(具体),anti-CD41血小板(具体),anti-CD235a红细胞(具体),或anti-CD34 epc(具体)抗体(Miltenyi研究)在100年 μL反应体积为2小时,其次是增加10 μL (anti-Biotin微(Miltenyi研究),分别。然后,一块磁铁模块应用于独立microbeads-labeled总前悬挂的练习。一夜磁铁分离后,液体被温柔地远离磁铁,被认为是废物。微磁约束练习resuspended 100 μL过滤PBS和添加10 μL multisort释放试剂(Miltenyi研究)10分钟断开的微磁练习按照制造商的指示。然后,所有样本与150年补充道 μL过滤PBS最后卷250 μL和被放置在一个磁铁(DynaMag-2;生命技术)的发布微过夜。第二天,收集并视为CD105流体⁺,CD41⁺,CD235a⁺,或者CD34⁺练习。孤立的练习都是枚举通过NTA NS300系统(莫尔文仪器)。净化效率计算microbead积极练习的数量除以总数量的练习。

孤立的CD105⁺或CD34⁺练习与其他组主要抗体,然后孵化goat-against CD144 ECs(具体),goat-against KDR epc(具体),goat-against膜联蛋白V (MVs具体),或goat-against CD63练习(具体)(1:200稀释;圣克鲁斯生物技术),2小时,其次是孵化兔抗体免疫球蛋白结合q导655(1:350稀释;生命技术)90分钟rt,过滤PBS被添加到前悬挂给最终成交量为700 μl .所有样品分析NTA NS300系统(英国莫尔文仪器)。

的NanoSight NS300 405 nm激光仪器(英国莫尔文仪器)是用于检测练习没有标签或标记与稳定的荧光团。NanoSight聚苯乙烯乳胶校准珠子、100 nm和200 nm),应用于检查仪器性能。在这项研究中,稀释悬浮液含练习被加载到样品室,和相机水平维持在10光散射模式和16岁之间的荧光散射模式样本。氮川三乙酸光散射模式使用相机过滤器1,和荧光模式使用的相机过滤器2长传球430纳米过滤器。三个视频通常30秒的持续时间,以每秒30帧的帧速率。NTA 3.0软件分析的数据(莫尔文仪器)进行优化,首先识别并跟踪每个粒子在一帧一帧的基础上。

CD105的探测效率⁺q导⁺练习和CD34⁺q导⁺练习计算如下:(CD105⁺q导⁺)练习% = (CD105的数量⁺q导⁺练习)/ (CD105的总数⁺练习);(CD34⁺q导⁺)练习% = (CD34的数量⁺q导⁺练习)/ (CD34的总数⁺练习)。测量CD105的整体效率⁺q导⁺练习或CD34⁺q导⁺练习计算如下:(CD105⁺)练习% = (CD105的数量⁺q导⁺练习)/(练习的总数);(CD34⁺)练习% = (CD34的数量⁺q导⁺练习)/(练习)的总数。

蛋白质从EC-EXs EPC-EXs与裂解缓冲隔离(热科学、FL)含有蛋白酶抑制剂。蛋白质浓度测定进行了使用布拉德福德化验设备(Bio-Rad实验室)。BSA的测定的线性范围从0.2到0.9毫克/毫升。板块在595 nm阅读使用荧光谱仪(BioTek仪器)。免疫印迹分析,蛋白质电泳和转移到PVDF膜。膜被封锁的孵化与5%的奶粉1小时,其次是孵化主要抗体在一夜之间在4°C。主要的抗体使用anti-CD63 (1: 400;BD生物科学),anti-CD105 (1: 500;Santa Cruz), anti-CD34(1: 500年,圣克鲁斯) β肌动蛋白(σ1:4000)。彻底清洗后,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated免疫球蛋白g (1: 40000;杰克逊ImmunoResearch实验室)在室温下1小时。屁股被发达国家增强化学发光与发展中解决方案。

练习从EC和EPC条件培养基是固定的2%戊二醛和后缀的1%锇(都从电子显微镜购买科学,哈特菲尔德,PA),然后他们嵌入Spurr树脂(σ,圣路易斯,密苏里州)和烤60°C根据制造商的指示和我们之前的研究 17]。超薄部分(60 - 80 nm)与MT7000准备,安装在300 -铜网格,网格和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。所有样本检查EM 208(飞利浦)透射电子显微镜在加速电压70 KV。

人类血浆稀释5倍PBS过滤和离心20分钟的200克。上层清液离心机在20000克70分钟,其次是超速离心法在170000克6小时。后上层清液由NTA超速离心法进行了分析,认为particle-free等离子体。已知量(6×10⁸粒子)EC-EXs或EPC-EXs隔绝ECs,内皮祖细胞加入1毫升的准备particle-free等离子体。EC-EXs / particle-free等离子体和EPC-EXs / particle-free等离子体混合物在20000 g离心机在4°C为70分钟,然后离心器在170000克6小时缩短到颗粒恢复EC-EXs EPC-EXs。恢复EC-EXs和EPC-EXs resuspended anti-CD105 - PBS过滤然后孤立anti-CD34, anti-CD41或anti-CD235-conjugated NTA微和分析。同样,恢复微积极练习与anti-CD144探测,anti-Annexin V - anti-KDR或anti-CD63-conjugated q导并随后分析,荧光NTA。回收率计算微积极练习的数量除以总数量的练习。同样,检测和恢复CD105的整体效率⁺q导⁺练习和CD34⁺q导⁺练习计算如上所述。

本研究招募了16缺血性中风患者的神经病学奥克斯纳医学中心。外周血(3毫升)收集缺血性中风患者入院时天(第一天)卒中后发生。16个病人分为两组:一组为cEC-EXs分析( n = 8 );另一组是用来检测cEPC-EXs ( n = 8 )。排除标准为本研究的主题包括下列情况:(1)上月传染病;(2)自身免疫性疾病的历史,末梢血管疾病,或中风;(3)短暂性脑缺血发作、脑梗死和脑出血;(4)肝功能衰竭和急性或慢性肾脏疾病;(5)近期心肌疾病在过去的3个月;(6)药物脂质控制,抑制,炎症或免疫抑制;和(7)历史的癌症。所有实验协议被部门批准奥克斯纳医疗中心和神经病学的IRB委员会莱特州立大学。书面知情同意之前就从每个参与者获得注册。

全血样品(3毫升)来自缺血性中风患者在入院3和5天(第一天)和天入院后使用含有3.13%柠檬酸钠的管子。整个血样稀释3 x过滤PBS和离心机在4°C 400 g 35分钟;最外层组织收集等离子体。1毫升的等离子体在2000 g离心20分钟去除血小板。上层清液收集和离心机在20000克70分钟,然后上层清液离心器在170000 g 6小时缩短到颗粒循环练习(cEXs)。与过滤的颗粒状cEXs resuspended PBS,然后由anti-CD105孤立——或者anti-CD34-conjugated NTA微和分析。然后,探讨了微磁捕获cEXs anti-CD144, anti-Annexin V - anti-KDR或anti-CD63-conjugated q导并随后进行了分析,荧光NTA。使用荧光NTA cEXs的比例计算(CD105⁺q导⁺)cEXs % = CD105⁺q导⁺cEXs /总cEXs;(CD34⁺q导⁺)cEXs % = CD34⁺q导⁺总cEXs cEXs /。cEC-EXs的绝对数量和cEPC-EXs CD105的绝对数量⁺CD144⁺cEXs或CD34⁺KDR⁺人类血浆cEXs每毫升。

实验数据被表示为均值±SEM和分析使用一个或双向方差分析(方差分析)。例数字与蛋白质浓度的相关性进行了分析使用斯皮尔曼等级相关测试(SPSS 17.0版;SPSS,芝加哥,IL)。的值 P < 0.05 被认为是统计学意义。

的Nanosight NS300系统校准与100 nm和200 nm聚苯乙烯珠(图 1(一)检测实验样品之前)。如图 1 (b),只剩下几个粒子EX-depleted EC中、EPC媒介。EC-EXs的平均大小是158±55纳米和EPC-EXs 154±59海里,这与先前的观察是一致的( 18, 19]。与此同时,我们的TEM结果按照NTA数据显示,EC-EXs和EPC-EXs由小颗粒直径小于200纳米(图 1 (c))。此外,我们的免疫印迹结果表明EC-EXs和EPC-EXs CD63表达的蛋白质家庭最常与练习,通常用作标记(交货 20., 21),进一步确认microbeads-isolated粒子是练习。与此同时,这并不令人惊讶,发现EC-EXs表达他们的父母细胞标记CD105和EPC-EXs表达EPC特定标记CD34(图 1 (d))。在未来的研究中,其他EC和EPC特定标记如CD31和CD133可以测试EC-EXs和ECs EPC-EXs释放内皮祖细胞在不同条件下,分别。许多先前的研究使用的蛋白质浓度的练习,而不是粒子数,作为他们的功能分析的量化参数 22- - - - - - 24),我们分析了蛋白质浓度之间的相关性和EC-EXs的粒子数量或EPC-EXs。相关系数图表明EC-EXs和EPC-EXs检测到的浓度NTA高度呈正相关蛋白质含量与各自衡量Bio-Rad蛋白质化验(图 1 (e))。这种相关性可以应用到粒子数量的推断蛋白质浓度 在活的有机体内在未来的实验。

首先,为了发展的方法,我们使用EC-EXs来源于培养ECs的标准样品建立隔离方法。我们也证实了这种隔离方法通过使用EPC-EXs释放培养内皮祖细胞。因为一组标记(CD34、KDR)被用作替代标记物内皮祖细胞( 25, 26)和CD105 CD144已确定为ECs ( 27),我们使用这些抗体建立方法。数据显示anti-CD105-conjugated微磁效率最高(> 94%)在净化EC-EXs(图 2(一个))和anti-CD34-conjugated微磁效率最高(> 93%)在净化EPC-EXs(图 3(一个)),相比那些孤立等消极控制anti-CD41 -(特定于血小板)或anti-CD235a红细胞(具体)共轭微。这些结果反映了特异性的隔离EC-EXs CD105和隔离EPC-EXs CD34,他们还进一步提供证据前表面抗原表达的概念可以用于他们的选择性隔离 28]。

孵化后Q-dots-conjugated抗体CD144 (EC)标志,KDR (EPC标记),或CD63,纯化CD105⁺练习和CD34⁺练习分析荧光NTA。根据氮川三乙酸结果,检测CD105的效率⁺CD144⁺练习是和CD105的70%左右⁺KDR⁺练习只有30%左右(图 2 (b))。同样,CD34的探测效率⁺KDR⁺练习是CD34的68%左右⁺CD144⁺练习只有20%左右(图 3 (b))。显示的总体效率的测量,62%以上的练习与EC培养基colabeled CD105和CD144(图 2 (c))。同样,绝大多数(72%)的练习从EPC培养基分离colabeled CD34和KDR(图 3 (c))。为了进一步排除污染粒子,我们孵化anti-CD105或anti-CD34捕获练习anti-CD63-conjugated q导或anti-Annexin V-conjugated q导。捕获的数据显示,70%以上的练习CD63是积极的,而其中的一些表达膜联蛋白V,这表明有一个低污染的MVs微磁捕获的练习。值得注意的是,CD105的大小⁺练习(黑色曲线)与q导CD105标记重叠⁺练习(黄色曲线)。同样地,CD34的大小配置文件⁺练习(黑色曲线)与q导CD34标记重叠⁺练习(黄色曲线)(数据 2 (d)和 3 (d))。这些数据表明,q导绑定并没有改变练习的物理特性。

总的来说,这些结果表明,荧光的方法结合微和q导NTA能够敏感和具体列举练习从一个粒子池。

为了测试练习的采收率等离子体通过使用上面描述的方法,我们添加了一个已知量(6×10⁸CD105的粒子)⁺练习或CD34⁺练习到particle-free等离子体,然后评估各自的回收率和检测效率。如前所述,一个已知数量的练习(6×10⁸粒子)添加到particle-free等离子体,其次是孵化与anti-CD105, anti-CD41, anti-CD235a或anti-CD34-conjugated微。数据显示,近90%的添加EC-EXs和EPC-EXs也被anti-CD105——(图 4(一))或anti-CD34-conjugated微(图 5(一个)),而很少练习被anti-CD41或anti-CD235a(负控制),进一步验证的特异性和敏感性微捕捉练习。与第二抗体和q导孵化后,NTA结果表明CD105的检测效率⁺CD144⁺练习是CD105的72%左右⁺KDR⁺练习是42%左右(图 4 (b))。和CD34的检测效率⁺KDR⁺练习是CD34的69%左右⁺CD144⁺练习只有17%(图 5 (b))。

显示的总体效率的测量,超过70%的恢复EC-EXs colabeled CD105和CD144(图 4 (c))。同样,绝大多数(65%)的恢复EPC-EXs colabeled CD34和KDR(图 5 (c))。同样,CD63和膜联蛋白V是用来确定粒子是否练习。的数据表明,75%以上两种类型的捕获CD63练习是积极的,但只有少数是阳性膜联蛋白V,这符合绝对数量如图 4 (d)和 5 (d)。所有这些数据都与我们观察到的结果一致标准EC-EX和EPC-EX样本,和他们进一步验证了净化效率和建立方法的特异性。

一项研究表明,高浓度的CD105传播⁺CD144⁺endothelial-derived细胞外微泡在等离子体被发现从血管疾病患者,这表明他们可以作为替代标记的内皮功能 10]。枚举和表现型练习是重要的考虑他们的使用在临床研究和练习的比较从不同的来源。然而,练习的纳米大小港口的准确计算通过使用流式细胞仪( 29日, 30.]。通过使用这里描述的方法,我们首先提出了证据概念的表现型练习从血浆样品。

如图 6捕捉到的,大约21.8%和10.8%的cEXs anti-CD105——或者anti-CD34-conjugated微,分别。Q-dots-conjugated抗体的调查,我们发现,大约12%的总cEXs CD105⁺CD144⁺cEC-EXs CD34 cEXs总额的7.9%⁺KDR⁺cEPC-EXs。收集cEXs中,20%的人coexpressed CD105和CD63,其中10.2% coexpressed CD34和CD63。有一个低的百分比cEXs表达膜联蛋白V,反映了极低的交叉污染的循环MVs cEXs收集。有大约1.15×10⁷CD105⁺CD144⁺cEC-EXs和8.3×10⁶CD34⁺KDR⁺cEPC-EXs每毫升血浆从病人入院后第1天(收集数据 6(a3)和 6(b3))。

此外,我们评估CD105的动态变化⁺CD144⁺cEC-EXs和CD34⁺KDR⁺cEPC-EXs天患者1、3和5后入学。如图 7,我们发现有CD105的重要水平升高⁺CD144⁺cEC-EXs在天3和5比1天。研究EC-EXs允许我们研究内皮的状态 在活的有机体内提供一个新颖的方法,有潜力的进一步了解中风的病理生理学。与此同时,这个结果提供支持EC-EX内皮损伤的生物标志物在缺血性中风。

NTA所分析的,有CD34的重要水平升高⁺KDR⁺cEPC-EXs天5比1天,但是没有天1和3的区别。EPC-EXs在缺血性中风的增加可能是由于缺血反应的循环内皮祖细胞数量增加。综上所述,所有这些发现将有助于开发治疗对缺血性中风使用练习。