减少TRPC1表达式通过Liposome-Mediated siRNA交付明显变弱诱导肺动脉高血压小鼠模型

文摘

我们测试的假设Lipofectamine siRNA交付耗尽瞬时受体电位(TRPC)阳离子通道1蛋白表达可以抑制低氧诱导肺动脉高血压(PAH)在老鼠身上。成年雄性C57BL / 6小鼠同样分为组1(正常对照组),组2(缺氧),和组3(缺氧+ siRNA TRPC1)。28天,右心室收缩压(RVSP) muscularized动脉、右心室(RV)和肺重量增加比组1组2和组3相比,组2中减少。肺拥挤的分数显示类似的模式,而肺泡囊的数量显示出相反的模式比RVSP在所有组。蛋白质的表达TRPCs HIF-1αku - 70细胞凋亡,纤维化和炎症标记物肺mRNA的表达模式相似,而蛋白质antifibrosis和VEGF的表达与RVSP的模式。肺的细胞标记DNA损伤、修复和平滑肌增殖模式类似RVSP展出。proapoptotic和肥大的mRNA表达生物标志物显示类似的模式,而肌节长度显示了相反的模式比RVSP在所有组。Lipofectamine siRNA交付有效减少TRPC1表达式,从而衰减PAH-associated房车和肺小动脉的重建。

1。介绍

肺动脉高血压患者在日常临床实践中,目前分为五类根据不同病因的疾病1]:肺动脉高血压(组1);由于左肺动脉高血压心脏病(组2);由于慢性肺病肺动脉高压和/或缺氧(组3);慢性血栓栓塞肺动脉高压(4组);由于不清楚多因子的机制和肺动脉高压(5组)。

除此之外,还有各种各样的条件与肺动脉高压有关,包括胶原血管疾病、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征,hepatopulmonary综合症(门静脉高压),复发性肺栓塞,先天性(心脏内的分流器)和心脏瓣膜病,和主肺动脉高血压(PAH) [2]。多环芳烃是一种进步,最终致命的疾病主要是由于远端闭塞和/或退化的前毛细管的肺小动脉(3- - - - - -5]。如果不治疗,患有这种疾病的患者的平均寿命极短(即。从诊断),平均2.8年3- - - - - -7]。

传统上,多环芳烃的治疗策略包括长期氧疗法或吸入的一氧化氮(8),血管舒张药(9),钙通道阻滞剂(10),静脉内皮(11,12)和内皮素拮抗剂13,14),以及磷酸二酯酶抑制剂如昔多芬(15,16]。然而,所有的这些治疗方案仍不满意,由于成本高,效果有限,或严重的副作用。开发一个令人满意的治疗策略,因此,临床医生是一个艰巨的挑战。为了实现这一目标,更深入地理解PAH的机械基础是强制性的。

瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)基因在果蝇(第一只克隆17),编码光感受器激活离子通道。广泛分布在各种细胞和组织(18- - - - - -20.),可以通过不同的机制被激活多通道。哺乳动物同源染色体构成总科的阳离子通道由6亚型(TRPC1 TRPC6) (18,21]。更重要的是,先前的研究已经表明,TRPC1和TRPC6尤其至关重要的作用在调节平滑肌细胞收缩和扩散在低氧诱导的小鼠模型多环芳烃(21]。

遗传医学提出了巨大的治疗潜力的治疗各种疾病包括癌症(22,23血友病][24]。其临床应用的关键障碍是缺乏安全有效的运载系统(25,26]。开发一种安全、有效的交付系统,因此,在临床转化研究是至关重要的,同时其随后的临床应用。

virus-based基因转导系统有显著提高基因传递的效率;然而,不受欢迎的免疫激活限制了其临床应用的发展(27]。liposome-mediated核酸交付系统是一个受欢迎的non-virus-based方法转移质粒DNA / siRNA寡核苷酸进入细胞overexpressing干扰特定基因的表达(28,29日]。最近,liposome-mediated基因传递系统已广泛应用于实验动物模型来确定在活的有机体内基因功能和基因治疗的疗效评价(30.,31日]。因此,相信这次调停者将成为基因或药物输送的一个重要工具通过liquid-spread吸入在不久的将来。通过使用Lipofectamine转染试剂,本研究测试假设siRNA可有效地消耗TRPC1蛋白表达,从而抑制低氧诱导多环芳烃在小鼠模型中基于我们之前研究的结果强调了重要的角色TRPC1 TRPC6在低氧诱导多环芳烃(21]。

2。材料和方法

2.1。道德

所有动物实验程序批准的研究所的动物保健和使用委员会长庚Hospital-Kaohsiung医疗中心(批准宣誓书动物使用协议号2008121108)和执行按照指南的护理和使用实验动物(NIH出版数量85 - 23,国家科学院出版社,华盛顿特区,1996年修订)。

2.2。慢性低氧诱导多环芳烃和分组的动物模型

0天,30无菌,成年雄性C57BL / 6小鼠(12个月),重22 - 25 g(查尔斯河技术,BioLASCO有限公司,台湾),在当前的研究中被运用。短暂,老鼠被保存在一个缺氧室,包括(1)一个塑料混合室和一个内置的电风扇氮气和氧气,笼子里的老鼠与自由水和动物食物,氢氧化钡石灰吸收二氧化碳,为消除氨和木炭粉;(2)血氧计显示腔内的氧含量始终保持在%;(3)油箱(即。,nitrogen and air) connected to the chamber for maintaining the hypoxic environment inside the chamber; (4) transparent glass window for monitoring animal activities.

确认是否就可以成功创建了小鼠低氧诱导多环芳烃在此设置,四只老鼠被牺牲了缺氧的第14天。结果表明,右心室收缩压(RVSP),索引的肺动脉收缩压(PASP),显著增加小鼠暴露于低氧与正常对照组(图1 (c))()。因此,慢性低氧诱导的小鼠模型中多环芳烃是验证我们的初步研究。

因此,动物分为正常对照组(组1,)、缺氧(28天)+ Lipofectamine交付负控制核(Dharmacon)(组2,),交付和缺氧+ Lipofectamine siRNA耗尽TRPC1(即。缺氧+核(Dharmacon)(3组,)。动物在100年第1组收到了气管内的喷雾μL生理盐水,而在组2和3收到100μL Lipofectamine交付的缺氧的siRNA 14天。

2.3。击倒的评估效率的siRNA-TRPC1 Lipofectamine交付在小鼠主动脉平滑肌细胞(smc)

确认的功效Lipofectamine转染siRNA-TRPC1和小干扰rna在主动脉smc TRPC1表达的影响(即。,primary cell culture from mouse aorta-derived SMCs), Lipofectamine siRNA-TRPC1 was transfected into aortic SMCs for 72 hours, followed by collecting the cells for Western blot analysis (Figure1 (b))。TRPC1、TRPC3 TRPC6通道被发现是广泛表达在人类血管的管径、管道最大的中型冠状动脉血管,脑动脉,较小的阻力动脉,血管滋养管(32]。这就是为什么我们使用鼠标aorta-derived smc siRNA-TRPC1 Lipofectamine交付的本实验设置。

2.4。的评估在活的有机体内Lipofectamine转染效率提供增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)质粒DNA注入小鼠肺实质通过气管内的管理

阐明Lipofectamine-based基因的转染效率,增强绿色荧光蛋白(EGFP)(即含有质粒DNA。pSuper-EGFP)被引入肺部通过气管内的喷雾。简单地说,50μg质粒DNA和Lipofectamine 5μL 100年μL opti-MEM介质之前很好地混合气管内的管理。三岁的C57BL / 6小鼠12周麻醉。一个小抹刀被用来打开鼠标的下颚和钝化钳是用来帮助取代最大口咽的舌头接触。100年μL DNA转染混合物之前加载到微灌aerosoliser (IA-1C;Penn-Century,费城,宾夕法尼亚州,美国)仔细喷洒气管插入后通过喉aerosoliser的尖端。老鼠被允许恢复,然后牺牲3天治疗后肺收集的免疫印迹分析(图1 (d))和immunofluorescent染色(图1 (e))。

同样,TRPC1基因击倒,60 pmole鼠标TRPC1-knockdown益生元(目录号码j - 043863购买从Dharmacon RNA技术(美国公司)]和5μL 100年Lipofectamine涨跌互现μL opti-MEM媒介。极低的低聚糖混合物然后气管内的喷到肺部的老鼠。

2.5。血流动力学评估和样品制备

协议和血流动力学测量程序曾被描述33- - - - - -36]。在28天的缺氧,老鼠被吸入2.0%异氟烷麻醉。剃后胸部,每只动物在室内空气气管插管机械通气支持使用小动物呼吸机(d - 79232模型,雨果·萨克斯Elektronik-Harvard装置GmbH, 3月,德国)的速度每分钟120次,潮汐卷250μl .心脏由左胸暴露。无菌25,软塑料涂层针插入到每个鼠标的右心室和左心室测量RVSP和左心室收缩压,分别,当心率> 400次/分钟。压力信号首先被传输到压力传感器(UFI,型号1050、钙、美国)然后出口到一座桥放大器(ML866 PowerLab 4/30数据采集系统;ADInstruments Pty Ltd .)城堡山,新南威尔士,澳大利亚)的信号放大和数字化。之后数据记录和分析LabChart软件(ADInstruments)。血流动力学测量后,小鼠安乐死的心和肺收获。对于每一个动物,整个心脏重量,右心室重量,肺重量,和体重记录右ventricle-to-whole心脏重量的比例计算。肺标本的准备的形态学分析是基于我们的最近的报告(33,34]。短暂,左肺膨胀以恒定气道压力(10 - 15毫米汞柱)和固定10月(Tissue-Tek)免疫组织化学染色。正确的肺被切成碎片,要么是固定在4%多聚甲醛PBS溶液在嵌入之前石蜡块苏木精和伊红染色(H & E)或储存在−80°C对蛋白质和mRNA分析。

2.6。准备和主动脉平滑肌细胞(smc)的文化

Twelve-week-old雄性C57BL / 6小鼠麻醉和牺牲。降主动脉在每个动物被切除并立即沉浸到无菌PBS缓冲。删除后结缔组织,主动脉减少纵向。内皮细胞与钳第一次被取消了。的主动脉被放置到60毫米培养皿和保持密切接触培养皿。这些组织被培养在1毫升的DMEM含有20%的边后卫+青霉素(100单位/毫升)+链霉素(100μ在湿润的气氛中g / mL) 5%的股份有限公司₂和95%的空气在37°C。到了第四天,观察主动脉平滑细胞产物释放从主动脉和培养皿底部。然后在DMEM培养补充了smc 10%的边后卫青霉素(100单位/毫升)+链霉素(100μg / mL)之前使胰蛋白酶化和播种(10⁵细胞)在35毫米培养皿。最后,10⁶细胞转移到100毫米培养皿形成subconfluent单层观察。

2.7。免疫印迹分析肺部组织

免疫印迹分析的协议和程序曾被描述(33- - - - - -36]。等量(50μg)的蛋白质提取物是加载,通过sds - page分离丙烯酰胺梯度。电泳后,分离蛋白质electrophoretically转移到一个聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(Amersham生物科学)。特异性的网站被孵化的膜阻断缓冲区(5%的脱脂奶粉T-TBS (TBS含有0.05%渐变20)]。膜是表示主要抗体孵育[TRPC1(1: 1500年,Abcam) TRPC4(1: 600年,Abcam) TRPC6(1: 1500年,Abcam),伯灵顿(1:1000年,Abcam) caspase-3(1: 1000年,细胞信号),聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP)(1: 1000年,细胞信号)、bcl - 2蛋白的表达(1:200年,Abcam)磷酸化(p) -Smad3(1: 1000年,细胞信号),p-Smad1/5(1: 1000年,细胞信号),骨形成蛋白- 2 (BMP)(1: 5000年,Abcam)、转化生长因子(TGF)β(1:500年,Abcam),低氧诱导因子(HIF -) 1α(1:750年,Abcam)、血管内皮生长因子(VEGF)(1: 1000年,Abcam), ku - 70(1: 1000年,Abcam)和肌动蛋白(1:10000年,Chemicon)]在室温下1小时。辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白免疫球蛋白g(1: 2000,细胞信号)作为第二抗体用于在室温下一个小时。在一小时内洗过程进行了八次,和免疫反应性的乐队被可视化增强化学发光(发射极耦合逻辑;Amersham生物科学)和暴露于以下L电影(柯达)。为了量化,发射极耦合逻辑信号被数字化的使用进行软件(UVP)。

2.8。量化的肺泡囊、拥挤的得分和小动脉的Muscularization在肺实质

左肺标本所有动物在嵌入之前缓冲福尔马林固定在10%石蜡和切割5点μ光显微镜分析。苏木精和伊红染色(H & E)来确定执行肺泡囊的数量根据我们最近的研究(34盲目的方式。分析了三个肺部分从每个鼠标和三个随机选择大功率领域(HPFs分区)(100 x)在每个部分检查。肺泡囊的数量为每个动物被记录。/高通滤波器的平均数量为每个动物是由所有数字的总和除以9。

拥挤区域的百分比(定义为隔膜厚度与肺泡部分或彻底崩溃)在肺实质决心在盲目中使用H & E染色时装和得分如下:0 =没有检测到拥挤的区域;1 = <拥挤区域的15%;2 = 15 - 25%的拥挤的区域;3 = 25 - 50%的拥挤的区域;4 =拥挤地区的50 - 75%;5 = > 75% - -100%的拥挤区域/ /大功率领域(100 x)。程序和协议是基于我们的最新报告(33]。

详细的程序和协议来确定肺小动脉的muscularization(即。、血管重建索引)是我们的最新报告(详细描述34通过最少的改动)。简单地说,三个肺小动脉的厚度进行测量。Muscularization动脉内侧层的肺实质定义为平均血管壁厚度大于40%的腔直径的容器直径> 30μm。小动脉的直径和壁厚的测量是通过使用Image-J软件(NIH,马里兰州,美国)。

2.9。Immunofluorescent(如果)研究

如果检查的程序和协议是根据我们最近的研究(37]。考试的短暂,如果染色进行磷酸化的组蛋白变体H2AX (γ-H2AX), ki - 67、TRPC1 HIF-1, ku - 70,简单使用各自的主要抗体和抗体被用作控制无关。三个部分每个老鼠的肺标本进行了分析。量化,三个随机选择HPFs分区(如果研究×200)每节进行分析。/高通滤波器的平均数量为每个动物是由所有数字的总和除以9。HF-based评分系统是采用半定量的分析这些生物标志物在肺部阳性细胞的比例在盲评(分数的积极染色细胞γ-H2AX ki - 67, TRPC1、HIF-1和ku - 70: 0 =没有污点%;1 = < 15%;2 = 15 ~ 25%;3 = 25 ~ 50%;4 = 50 ~ 75%;5 = > 75% - -100% / /高通滤波器在PA或肺实质)。

2.10。实时定量PCR分析mRNA表达在肺组织和右心室

实时聚合酶链反应(PCR)进行了使用LighCycler TaqMan大师(罗氏)在一个毛细管为单个组件浓度根据制造商的指导方针。正向和反向引物(表1)每个设计不同的目标基因的外显子序列,消除放大基因组DNA的可能性。一个积极的结果是由确定的阈值周期值记者染料发射出现以上背景。如果没有检测到的荧光信号在55周期,样品被认为是消极的。

2.11。统计分析

定量数据表示为±SD方法。统计分析是充分由方差分析其次是Bonferroni事后多重比较测试。使用SAS统计软件统计分析了Windows 8.2版本(SAS研究所,卡里,NC)。一个概率值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。试点研究在体外和在活的有机体内

右心室血压(RVSP),肺动脉收缩压的一个间接指标(PASP) 14天,缺氧组明显高于正常对照组(图1 (c))。这一发现表明,小鼠低氧诱导PAH模型被成功创建。免疫印迹分析主要主动脉SMC文化(图1(一))表明,TRPC1的蛋白表达显著减弱后siRNA-TRPC1 (20 nM)治疗(图1 (b))表明该方法是可行的表达式的推倒TRPC1主动脉smc。

Immunofluorescent微观研究表明,EGFP表达在alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma)积极染色细胞(图1 (e)(即)。,the pulmonary arteriolar smooth muscle cells (PASMCs)]. In addition, Western blot also demonstrated that EGFP was expressed in the pSuper-EGFP-transfected lungs with a dosage-dependent manner (Figure1 (d))。

3.2。三组的基线特征低氧诱导PAH后28天

最后体重没有三组之间的差异。然而,血红蛋白和红细胞计数明显高于在PAH动物(组2)和那些接受siRNA-TRPC1(组3)比虚假的控制(组1),但是这两个参数组2和3之间的相似(表2)。此外,左心室收缩压,收缩期动脉血压的一个间接指标,三组之间的相似。另一方面,右心室收缩压(PASP的指标)明显高于未经处理的多环芳烃组(组2)比正常对照组(组1)和siRNA-treated组(组3)和3组显著高于1组(表2)。

总值解剖结果显示,总心脏重量无显著差异在三组。然而,RV重量和肺总重量在2组明显高于在组1和3,但未指出后者两组之间差异(表2)。此外,RV-to-total心脏重量比和总肺重量显著高于2比1组和3组,但两个参数组1和3之间的相似。

3.3。肺组织病理学变化实质低氧诱导PAH后28天

H & E染色(数字2(一)-2(C))显示肺泡囊的数量显著降低2比1组和3组,3组显著低于在组1(图2(D))。相反,拥挤的分数显示明显相反的模式相比,肺泡囊的数量(图中三组2(E))。同样,muscularized肺小动脉的数量显示一个相同的模式与拥挤的分数在所有组(图2(F))。此外,免疫组织化学染色显示,在肺小动脉的数量的差异实质显示一个模式类似于肺泡囊的数量在三组(数字2(G) -2(J))。

3.4。结果Immunofluorescent(如果)肺实质的染色和肺动脉低氧诱导PAH后28天

如果染色显示的数量γ-H2AX +细胞内侧层大PA和肺实质(即。,extra-PA), an index of DNA damage, was significantly higher in group 2 than that in groups 1 and 3 and higher in group 3 than that in group 1 (Figure3)。此外,如果染色ki - 67 +细胞(即。,染色K-i67和两倍α光滑的肌肉肌动蛋白)(数据4(一)- - - - - -4 (d))量化SMC增殖在内侧层大PA显示模式相似γ-H2AX +细胞在三组。此外,如果确定TRPC1(即染色。TRPC1、双染色和α光滑的肌肉肌动蛋白)(数据4 (e)- - - - - -4 (h))的内侧层大PA显示流行TRPC1 +细胞,低氧生物标志物指数,类似的γ-H2AX +细胞在三组。

此外,相同的半定量的方法表明,肺HIF-1的患病率α+细胞(数据5(一个)- - - - - -5 (d)),其他低氧生物标记和ku - 70 +细胞(数字5 (e)- - - - - -5 (h)),索引的DNA修复nonhomologous结束加入通路在内侧层大爸爸,是类似于TRPC1 +细胞在三组。此外,如果房车心肌细胞的染色表明,肌节长度显著降低2组相比,在组1和3和显著降低组3组1(图6)。这些发现与肥厚性房车在2组心肌细胞表现出一个更严格的收缩,因此,观察显示缩短距离相比其他组。

3.5。免疫印迹分析肺组织缺氧治疗后28天

蛋白质的表达TRPC1、TRPC4 TRPC6, HIF-1α,四个敏感的低氧生物标记,明显调节3组,进一步调节的价格相比组2组1(数字7(一)- - - - - -7 (d))。另一方面,VEGF蛋白表达,血管内皮细胞分化的因素至关重要,明显高于3比1组和2组,2组显著高于组1(图7 (e))。这一发现意味着消耗siRNA TRPC1蛋白质表达的是特定的。

蛋白质的表达TGF -βSmad3,纤维化的两个指标,显著高于2比1组和3组,3组显著高于组1(数字8(一个)和8 (b))。相比之下,蛋白质的表达BMP-2和Smad1/5(数字8 (c)和8 (d)),两个antifibrotic生物标记,显示了相反的模式相比,TGF -β和Smad3三组。

蛋白质的表达(即分开。,一个ctive form) caspase-3 and PARP, two indicators of apoptosis, were significantly increased in group 2 than those in groups 1 and 3 and significantly higher in group 3 than those in group 1 (Figures9(一个)和9 (b))。此外,线粒体的蛋白表达伯灵顿,凋亡生物标志物的另一个指标,显示一个模式类似于裂解caspase-3和PARP三组(图9 (c))。此外,ku - 70蛋白表达的肺实质是一致的结果如果染色细胞生物标志物在所有组(图9 (d))。

3.6。右心室的改变和肺低氧诱导后28天PAH基因表达式

心脏肥大被公认为一个开关α-β肌球蛋白重链(MHC) mRNA表达(即。,胎儿基因的激活程序)。当前研究的结果表明,该mRNA的表达βmhc在房车心肌特别是高在2比1组和3组,3组显著高于组1(图10 ())。另一方面,αmhc在房车心肌表达显著逆转的方式相比的βmhc(图中三组10 (b))。mRNA的表达caspase-3(图10 (c))和伯灵顿(图10 (d)在房车心肌细胞凋亡的两个指标,显示模式相似βmhc在所有组。

肺的mRNA表达内皮一氧化氮合酶(以挪士),内皮功能保护,指数非常高在1比1组和3组,3组显著高于组1(图10 (e))。一致,mRNA的表达内皮素- 1 (ET),索引的内皮细胞功能障碍,明显表现出相反的模式比以挪士(图10 (f))。此外,肺mRNA的表达TNF -α(图10 (g))和MMP-9(图10 (h)),两个炎症生物标记,明显高于2比1组和3组,3组显著高于组1。

4所示。讨论

这项研究,调查的功效Lipofectamine交付siRNA-TRPC1抑制低氧诱导的多环芳烃,取得了一些引人注目的影响。首先,Lipofectamine交付pEGFP质粒DNA PASMCs是成功的。第二,RVSP TRPC1表达PASMCs缺氧治疗后显著增加了28天。第三,成功交付siRNA-TRPC1通过气管内的喷雾显著降低肺的表情TRPC1 PASMCs和肺组织以及RVSP。

尽管virus-mediated基因转移用于实验和临床研究22- - - - - -24),安全性和有效性仍有问题(25,26]。开发交付系统没有短期和长期的副作用,因此,在临床转化研究是至关重要的,其后续的临床应用。最近研究表明,Lipofectamine转染系统优于virus-mediated技术安全为目的的研究对象(27,30.]。本研究中的一个重要的发现是,Lipofectamine发现成功交付pSuper EGFP培养主动脉smc在体外和肺组织在活的有机体内。重要性是Lipofectamine交付siRNA-TPRC1寡核苷酸进入培养主动脉smc成功抑制TPRC1的蛋白表达。

以前的研究已经表明缺氧诱导的扩散PASMCs在发病机制中起主要作用的多环芳烃(21]。此外,亚科TRPCs(即。,TRPC1 to TRPC6) have been demonstrated to be upregulated in mice exposed to hypoxia [21,38]。本研究主要发现之一的表情TRPCs(包括TRPC1、TRPC4和TRPC6)和HIF-1α在hypoxia-treated大大增强动物在正常对照组相比。因此,我们的研究结果强调的先前的研究[21,38]。本研究最重要的发现是,RVSP非常高hypoxia-treated动物与正常对照组相比,显著降低hypoxia-treated动物siRNA-TRPC1治疗。一个特别重要的发现是,TRPC1 upregulations和HIF-1α在hypoxia-treated动物被明显抑制缺氧动物siRNA-TRPC1治疗后。此外,muscularized PA被发现的数量明显减少hypoxia-treated小鼠siRNA-downregulated TRPC1 hypoxia-treated动物相比没有治疗。因此,我们的研究结果可能突出的治疗潜力siRNA-TRPC1 PAH患者治疗的不良反应传统的药物疗法。

此外,本研究的结果发现,不仅TRPC1的蛋白表达也TRPC4的蛋白质表达和TRPC6在肺实质被siRNA-TRPC1治疗显著抑制。抑制蛋白质的表达的原因TRPC4和核治疗后TRPC6在这个实验设置尚不清楚。我们建议,结果可能是二级考评的降低血压和改善缺氧治疗后,反过来,导致PASMC增殖的抑制,最终抑制TRPC4和TRPC6表达式。

本研究的另一个重要的发现是,组织病理学分析表明显著减少肺泡囊的数量,特别是高拥挤在hypoxia-treated动物的肺实质相比,那些虚假的控制。然而,这些现象在hypoxia-treated显著抑制动物siRNA-TRPC1治疗后。此外,肺纤维化(TGF -β,Smad3)和凋亡(裂解caspase-3 PARP,伯灵顿)生物标志物也显著增加在动物慢性缺氧,但显著降低了hypoxia-treated动物与核治疗。此外,Ku70 +细胞的数量在内侧层PA,平滑肌增殖的指标,显著降低hypoxia-treated动物核治疗相比,那些没有。此外,antifibrotic的表达(BMP-2 Smad1/5)生物标志物在肺实质明显高于hypoxia-treated动物核比那些没有治疗。使用monocrotaline-induced PAH鼠模型,我们先前的研究已经证明了一致的组织病理学结果和表情在肺实质纤维化和凋亡的生物标记。因此,研究结果与西地那非治疗后显著提高(34]或骨骨髓来源的内皮祖细胞(33]。因此,我们的研究结果与以前的研究的(33,34]。至少部分,重要的是,这些可以解释低氧诱导的衰减PAH siRNA-TRPC1治疗后小鼠模型。

先前的研究已经表明,VEGF是一个重要的维护和差异化因素对血管内皮细胞(39),也是一个重要因素抑制发展的多环芳烃在实验模型(39,40]。一个有趣的发现在当前的研究中,VEGF蛋白表达显著增强在hypoxia-treated动物和进一步增强核治疗后相比,正常对照组。我们建议至少有两个原因可以解释这一发现。首先,VEGF的upregulation hypoxia-treated动物可能压力刺激的结果(即。缺氧条件反射),增强这个生物标志物内皮细胞的生成和smc。这可能是类似于HIF-1的感应α在缺氧条件下表达内皮细胞和smc。第二,进一步增强VEGF表达siRNA-TRPC1-treated动物可能是由于对内皮损伤siRNA-TRPC1提供的保护,从而保护内皮细胞的完整性,反过来,分泌更多的VEGF在目前的实验设置为自己的保护。综上所述,我们的研究结果,除了被那些从先前的研究支持39,40),也建议hypoxia-stimulated VEGF的作用生产在保护肺血管内皮细胞与多环芳烃。此外,我们的研究结果不仅意味着核治疗后明显降低RVSP可能部分由于VEGF增加生产,但也表明特异性核的设置。

另一个重要的发现是,在当前的研究γ-H2AX, DNA损伤生物标志物,Ki67 DNA修复DNA损伤后活动,特别是增加后的动物慢性低氧诱导多环芳烃和siRNA-TRPC1治疗后明显抑制。这些发现,除了整合与组织病理学表现,也可以部分地支持低氧诱导的显著减少多环芳烃在小干扰rna治疗动物相比。

有趣的是,肺mRNA的表达TNF -α、MMP-9 ET-1被发现显著增加,而以挪士的mRNA表达减少hypoxia-treated动物在正常对照组相比。这些变化,核治疗后明显逆转。的upregulations肺实质炎症和内皮功能障碍的基因表达也被确认在老鼠monocrotaline-induced PAH和减毒后西地那非或内皮祖细胞治疗在先前的研究33,34,41]。我们的发现,除了加强那些从先前的调查33,34,41),再次说明了抑制siRNA-TRPC1治疗后肺损伤和保护心脏功能通过独特的组织病理学发现肺实质和衰减hypoxia-related RVSP海拔在小鼠模型的多环芳烃。

有趣的是,伯灵顿的mRNA表达和caspase-3房车心肌均明显增加,而bcl - 2显著低于hypoxia-treated动物与正常对照组相比,明显逆转hypoxia-treated动物核治疗后。一个独特的发现在RV心肌βmhc基因表达明显增加,而αmhc基因表达显著低于动物暴露于慢性缺氧。此外,两个观察之间的距离明显缩短hypoxia-treated组比其他组。迷人地,心脏肥大的特点是一个开关αmhc,β(即mhc mRNA表达。,reactivation of fetal gene program) [42,43]。通过这种方式,我们的发现与之前的研究相一致42,43]。再一次,这些基因的表达(即,αmhc和βmhc)和两个观察之间的距离明显逆转后缺氧动物核管理。这些发现进一步支持那些先前的研究[40,41),阐明机制改善RVSP hypoxia-treated老鼠。

5。研究的局限性

这项研究有一定的局限性。首先,尽管短期结果的研究期间只有28天承诺在当前的研究中,长期的结果仍然是不确定的。其次,本研究没有提供的信息不同剂量的疗效和安全性。因此,多个剂量是否会比单剂量治疗hypoxia-treatment动物是未知的。第三,由于技术困难,本研究没有分离蛋白质的定量表达式的肺动脉TRPC1、TRPC4, TRPC6。最后,先前实验和临床观察性研究强调PAH的病因和机制是多因素疾病,极其复杂1- - - - - -5,33,34]。在目前的研究中,尽管广泛的工作已经完成,包括molecular-cellular DNA损伤、细胞凋亡、炎症、肺纤维化、内皮功能障碍、多环芳烃的确切机制仍然不确定。拟议的机制进行了总结在图11基于我们的研究结果。

6。结论

这项研究的结果表明,RVSP TRPCs的表情明显提高低氧诱导的小鼠模型中多环芳烃和siRNA-TRPC1治疗后明显抑制。我们的发现可能与潜在的临床应用提供一种治疗选择的治疗患者多环芳烃耐火材料与传统方案。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

所有作者阅读和批准最终的论文。Cheuk-Kwan太阳,Yen-Yi甄、Hung-I Lu和Jiunn-Jye张文雄设计实验,进行动物实验,起草。Pei-Hsun Sung Li-Teh Chang Tzu-Hsien蔡,莎拉·蔡,Hsueh-Wen Chang负责实验室分析和故障排除。Yung-Lung Cheuk-Kwan Fan-Yen Lee Sun Chen和Hon-Kan Yip参与细化实验协议和协调,帮助起草。Cheuk-Kwan太阳和Yen-Yi甄的贡献同样这项工作。

承认

这项研究是由美国国家科学委员会提供的支持的一个项目,台湾(批准号nsc - 100 - 2314 - b - 650 - 001)。

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