与晚期的共生，但不早，人类内皮祖细胞调节IL-1βTHP-1单核细胞旁分泌的表达

摘要

内皮祖细胞（EPCs）已用于治疗缺血性心脏病的临床试验。在组织缺血期间，单核细胞浸润在炎症、血管生成和组织修复中起着重要作用。了解内皮祖细胞与单核细胞之间的相互作用非常重要。本研究采用人EPC/THP-1单核细胞共培养系统检测EPC对IL-1的影响α，IL-1β和tnf-αTHP-1细胞的表达。晚而不是早，EPCs上调IL-1β在mRNA和蛋白质水平的表达。相比之下，既不是早期也不是晚期影响IL-1α或肿瘤坏死因子-α表达式。与人脐静脉内皮细胞共培养未改变IL-1β表达式。已经证明了整合素的激活β2在人中性粒细胞中增加IL-1β合成;然而整合在一起β2与IL-1无关βTHP-1细胞的表达。添加后期EPC条件培养基至THP-1细胞培养导致IL-1的适度增加β晚期EPCs上调IL-1β部分通过旁分泌途径表达。il - 1β是一个重要的炎症介质，已被证明促进EPC功能。因此，我们的数据表明，已故EPC可以通过与单核细胞相互作用来发挥自我增强效果，并且EPC可以通过调节IL-1来调节炎症反应β在单核细胞表达。

1.导言

内皮祖细胞(EPCs)，最早由Asahara等人描述[1，代表一个来自循环CD34阳性或CD34和KDR/VEGF受体-2 (KDR/VEGFR2)双阳性单核细胞的异质性细胞群。它们具有分化为内皮细胞的能力，并已在缺血动物模型中显示与新形成的血管结合。也有研究表明CD133阳性细胞具有内皮祖细胞的能力[2那3.]．广泛的体外和体内研究已经证实EPCs在血管修复和再生中发挥重要作用[4.-6.]并且已经完成了几种临床试验，评估了EPC治疗对患有缺血性心脏病的患者的疗效[7.-10.]．

目前，获得EPC的最常见方案是通过内皮细胞（EC）特异性介质的外周血衍生单核细胞（PBMNC）的培养[11.]．该方法已鉴定出2个不同的EPCs群体，即早期和晚期EPCs [12.]．早期EPCs呈典型的纺锤体样形态，经pbnc培养4-7天后产生。它们几乎不具有增殖能力，但能大量产生血管生成生长因子，如VEGF、肝细胞生长因子(HGF)和IL-8。PBMNCs培养2-4周后出现鹅卵石状晚期EPCs，并表现出较高的增殖率。早期和晚期EPCs都被证明有助于血管修复和再生，尽管它们的血管生成特性不同。早期EPCs表现出显著的旁分泌效应，而晚期EPCs以最小的血管生成因子的分泌进入血管[12.那13.]．

单核细胞浸润在炎症、血管生成和组织修复中起着重要作用，并可能影响组织缺血的病理生理过程。在缺血区积聚后，单核细胞被激活并产生细胞因子来调节疾病进程，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-1（IL-1α和IL-1β)组织缺血还导致内皮祖细胞从骨髓动员进入循环。循环中的内皮祖细胞随后回到缺血部位，通过新生血管帮助组织修复[5.那14.-17.]这些内皮祖细胞可能与缺血区浸润的单核细胞相互作用-α，转化生长因子-β（TGF-β)，而白细胞介素(il)被认为是组织缺血的主要介质[18.那19.]，其中TNF-α而IL-1被认为是最重要的[19.]．鉴于人们对使用EPCs治疗缺血性心脏病的持续兴趣，了解单核细胞和EPCs之间的相互作用很重要。因此，本研究旨在检测EPCs对IL-1单核细胞表达的影响α，IL-1β和tnf-α，使用人体EPC / THP-1单核细胞共培养系统。

2.材料和方法

2．1.人类EPC隔离

参与研究的知情书面同意来自所有志愿者。共招募10名健康个体(男性5名，女性5名，平均年龄年）。涉及人类样品的所有协议由多伦多大学圣迈克尔医院的研究伦理委员会批准，按照世界医学会（赫尔辛基宣言）的道德规范。如前面所述，通过Ficoll梯度离心从健康志愿者分离PBMNC [20.]．PBMNC以密度镀层 细胞/厘米² in human fibronectin-coated flasks and cultured in endothelial growth medium supplemented with VEGF, basic fibroblast growth factor, and insulin-like growth factor-1 (EGM-2 medium, Lonza). After 3 days, nonadherent cells were removed and fresh culture medium was supplied. At day 7, cells were considered early EPCs. To obtain late EPCs, cells were maintained in EGM-2 medium with change of medium every other day until sporadic EPC colonies began to form. These colonies were then detached with 0.05% trypsin/1 mM EDTA (Life Technologies), pooled, and expanded. At day 28, cells were considered late EPCs.

２.２.细胞培养

按照供应商的建议，将人THP-1单核细胞（ATCC）保存在含有10%FBS的RPMI 1640培养基中。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs，Lonza）保存在含有10%FBS的内皮基础培养基EBM-2（Lonza）中。

２.３.内皮祖细胞的特征

如前所述，早期内皮祖细胞的特征是摄取荧光染料Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil Ac LDL）和结合FITC标记的UEA凝集素（FITC UEA凝集素）[11.那21.]．通过蛋白质印迹检查EC蛋白标志物的表达，即KDR / VEGFR2，Tie2和eNOS，检查晚期EPC。Western Blotting分析如下进行：100 μ.将1x Laemmli缓冲液中的G晚期EPC蛋白煮沸5分钟，用SDS-PAGE分离，并将电转移到硝酸纤维素膜上。在含有5％脱脂牛奶的TBS-T缓冲液（50mM TrishCl，150mM NaCl，pH7.5,0.1％Tween-20）中封闭膜在室温下1小时，然后用嵌段稀释的第一抗体孵育2小时缓冲。第一抗体如下使用：抗人KDR / VEGFR2多克隆抗体（1：1000，Upstate）;抗人类Tie2多克隆抗体（1：1000，Santa Cruz）;和抗人类enos单克隆抗体（1：2000，BD Biosciences）。与第一抗体一起孵育后，用TBS-T缓冲液洗涤膜3次3次，然后用HRP缀合的抗小鼠或抗兔二抗孵育（Promega，稀释1：5000）1小时。如上用TBS-T缓冲液洗涤膜，并且通过ECL Western印迹检测试剂试剂盒（Amersham Biosciences），扫描和记录分子分析计划（Bio-rad Laboratories）。

２.４.THP-1单核细胞与人EPCs共培养

早期或晚期EPC用0.05％胰蛋白酶/ 1 mm EDTA分离并播种细胞/孔进入6孔板。24小时培养，使EPCs牢固地附着在平板上。PBS洗一次EPCs后，THP-1单核细胞( cells/well) were added. For all coculture and control culture experiments, RPMI 1640 medium with 10% FBS was used. Following culture for 24 hours, coculture conditioned medium (CM) with suspended THP-1 cells was transferred to a microtube followed by a centrifugation at 500 g for 5 minutes. The pelleted THP-1 cells were then used for total RNA extraction and the conditioned medium collected for detection of IL-1βELISA试剂盒（研发系统）的蛋白质。单独的THP-1细胞培养用作对照。进行类似的HUVEC / THP-1细胞的共蜂蜜，以检查HUVEC对IL-1基因表达的影响β。检查整合素β2在THP-1细胞中具有EPC调控晚期IL-1的作用β表达，将THP-1细胞用整体素预孵育β2块抗体（克隆TS1 / 18,10 μ.g/mL, BioLegend)孵育1小时后，加入晚期EPCs，按上述方法共培养。研究晚期EPCs是否调控IL-1β通过旁静脉途径的表达，将1ml晚期EPC CM加入到THP-1细胞培养物中，早期EPC CM用作对照。

2．5．总RNA提取

根据制造商的说明，使用miRNeasy微型试剂盒（Qiagen）从THP-1细胞中提取总RNA。简单地说，细胞颗粒用700%硫酸钠溶解 μ.L Qiazol裂解试剂和细胞裂解物混合200 μ.L氯仿，然后在12000℃下离心 rpm 15分钟。将含有RNA的水相转移到无核酸酶管中，并与1.5体积的100%乙醇混合。然后将样品通过RNeasy minispin柱。用RWT和RPE缓冲液洗涤后，用40%乙醇洗脱RNA μ.L含有无核酸酶的水并用分光光度计（Biorad Laboratories）量化。

2.6。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

使用OMNIScript RT试剂盒（QIAGEN）通过逆转录（RT）产生第一链cDNA。RT反应，总体积为20 μ.L，包含以下组件：1 μ.总RNA的g，2 μ.l为5 mm dntps，5 μ.l随机底漆（300ng / ml），2 μ.10x反应缓冲液，1μ.L逆转录酶(4个单位)，1μ.L RNase抑制剂（1单位）和无核酸酶DDH₂O(用于调节最终反应体积)。RT在37°C孵育1小时，然后在65°C灭活15分钟。对于实时PCR，总反应体积为20μ.l通过混合2实现 μ.L产品，10 μ.2倍SYBR Green PCR Master Mix的L，正反引物混合的200 nM，适量的无核酸酶ddH₂O.在下列阶段对7900 HT序列检测系统（Applied Biosysystem Inc.）进行实时PCR：阶段1：50℃，2分钟，第2阶段：95℃10分钟，第3阶段3：95°C为15秒，然后是62°C 1分钟。重复第3阶段40个循环。为每种反应设置了解离曲线以检查基因扩增的特异性。另外，为了消除基因组污染的检测，设计每个单独基因的引物被设计为跨越内含子。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内部对照和IL-1的相对mRNA水平α，IL-1β和tnf-α使用2定量为GAPDH标准化^-ΔΔct方法。引物序列如下:il - 1α（基因登录号：NM_000575.3），感测5′-CCTCATTGATCATCTGTCTCT-3′和反义5′-CTCAACCGTCTTCTTCAGGA-3′；il - 1β(基因登录号:NM_000576)，5“-AACCTCTTCGAGGCACAAG-3”和感觉反义5'-gtttagggccatcagcttca-3';TNF-α（基因登录号：NM_000594），感觉5'-cccaggcagtcagatcatcttc-3'和反义5'-AGCTGCCCCTCAGCTTGA-3';GAPDH（基因登录号：X02231），感测5′-CTCTAGGCTGCAAGGTCAT-3′和反义5'-gagatccaccacccctgttgctgta-3'。

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA进行了测量IL-1β蛋白质水平在EPC / THP-1细胞共培养条件培养基中。高灵敏度人体IL-1β最低可检测剂量<0.1的ELISA试剂盒 pg/mL来自研发系统。ELISA程序按照制造商的说明完成。

2.8。统计分析

数据表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。统计显著性采用Student分析法确定T.以及;被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．人EPCs的分离与鉴定

PBMNCs在内皮选择性培养基EGM-2中培养7天后出现半流畅纺锤形早期EPCs(图)1（a）)．大约在第2周，开始出现零星的细胞集落(图1（b）)．用胰蛋白酶/EDTA分离这些菌落，并复制以进行细胞扩增。鹅卵石状晚期EPCs增殖迅速，而纺锤形早期EPCs在第4周几乎完全消失(图)1（c）)．流式细胞术分析证明了<1％的早期EPC表达了CD11B，单核细胞/巨噬细胞标记物（未示出的数据）。吸收稀释剂的抗折叠和粘合剂的结合表明，超过80％的早期EPC是DIL-AC-LDL / FITC-UEA-凝集素双阳性（图1（d），吸收dilac - ldl的细胞呈红色。数字1 (e)，FITC-UEA凝集素阳性细胞呈绿色。数字1 (f)那1（d）， 和1 (e)合并，橙色是双积极的）。Western Blotting分析表明，已故EPCS产生了一组内皮蛋白标志物，即KDR / VEGFR2，TIE2和ENOS（图1 (g)那1 (h)， 和1(我)，resp。）与Huvecs的EPCS相对较低的Tie2水平相对较低，而其他2个蛋白质水平与在Huvecs中检测到的其他2份相当。

3.2。UL-1的上调βTHP-1单核细胞与晚期人EPCs共培养的表达

检查EPCS调节IL-1α，IL-1β和tnf-α单核细胞、人THP-1单核细胞与早期或晚期人内皮祖细胞共培养的基因表达α，IL-1β和tnf-α在THP-1细胞中，通过实时RT-PCR和IL-1测定β，通过高敏感性ELISA试剂盒（研发系统）进一步测量培养条件培养基中的蛋白质。结果表明IL-1没有显着差异β单独培养的THP细胞与THP-1细胞之间的mRNA水平与早期EPCS共培养（图2（a）)．然而，与后期EPC的共生导致IL-1的显着增加βmRNA水平（），与单独培养的THP-1细胞相比（那那， 数字2（a）)．此外，增加了IL-1βIL-1升高反映了mRNA水平β，通过ELISA试剂盒测定的共培养条件培养基中的蛋白质水平（ 单独培养THP-1细胞与对照组的pg/mL pg/mL for THP-1 cells cocultured with late EPCs, Figure2 (b)那那).未观察到IL-1的显著变化α或肿瘤坏死因子-αTHP-1细胞与早期或晚期EPCs共培养后的mRNA水平(图)2 (c)和2 (d))．我们进一步检查了终端差异化的Huvecs与晚期EPC的效果类似，发现与Huvecs的共生没有导致IL-1中的重要交替βTHP-1细胞中mRNA水平（图2 (e))．

3.3。UL-1的上调β晚期内皮祖细胞部分通过旁分泌方式在THP-1细胞中表达

后期EPCS上调IL-1的机制β进一步探讨表达。在THP-1细胞培养中添加晚期EPC CM(以早期EPC CM为对照)导致IL-1适度增加βmRNA水平（）低于THP-1细胞/晚期EPC共培育（）但显着高于IL-1β用早期EPC CM治疗的THP-1细胞mRNA水平（那， 数字3(一个))，提示晚期EPCs具有旁分泌作用。已经证明了整合素的激活β2中嗜中性粒细胞增强IL-1β表达式。THP-1细胞产生整合素β2，我们检查了整合素β2参与晚期EPC调控的IL-1β表达式。用整体素预孵育THP-1细胞β2阻断抗体不能消除IL-1的晚期EPC效应β信使rna生产(图3 (b))．

4。讨论

在本研究中，我们检测了EPCs对IL-1的影响α，IL-1β和肿瘤坏死因子-α使用人EPC和单核细胞的共培养细胞的单核细胞中的表达。人类早期和晚期产卵通过内皮选择性培养基EGM-2中的PBMNC培养采购。稀释性的稀释度和Fitc-uea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-凝集素的增生和Fitc-uea-lea-lea-percl-uea-lea-凝集素的双阳性，这与先前公布的数据一致[11.那21.]．晚期EPC表达了重要的内皮蛋白标记，即KDR / VEGFR2，TiE2和eNOS，如蛋白质印迹所检测到的。当通过早期EPCS与早期EPCS共有聚集的THP-1单核细胞时，在THP-1细胞中没有3个细胞因子表达。相比之下，已故的EPCs显着上调IL-1β在mRNA和蛋白水平表达，但不影响IL-1α或肿瘤坏死因子-α表达式。IL-1的ELISA结果α或肿瘤坏死因子-α蛋白分析(数据未显示)与mRNA数据一致。作为il - 1β通过在后期EPCS（未示出的数据）中实时RT-PCR勉强测量mRNA，可能污染IL-1的可能性β来自晚期内皮祖细胞的mRNA被排除在共培养系统中。由于晚期内皮祖细胞表现出与体细胞内皮祖细胞相似的形态、表面蛋白标记物表达和增殖能力，我们检测内皮祖细胞是否对IL-1有影响β表达式。然而，与HUVECs共培养没有导致IL-1的变化βTHP-1细胞的表达。在这方面，晚期EPCs与HUVECs不同。

EPCS上调IL-1的机制β进一步研究THP-1细胞的表达。Walzog等人观察到整合素的激活β2在人性化学粒细胞中导致IL-1的增强β综合[22.]．它已详细记录了THP-1细胞表达整合素β2 [23.那24.]．我们探讨了整合素β2参与了IL-1的调节βTHP-1细胞的表达。用整体素预孵育THP-1细胞β2阻断抗体不能消除晚期EPCs对IL-1的影响βMRNA生产，表明IL-1的调节β后期EPCS的THP-1细胞中的表达与整合素无关β2.当EPC CM晚期添加到THP-1细胞培养物中时，IL-1的适度增加3倍β与早期EPC cm处理或未处理的细胞相比，检测mRNA水平，表明晚期EPCs上调IL-1β部分生产通过旁静脉机制。

而被认为是一种重要的炎症介质[25.]，IL-1β也被证明在血管生成和EPC功能调节中发挥重要作用[26.-29.]．使用Matrigel Plug测定，Voronov等人。观察到塞子的血管化存在于野生型小鼠中，但在IL-1中缺席β基因敲除小鼠(26.]，暗示IL-1的作用β在血管生成。体外研究表明，用IL-1治疗小鼠EPCsβ增加EPC号码和IL-1β与Matrigel涂层的菜肴中的培养后，与非生成的细胞相比，经过处理的EPC在培养后的培养基中形成显着更高数量的血管状结构[27.]．Yang等人观察到，IL-1除了刺激EPC增殖外β促进EPC迁移和粘附，并上调EPCs中VEGF-A的产生[28.]．Amano等利用缺血后肢小鼠模型报道了IL-1中循环EPCs的数量β- / - 小鼠显着低于后肢缺血后野生型凋落物。IL-1的缺血性肌肉中的EPC号也显着降低β- / - 小鼠[29.，表明IL-1的作用至关重要β在缺血诱导的EPC动员和归巢中。增加IL-1β因此，在本研究中报道的迟交后期EPCS诱导的单核细胞的生产可以形成EPC的自我放大回路，这可能代表尚未认定的内源性机制，可改善组织修复和再生所需的EPC招生和功能。

结论

总之，在人EPC/THP-1单核细胞共培养系统中，晚期而非早期EPCs上调IL-1β在THP-1细胞中表达，部分通过旁分泌途径。il - 1β是一种重要的炎症介质，也已被证明促进EPCS增殖，迁移和粘附性。因此，我们的数据表明EPC可以通过与单核细胞相互作用来施加自我增强效果，并且EPC也可以通过调节IL-1来调节炎症反应β在单核细胞表达。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

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