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SCI.据/journal-id>

干细胞国际据/journal-title>

1687-9678.据/issn> 1687-9666X.据/issn>

印度发布公司据/publisher-name>

859643据/article-id> 10.1155 / 2013/859643据/article-id> 859643据/article-id>

研究文章据/subject>

与晚期的共生，但不早，人类内皮祖细胞调节IL-1据bold> β据/italic> THP-1单核细胞旁分泌的表达据/article-title>

http://orcid.org/0000-0002-0615-7055.据/contrib-id> 张据/surname> 邱旺据/given-names>

http://orcid.org/0000-0002-7579-9692据/contrib-id> kandic.据/surname> 伊万纳据/given-names>

巴菲尔德据/surname> 杰弗里T.据/given-names> Kutryk据/surname> 迈克尔J.据/given-names> 柯克据/surname> 马克D。据/given-names>

的心脏病据/addr-line> 凯恩研究中心，李嘉盛知识研究所据/addr-line> 圣迈克尔医院据/addr-line> 多伦多大学据/addr-line> 邦德大楼7084室据/addr-line> 30债券街，多伦多，据/addr-line> 加拿大据/country> M5B 1W8.据/addr-line> Utoronto.ca.据/ext-link>

2013据/year>

9.据/day> 12.据/month> 2013据/year>

2013据/volume> 09.据/day> 07.据/month> 2013据/year> 07.据/day> 11.据/month> 2013据/year> 22.据/day> 11.据/month> 2013据/year>

这是在Creative Commons归因许可下分发的开放式访问文章，其允许在任何介质中不受限制地使用，分发和再现，只要正确引用了原始工作。据/license-p>

内皮祖细胞(EPCs)已在临床试验中用于治疗缺血性心脏病。单核细胞浸润在组织缺血时的炎症、血管生成和组织修复中发挥着重要作用。了解内皮祖细胞与单核细胞之间的相互作用是很重要的。本研究采用人EPC/THP-1单核细胞共培养系统检测EPC对IL-1的影响据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>和tnf-据italic> α.据/italic>在THP-1细胞中的表达。迟到，但不早，EPCS上调IL-1据italic> β据/italic>在mRNA和蛋白水平上表达。相反，早期和晚期EPCs均不影响IL-1据italic> α.据/italic>或tnf-据italic> α.据/italic>表达式。与人脐静脉内皮细胞的共生没有改变IL-1据italic> β据/italic>表达式。已经证明了整合素的激活据italic> β据/italic>2在人性嗜中性粒细胞增强IL-1据italic> β据/italic>合成;然而整合在一起据italic> β据/italic>2没有涉及IL-1据italic> β据/italic>在THP-1细胞中的表达。添加后期EPC条件培养基至THP-1细胞培养导致IL-1的适度增加据italic> β据/italic>晚期EPCs上调IL-1据italic> β据/italic>部分通过旁分泌途径表达。IL-1据italic> β据/italic>是一个重要的炎症介质，已被证明促进EPC功能。因此，我们的数据表明，已故EPC可以通过与单核细胞相互作用来发挥自我增强效果，并且EPC可以通过调节IL-1来调节炎症反应据italic> β据/italic>单核细胞中的表达。据/p> 1.介绍据/title> <p>内皮祖细胞(EPCs)，最早由Asahara等人描述[据xref ref-type="bibr" rid="B1"> 1据/xref>，代表一个来自循环CD34阳性或CD34和KDR/VEGF受体-2 (KDR/VEGFR2)双阳性单核细胞的异质性细胞群。它们具有分化为内皮细胞的能力，并已在缺血动物模型中显示与新形成的血管结合。也有研究表明CD133阳性细胞具有内皮祖细胞的能力[据xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>]．广泛的体外和体内研究已经证实EPCs在血管修复和再生中发挥重要作用[据xref ref-type="bibr" rid="B4"> 4.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>]，并且已经完成了一些评估EPC治疗缺血性心脏病患者疗效的临床试验[据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10.据/xref>]．据/p> <p>目前，获得EPC的最常见方案是通过内皮细胞（EC）特异性介质的外周血衍生单核细胞（PBMNC）的培养[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>]．该方法导致鉴定了2个异常的EPC种群，即早期和晚期EPC [据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>]．早期EPCs呈典型的纺锤体样形态，经pbnc培养4-7天后产生。它们几乎不具有增殖能力，但能大量产生血管生成生长因子，如VEGF、肝细胞生长因子(HGF)和IL-8。PBMNCs培养2-4周后出现鹅卵石状晚期EPCs，并表现出较高的增殖率。早期和晚期EPCs都被证明有助于血管修复和再生，尽管它们的血管生成特性不同。早期EPCs表现出显著的旁分泌效应，而晚期EPCs以最小的血管生成因子的分泌进入血管[据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13.据/xref>]．据/p> <p>单核细胞浸润在炎症，血管生成和组织修复中起着重要作用，并且可能影响组织缺血所涉及的病理物理学过程。在缺血区积累后，激活单核细胞并产生细胞因子来调节疾病过程，包括肿瘤坏死因子-α-α（TNF-据italic> α.据/italic>）和IL-1（IL-1据italic> α.据/italic>和IL-1据italic> β据/italic>)．组织缺血还导致将EPC从骨髓传递到循环中。然后循环EPCS通过新血管形成辅助组织修复的缺血遗址[据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B14"> 14.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>]．这些EPC可以与缺血区中的浸润单核细胞相互作用。肿瘤坏死因子-据italic> α.据/italic>，转化生长因子-β（TGF-据italic> β据/italic>）和白细胞介素（ILS）被认为是组织缺血的主要介质[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>]，其中tnf-据italic> α.据/italic>和IL-1被认为是最重要的[据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>]．鉴于使用EPC治疗缺血性心脏病的持续兴趣，重要的是要了解单核细胞和EPC之间的相互作用。因此，进行该研究以检验EPC对IL-1单核细胞表达的影响据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>和tnf-据italic> α.据/italic>，使用人体EPC / THP-1单核细胞共培养系统。据/p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2。材料和方法据/title> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。人体EPC孤立据/title> <p>参与研究的知情书面同意来自所有志愿者。共招募10名健康个体(男性5名，女性5名，平均年龄据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mn> 38.9据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 7．8据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>年）。涉及人类样品的所有协议由多伦多大学圣迈克尔医院的研究伦理委员会批准，按照世界医学会（赫尔辛基宣言）的道德规范。如前面所述，通过Ficoll梯度离心从健康志愿者分离PBMNC [据xref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.据/xref>]．PBMNC以密度镀层据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mn> 0.75据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 6.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/厘米据sup>2据/sup>在人纤维连接素包被瓶中培养，并在含有VEGF、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1的内皮生长培养基(EGM-2培养基，Lonza)中培养。3天后，去除非贴壁细胞，并提供新鲜培养基。第7天，细胞被认为是早期EPCs。为了获得晚期EPCs，细胞维持在EGM-2培养基中，每隔一天更换培养基，直到散在的EPC菌落开始形成。然后用0.05%胰蛋白酶/ 1mm EDTA (Life Technologies)将这些菌落分离，合并并扩大。第28天，细胞被认为是晚期EPCs。据/p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>２.２.细胞培养据/title> <p>人体THP-1单核细胞（ATCC）在RPMI 1640培养基中维持，如供应商推荐的10％FBS。人脐静脉内皮细胞（HUVECS，LONZA）保持在含有10％FBS的内皮基础培养基EBM-2（LONZA）中。据/p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。EPC的特征据/title> <p>早期EPCs的特征是摄取荧光染料dill标记的乙酰化低密度脂蛋白(dilc - ac - ldl)和结合fitc标记的uea -凝集素(fitc - uea -凝集素)，如前所述[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21.据/xref>]．通过蛋白质印迹检查EC蛋白标志物的表达，即KDR / VEGFR2，Tie2和eNOS，检查晚期EPC。Western Blotting分析如下进行：100 据italic> μ.据/italic>将1x Laemmli缓冲液中的G晚期EPC蛋白煮沸5分钟，用SDS-PAGE分离，并将电转移到硝酸纤维素膜上。在含有5％脱脂牛奶的TBS-T缓冲液（50mM TrishCl，150mM NaCl，pH7.5,0.1％Tween-20）中封闭膜在室温下1小时，然后用嵌段稀释的第一抗体孵育2小时缓冲。第一抗体如下使用：抗人KDR / VEGFR2多克隆抗体（1：1000，Upstate）;抗人类Tie2多克隆抗体（1：1000，Santa Cruz）;和抗人类enos单克隆抗体（1：2000，BD Biosciences）。与第一抗体一起孵育后，用TBS-T缓冲液洗涤膜3次3次，然后用HRP缀合的抗小鼠或抗兔二抗孵育（Promega，稀释1：5000）1小时。如上用TBS-T缓冲液洗涤膜，并且通过ECL Western印迹检测试剂试剂盒（Amersham Biosciences），扫描和记录分子分析计划（Bio-rad Laboratories）。据/p> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>２.４.THP-1单核细胞与人EPCs共培养据/title> <p>早期或晚期EPC用0.05％胰蛋白酶/ 1 mm EDTA分离并播种据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mn> 2据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/孔进入6孔板。24小时培养，使EPCs牢固地附着在平板上。PBS洗一次EPCs后，THP-1单核细胞(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 4.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula> cells/well) were added. For all coculture and control culture experiments, RPMI 1640 medium with 10% FBS was used. Following culture for 24 hours, coculture conditioned medium (CM) with suspended THP-1 cells was transferred to a microtube followed by a centrifugation at 500 g for 5 minutes. The pelleted THP-1 cells were then used for total RNA extraction and the conditioned medium collected for detection of IL-1据italic> β据/italic>酶联免疫吸附试验(ELISA Kit)单独培养THP-1细胞作为对照。类似地，我们对HUVEC/THP-1细胞进行共培养，以检测HUVEC对IL-1基因表达的影响据italic> β据/italic>。检查整合素据italic> β据/italic>2在THP-1细胞中具有EPC调控晚期IL-1的作用据italic> β据/italic>表达，将THP-1细胞用整体素预孵育据italic> β据/italic>2块抗体（克隆TS1 / 18,10 据italic> μ.据/italic>如上所述，G / ml，Biolegend）1小时，然后加入到结后EPC中，如上所述。研究是否已故EPCS监管IL-1据italic> β据/italic>通过旁静脉途径的表达，将1ml晚期EPC CM加入到THP-1细胞培养物中，早期EPC CM用作对照。据/p> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。总RNA提取据/title> <p>根据制造商的说明，使用Mirneasy Mini Kit（Qiagen）从THP-1细胞中提取总RNA。简而言之，将细胞沉淀含量为700 据italic> μ.据/italic>L Qiazol裂解试剂和细胞裂解物混合200 据italic> μ.据/italic>L氯仿，12000 rpm离心15分钟。将含RNA的水相转移到无核酸酶管中，与1.5体积的100%乙醇混合。然后样品通过RNeasy迷你柱。RWT和RPE buffer洗涤后，用40据italic> μ.据/italic>L含有无核酸酶的水并用分光光度计（Biorad Laboratories）量化。据/p> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)据/title> <p>使用OMNIScript RT试剂盒（QIAGEN）通过逆转录（RT）产生第一链cDNA。RT反应，总体积为20 据italic> μ.据/italic>L，包含以下组件：1 据italic> μ.据/italic>g总RNA，2 据italic> μ.据/italic>l为5 mm dntps，5 据italic> μ.据/italic>l随机底漆（300ng / ml），2 据italic> μ.据/italic>L 10x反应缓冲液，1 据italic> μ.据/italic>L逆转录酶（4个单位），1 据italic> μ.据/italic>L RNase抑制剂（1单位）和无核酸酶DDH据sub>2据/sub>O(用于调节最终反应体积)。RT在37°C孵育1小时，然后在65°C灭活15分钟。对于实时PCR，总反应体积为20据italic> μ.据/italic>L是通过混合2得到的据italic> μ.据/italic>L产品，10 据italic> μ.据/italic>2倍SYBR Green PCR Master Mix的L，正反引物混合的200 nM，适量的无核酸酶ddH据sub>2据/sub>O.在下列阶段对7900 HT序列检测系统（Applied Biosysystem Inc.）进行实时PCR：阶段1：50℃，2分钟，第2阶段：95℃10分钟，第3阶段3：95°C为15秒，然后是62°C 1分钟。重复第3阶段40个循环。为每种反应设置了解离曲线以检查基因扩增的特异性。另外，为了消除基因组污染的检测，设计每个单独基因的引物被设计为跨越内含子。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内部对照和IL-1的相对mRNA水平据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>和tnf-据italic> α.据/italic>使用2定量为GAPDH标准化据sup>-ΔΔct据/sup>方法。引物序列如下：据list> <list-item> <label></label> </list-item> </list></p> <p>IL-1据italic> α.据/italic>(基因登录号:NM_000575.3)，据/p> <list-item> <label></label> <p>感觉5'-cctctcattgatcatctgtctct-3'和据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>反义5'-ctcaaccgtctcttttcagga -3';据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>IL-1据italic> β据/italic>（基因登录号：NM_000576），据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>感测5'-aacctcttcgaggcacaag-3'和据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>反义5'-gtttagggccatcagcttca-3';据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>肿瘤坏死因子-据italic> α.据/italic>（基因登录号：NM_000594），据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>感觉5'-cccaggcagtcagatcatcttc-3'和据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>反义5'-AGCTGCCCCTCAGCTTGA-3';据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>GAPDH（基因登录号：X02231），据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>感觉5'-ctctaaggctgtggg caaggtcat-3'和据/p> </list-item> <list-item> <label></label> <p>反义5“-GAGATCCACCACCCTGTTGCTGTA-3”。据/p> </list-item> <p></p> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。酶联免疫吸附试验（ELISA）据/title> <p>ELISA检测IL-1据italic> β据/italic>蛋白质水平在EPC / THP-1细胞共培养条件培养基中。高灵敏度人体IL-1据italic> β据/italic>具有最小可检测剂量<0.1pg / ml的ELISA套件是从R＆D系统获得的。ELISA程序是根据制造商的指示完成的。据/p> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。统计分析据/title> <p>数据表示为平均值（SEM）的平均值±标准误差。使用学生的统计学意义据italic> T.据/italic>-测试;据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>被认为具有统计学意义。据/p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3.结果据/title> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。人体EPC的分离与表征据/title> <p>半素纺锤形早期EPC在内皮选择性培养基-2-2-2中的PBMNC培养后出现（图据xref ref-type="fig" rid="fig1a"> 1（a）据/xref>)．在第2周左右，散发性细胞殖民地开始出现（图据xref ref-type="fig" rid="fig1b"> 1（b）据/xref>)．将这些菌落与胰蛋白酶/ EDTA分离，并进行细胞膨胀。鹅卵石形状的晚期EPC迅速增殖，而主轴形早期的EPC在第4周几乎完全脱颖而出（图据xref ref-type="fig" rid="fig1c"> 1（c）据/xref>)．流式细胞术分析证明了<1％的早期EPC表达了CD11B，单核细胞/巨噬细胞标记物（未示出的数据）。吸收稀释剂的抗折叠和粘合剂的结合表明，超过80％的早期EPC是DIL-AC-LDL / FITC-UEA-凝集素双阳性（图据xref ref-type="fig" rid="fig1d"> 1（d）据/xref>，吸收dilac - ldl的细胞呈红色。数字据xref ref-type="fig" rid="fig1e"> 1（e）据/xref>，FitC-UEA凝集素的细胞阳性出现绿色。数字据xref ref-type="fig" rid="fig1f"> 1（f）据/xref>那据xref ref-type="fig" rid="fig1d"> 1（d）据/xref>，和据xref ref-type="fig" rid="fig1e"> 1（e）据/xref>合并，橙色是双积极的）。Western Blotting分析表明，已故EPCS产生了一组内皮蛋白标志物，即KDR / VEGFR2，TIE2和ENOS（图据xref ref-type="fig" rid="fig1g"> 1（g）据/xref>那据xref ref-type="fig" rid="fig1h"> 1（h）据/xref>，和据xref ref-type="fig" rid="fig1i"> 1（i）据/xref>，resp。）与Huvecs的EPCS相对较低的Tie2水平相对较低，而其他2个蛋白质水平与在Huvecs中检测到的其他2份相当。据/p> <fig-group id="fig1"> <p>人体EPC的培养与表征。EPCS是通过EC生长培养基（EGM-2培养基）的PBMNC培养物产生的。纺锤形早期EPC在4-7天（a）时出现在培养物中。在第2周，形成（b）的散发细胞菌落，其被扩张以产生鹅卵石形后EPC（C）。早期EPC的特征是通过细胞吸收稀释剂（D）红）和FitC-uea凝集素（E）绿色的染色剂的细胞吸收。超过80％的早期EPC是DIL-AC-LDL / FITC-UEA凝集素双阳性（（F）橙）。晚期EPC表达了一系列EC蛋白标记物，即VEGFR2（G），TIE2（H）和ENOS（I），如蛋白质印迹所确定的。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）用作后期EPC的2个分离（EPC1和EPC2）的对照。据/p> <fig id="fig1a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001a"></graphic> </fig> <fig id="fig1b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001b"></graphic> </fig> <fig id="fig1c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001c"></graphic> </fig> <fig id="fig1d"> <label>（d）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001d"></graphic> </fig> <fig id="fig1e"> <label>（e）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001e"></graphic> </fig> <fig id="fig1f"> <label>（F）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001f"></graphic> </fig> <fig id="fig1g"> <label>（G）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001g"></graphic> </fig> <fig id="fig1h"> <label>（H）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001h"></graphic> </fig> <fig id="fig1i"> <label>（一世）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.001i"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。在晚期人体EPCS与晚期人物EPCS与晚期单核细胞中IL-1 <斜视>β/斜体>表达的上调据/title> <p>检查EPCS调节IL-1据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>和tnf-据italic> α.据/italic>单核细胞中的基因表达，人体THP-1单核细胞与早期或晚期人类的EPCS共同化。IL-1的mRNA水平据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>和tnf-据italic> α.据/italic>real-time RT-PCR检测THP-1细胞中的IL-1据italic> β据/italic>，通过高敏感性ELISA试剂盒（研发系统）进一步测量培养条件培养基中的蛋白质。结果表明IL-1没有显着差异据italic> β据/italic>单独培养的THP细胞与THP-1细胞之间的mRNA水平与早期EPCS共培养（图据xref ref-type="fig" rid="fig2a"> 2(一个)据/xref>)．然而，与后期EPC的共生导致IL-1的显着增加据italic> β据/italic>信使rna水平(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mn> 0.134据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 0.046据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)，而单独培养的THP-1细胞(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mn> 0.019据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 0.007据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0．01据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，数字据xref ref-type="fig" rid="fig2a"> 2(一个)据/xref>)．此外，增加了IL-1据italic> β据/italic>mRNA水平被升高的IL-1反映据italic> β据/italic>，通过ELISA试剂盒测定的共培养条件培养基中的蛋白质水平（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:mn> 0.257据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 0.223据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>pg/mL的THP-1细胞单独培养与据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:mn> 6.933据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 1.501据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula> pg/mL for THP-1 cells cocultured with late EPCs, Figure据xref ref-type="fig" rid="fig2b"> 2 (b)据/xref>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.005据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．IL-1无明显变化据italic> α.据/italic>或tnf-据italic> α.据/italic>mRNA水平随着早期或晚期或晚期或晚期或晚期的细胞共培养据xref ref-type="fig" rid="fig2c"> 2 (c)据/xref>和据xref ref-type="fig" rid="fig2d"> 2 (d)据/xref>)．我们进一步检查了终端差异化的Huvecs与晚期EPC的效果类似，发现与Huvecs的共生没有导致IL-1中的重要交替据italic> β据/italic>THP-1细胞中mRNA水平（图据xref ref-type="fig" rid="fig2e"> 2（e）据/xref>)．据/p> <fig-group id="fig2"> <p>晚期人类EPCs上调IL-1据italic> β据/italic>THP-1单核细胞的表达。与晚期而非早期EPCs共培养导致IL-1显著增加据italic> β据/italic>以GAPDH为内控，通过实时RT-PCR检测THP-1细胞的mRNA水平(a)。晚期EPCs/THP-1细胞共培养体系的条件培养基(CM)含有显著较高水平的IL-1据italic> β据/italic>通过高灵敏度ELISA试剂盒（B）测量的蛋白质。相反，早期和晚期EPCs均不影响IL-1据italic> α.据/italic>(c)和肿瘤坏死因子-据italic> α.据/italic>(d)与终末分化的HUVECs共培养未导致IL-1的变化据italic> β据/italic>THP-1细胞中mRNA水平（e）。*据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0．01据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>），**据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> 0.005据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)，两者都比较单独培养的THP-1细胞。eEPC:早期的EPC;LEPC：EPC末期。据/p> <fig id="fig2a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.002b"></graphic> </fig> <fig id="fig2c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.002c"></graphic> </fig> <fig id="fig2d"> <label>（d）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.002d"></graphic> </fig> <fig id="fig2e"> <label>（e）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.002e"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。在晚期通过旁静脉的方式通过晚期EPC，在THP-1细胞中上调IL-1 <斜视>β/斜体>表达据/title> <p>后期EPCS上调IL-1的机制据italic> β据/italic>进一步探索表达。添加晚期EPC CM至THP-1细胞培养（具有早期EPC CM作为对照）导致IL-1中等增加据italic> β据/italic>信使rna水平(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:mn> 0.057据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 0.014据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>）低于THP-1细胞/晚期EPC共培育（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:mn> 0.120据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 0.050据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)，但明显高于据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:mn> 0.020据/mml:mn> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> 0.004.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>IL-1据italic> β据/italic>用早期EPC CM治疗的THP-1细胞mRNA水平（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，数字据xref ref-type="fig" rid="fig3a"> 3（a）据/xref>），表明迟交EPCS提供了帕拉卡碱基效果。已经证明了整合素的激活据italic> β据/italic>2中嗜中性粒细胞增强IL-1据italic> β据/italic>表达式。THP-1细胞产生整合素据italic> β据/italic>2，我们检查了整合素据italic> β据/italic>2参与晚期EPC调控的IL-1据italic> β据/italic>表达式。用整体素预孵育THP-1细胞据italic> β据/italic>2阻断抗体不能消除IL-1的晚期EPC效应据italic> β据/italic>mRNA生产（图据xref ref-type="fig" rid="fig3b"> 3（b）据/xref>)．据/p> <fig-group id="fig3"> <p>晚期人类EPC增强IL-1据italic> β据/italic>表达通过旁静脉途径。将THP-1细胞在后期EPC条件培养基（CM）存在下培养，其早期EPC CM用作对照，然后是IL-1据italic> β据/italic>通过实时RT-PCR测定THP-1细胞中的mRNA水平。结果表明，晚期EPC CM能够部分升高IL-1据italic> β据/italic>mRNA水平(a)。THP-1细胞与抗整合素的阻断抗体预孵育据italic> β据/italic>2后与晚期EPCs共培养，但不能消除晚期EPCs刺激IL-1的作用据italic> β据/italic>mRNA增加（b）。*据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>），与用早期EPC CM处理的THP-1细胞相比。eEPC:早期的EPC;LEPC：EPC末期。据/p> <fig id="fig3a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.003a"></graphic> </fig> <fig id="fig3b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2013/859643.fig.003b"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4。讨论据/title> <p>在本研究中，我们检查了EPC对IL-1的影响据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>和tnf-据italic> α.据/italic>使用人EPC和单核细胞的共培养细胞的单核细胞中的表达。人类早期和晚期产卵通过内皮选择性培养基EGM-2中的PBMNC培养采购。稀释性的稀释度和Fitc-uea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-lea-凝集素的增生和Fitc-uea-lea-lea-percl-uea-lea-凝集素的双阳性，这与先前公布的数据一致[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21.据/xref>]．晚期EPC表达了重要的内皮蛋白标记，即KDR / VEGFR2，TiE2和eNOS，如蛋白质印迹所检测到的。当通过早期EPCS与早期EPCS共有聚集的THP-1单核细胞时，在THP-1细胞中没有3个细胞因子表达。相比之下，已故的EPCs显着上调IL-1据italic> β据/italic>在mRNA和蛋白水平表达，但不影响IL-1据italic> α.据/italic>或tnf-据italic> α.据/italic>表达式。IL-1的ELISA结果据italic> α.据/italic>或tnf-据italic> α.据/italic>蛋白分析(数据未显示)与mRNA数据一致。作为il - 1据italic> β据/italic>real-time RT-PCR几乎没有检测晚期EPCs的mRNA(数据未显示)，可能污染IL-1据italic> β据/italic>从晚期EPC的mRNA被排除在共养殖系统中。由于迟到的EPC表现出类似的形态，表面蛋白质标记表达和增殖能力作为体细胞ECS，我们检查了ECS对IL-1有何影响据italic> β据/italic>表达式。然而，与Huvecs的共生没有导致IL-1的变化据italic> β据/italic>在THP-1细胞中的表达。在这方面，已故EPC与Huvecs不同。据/p> <p>EPCS上调IL-1的机制据italic> β据/italic>进一步研究了THP-1细胞中的表达。Walzog等人。观察到整合素的激活据italic> β据/italic>2在人性化学粒细胞中导致IL-1的增强据italic> β据/italic>合成 [据xref ref-type="bibr" rid="B22"> 22.据/xref>]．有充分的文献证明THP-1细胞表达整合素据italic> β据/italic>2 [据xref ref-type="bibr" rid="B23"> 23.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B24"> 24.据/xref>]．我们探讨了整合素据italic> β据/italic>2参与了IL-1的调节据italic> β据/italic>在THP-1细胞中的表达。用整体素预孵育THP-1细胞据italic> β据/italic>2阻断抗体不能消除晚期EPCs对IL-1的影响据italic> β据/italic>MRNA生产，表明IL-1的调节据italic> β据/italic>后期EPCS的THP-1细胞中的表达与整合素无关据italic> β据/italic>2.当EPC CM晚期添加到THP-1细胞培养物中时，IL-1的适度增加3倍据italic> β据/italic>与早期EPC cm处理或未处理的细胞相比，检测mRNA水平，表明晚期EPCs上调IL-1据italic> β据/italic>部分生产通过旁静脉机制。据/p> <p>被认为是一种重要的炎症介质[据xref ref-type="bibr" rid="B25"> 25.据/xref>]，IL-1据italic> β据/italic>也被证明在血管生成和EPC功能调节中发挥重要作用[据xref ref-type="bibr" rid="B26"> 26.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B29"> 29.据/xref>]．使用Matrigel Plug测定，Voronov等人。观察到塞子的血管化存在于野生型小鼠中，但在IL-1中缺席据italic> β据/italic>敲门小鼠[据xref ref-type="bibr" rid="B26"> 26.据/xref>]，暗示IL-1的作用据italic> β据/italic>在血管生成。体外研究表明，用IL-1处理鼠EPCS据italic> β据/italic>增加EPC号码和IL-1据italic> β据/italic>与Matrigel涂层的菜肴中的培养后，与非生成的细胞相比，经过处理的EPC在培养后的培养基中形成显着更高数量的血管状结构[据xref ref-type="bibr" rid="B27"> 27.据/xref>]．杨等人。已经观察到，除了刺激EPC增殖，IL-1据italic> β据/italic>促进EPC迁移和粘附，并上调EPCs中VEGF-A的产生[据xref ref-type="bibr" rid="B28"> 28.据/xref>]．使用缺血后肢的小鼠模型，Amano等。据报道，IL-1中循环EPC的数量据italic> β据/italic>−/−小鼠在后肢缺血后明显低于野生型同鼠。IL-1在缺血肌肉中的EPC数量也显著减少据italic> β据/italic>- / - 小鼠[据xref ref-type="bibr" rid="B29"> 29.据/xref>]，表明IL-1的重要作用据italic> β据/italic>在缺血诱导的EPC动员和归巢中。增加IL-1据italic> β据/italic>正如我们在本研究中报道的，晚期EPCs诱导单核细胞产生，因此可能形成一个自我扩增的EPCs环路，这可能代表一种尚未确定的内源性机制，改善EPC招募和组织修复和再生所需的功能。据/p> </sec> <sec id="sec5"> <title>结论据/title> <p>总之，在人体EPC / THP-1单核细胞共培养系统中，晚期但不是早期EPCs上调IL-1据italic> β据/italic>在THP-1细胞中的表达，部分通过旁静脉途径。IL-1据italic> β据/italic>是一种重要的炎症介质，也已被证明促进EPCS增殖，迁移和粘附性。因此，我们的数据表明EPC可以通过与单核细胞相互作用来施加自我增强效果，并且EPC也可以通过调节IL-1来调节炎症反应据italic> β据/italic>单核细胞中的表达。据/p> </sec> <back> <ack> <title>利益冲突据/title> <p>提交人声明他们没有利益冲突。据/p> </ack> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1据/label> <nlm-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Asahara.据/surname> <given-names> T.据/given-names> </name> <name> <surname> Murohara.据/surname> <given-names> T.据/given-names> </name> <name> <surname> 沙利文据/surname> <given-names> 一种。据/given-names> </name> <name> <surname> 银据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> van der zee.据/surname> <given-names> R.据/given-names> </name> <name> <surname> 李据/surname> <given-names> T.据/given-names> </name> <name> <surname> Witzenbichler据/surname> <given-names> B.据/given-names> </name> <name> <surname> Schatteman.据/surname> <given-names> G。据/given-names> </name> <name> <surname> 伊纳人据/surname> <given-names> J. 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C。据/given-names> </name> <name> <surname> 希克林据/surname> <given-names> D. J.据/given-names> </name> <name> <surname> 诙谐据/surname> <given-names> L.据/given-names> </name> <name> <surname> 摩尔据/surname> <given-names> M. A. 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